§ 6. Особенности реализации генетической информации в про- и эукариотических клетках

§ 6. Особенности реализации генетической информации в про- и эукариотических клетках

Условно говоря, «работа гена» заключается в том, чтобы содержащаяся в гене наследственная информация была реализована. В общем смысле процесс ее реализации во всех клетках осуществляется посредством двух последовательных этапов - транскрипции и трансляции, в результате чего в клетке появляется белок, способный выполнять

конкретную функцию. Фактически вся жизнь клетки, да и любого живого организма в целом, протекает в зависимости от того, какие именно белки появляются на том или ином этапе жизни, и этот принцип существования является универсальным, то есть общим для всех живых существ. Однако, между организмами различных уровней организации, например, бактерией и человеком, имеются существенные для целей генетической инженерии отличия в реализации наследственной информации.

Исходя из особенностей строения и функционирования, клеток все живые организмы принято делить на две большие группы - надцарство Прокариоты и надцарство Эукариоты. Названия этих групп происходят от главного отличительного признака клеток таких организмов - наличия или отсутствия ядра в клетках. Поскольку ядро по-гречески - карион, не имеющие ядра клетки называют прокариотическими, то есть доядерными (функцию ядра у таких клеток выполняет находящаяся непосредственно в цитоплазме большая кольцевая молекула ДНК - нуклеоид, в которой и содержится основная наследственная информация). Организмы же, у которых основная наследственная информация сосредоточена в находящихся в ядре хромосомах, называют собственно ядерными, или эукариотическими. Вторая отличительная черта эукариот - это наличие внутри клетки различных специализированных структур (органоидов или органелл), таких как эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи, лизосомы, вакуоли, митохондрии, пластиды, центриоли, рибосомы. В прокариотических клетках из всего выше перечисленного присутствуют только рибосомы. И третье - структура генов, то есть содержащих информацию о белках фрагментов ДНК, у эукариот не такая, как у прокариотических организмов.

Для осуществления первого этапа реализации наследственной информации - транскрипции необходимо, чтобы осуществляющий синтез информационной РНК фермент РНК-полимераза (транскриптаза) присоединился к строго определенному участку ДНК перед началом той последовательности нуклеотидов, которая кодирует порядок аминокислот в белке. Это необходимо для того, чтобы построение соответствующей данному гену информационной РНК начиналось всегда с одного и того же нуклеотида, что следует из непрерывности генетического кода. Участок присоединения РНК-полимеразы называется промоторной областью гена или промотором, а определяющая собственно порядок аминокислот в белке область называется структурной частью гена. Наличие таких областей характерно как для прокариотических, так и для эукариотических генов, однако и промоторы и структурные части генов этих организмов имеют отличия.

В частности, в промоторах генов прокариот место присоединения РНК-полимеразы, представляющее собой последовательность нуклеотидов ТАТААТ (этот участок называется также Прибнов бокс по фамилии ученого, определившего эту последовательность), находится на расстоянии 10-ти нуклеотидов от начала структурной области гена. В то же время в генах эукариотических клеток обеспечивающая присоединение РНК-полимеразы последовательность - это не 6, а 4 нуклеотида ТАТА (так называемый Хогнесс бокс, т.е. открытый Хогнессом) и располагается она на расстоянии 25-ти нуклеотидов от точки начала транскрипции. Из этого следует, что гены эукариот в прокариотических клетках и, наоборот, гены прокариот в эукариотических не могут быть транскрибированы, а, следовательно, закодированная в них информация не сможет реализоваться в виде белковой молекулы. Это препятствие в функционировании гена внутри чужеродной для него клетки генетическая инженерия научилась преодолевать. Теперь, чтобы сделать ген прокариотического организма (например, бактерии) работающим в клетках эукариот (например, клетках растений) с помощью рестрикции и последующего лигирования объединяют промотор какого-либо эукариотического гена и структурную часть прокариотического. Такая генетическая конструкция или «гибридный ген» будет транскрибироваться эукариотической РНК- полимеразой, то есть «работать» в эукариотической клетке.

Подобным образом создаются и генетические конструкции, способные функционировать в клетках прокариот. Например, если структурную часть гена инсулина человека объединить с промотором какого-либо бактериального гена и ввести такую последовательность ДНК в способную реплицироваться в клетках бактерий плазмиду- вектор, то такие бактерии будут синтезировать человеческий гормон, необходимый для помощи страдающим диабетом людям.

Однако, на пути создания способных «работать» в прокариотических клетках генов эукариот имеется еще одно препятствие. Дело в том, что значительная часть эукариотических генов имеет прерывистую структуру, то есть состоит из чередующихся участков - интронов и экзонов (рис.2). Экзоны представляют собой кодирующие области гена, в них содержится информация о порядке аминокислот в соответствующем этому гену белке, тогда как интроны этой информации не содержат. Образующаяся при транскрипции таких генов РНК (так называемый первичный транскрипт) в клетках эукариот обязательно подвергается особому воздействию, получившему название сплайсинг (от англ. splice - сцепление). Суть сплайсинга заключается в удалении из первичного транскрипта участков, комплементарных интронам, и соединении
соответствующих экзонам участков, причем так, чтобы при трансляции получался соответствующий гену белок. Наличие у эукариот такого процесса позволяет им с одного гена получать несколько пригодных для трансляции зрелых матричных РНК, поскольку вырезание разных участков при сплайсинге дает разное сочетание последовательностей. У прокариотических организмов таких генов нет, поэтому нет и специальных ферментов, осуществляющих процесс сплайсинга. Это и создает проблему при клонировании имеющих экзонно-интронную структуру генов в клетках бактерий - на рибосомах в таком случае транслируется первичный транскрипт и, следовательно, получается не такой белок, как в эукариотических клетках.

 

Экзон 1

Интрон

Экзон 2

Интрон

Экзон 3

Транскрипция

Первичный

транскрипт

 

Сплайсинг

 

	Зрелая матричная РНК
			Экзон		Экзон 2		Экзон 3

 

Трансляция

Функциональный белок

Рис. 2. Схема «работы» имеющего прерывистую структуру гена эукариот. Буквой «П» обозначена промоторная область гена.

Однако и эту проблему генным инженерам удалось решить. Здесь помогло открытие еще одного фермента - обратной транскриптазы (ревертазы). Этот фермент был

обнаружен у особых вирусов, генетическая информация которых заключена в молекуле РНК, а не ДНК.

Вирусы являются особой неклеточной формой живых существ, паразитирующих в клетках других организмов. Они представляют собой одну или несколько молекул нуклеиновой кислоты, заключенных в белковую оболочку, которая называется капсид. Способ существования вирусов заключается в следующем. Вирусная частица проникает в клетку организма, являющегося для этого вида вирусов хозяином, после чего капсид вируса разрушается, а закодированная в нуклеиновой кислоте вируса генетическая информация реализуется. Результатом этого является перестройка жизнедеятельности клеток хозяина - они начинают синтезировать не свои, а вирусные белки и нуклеиновые кислоты, и через некоторое время внутри каждой инфицированной вирусом клетки формируется несколько сотен новых вирусов. Далее эти вирусы освобождаются из клетки либо путем ее разрушения, либо путем отпочковывания от ее поверхности и проникают в новые клетки этого же организма.

В тех случаях, когда нуклеиновой кислотой вируса является ДНК, описанный путь размножения вируса начинается сразу же после освобождения ДНК из капсида. У РНК- содержащих вирусов этому процессу обязательно предшествует еще один - на нити вышедшей из капсида РНК строится комплементарная ей нить ДНК, которая затем достраивается до обычной двунитевой молекулы. И далее уже с этой двунитевой ДНК осуществляется транскрипция, и тем самым запускается процесс размножения вируса. Такой процесс синтеза ДНК на матрице РНК осуществляется за счет имеющихся в капсидах РНК-содержащих вирусов молекул фермента, называемого РНК-зависимая ДНК-полимераза. Поскольку построение ДНК на матрице РНК по сути своей является противоположным транскрипции процессом, этот фермент и называют обратная транскриптаза или коротко - ревертаза.

Как и другие ферменты, обратная транскриптаза способна проявлять свою каталитическую активность in vitro, поэтому в генетической инженерии для клонирования имеющих экзонно-интронную структуру генов эукариот поступают следующим образом. Сначала из клеток выделяют зрелую матричную РНК, появляющуюся в клетке при функционировании выбранного для клонирования гена. Как вы уже знаете, такая РНК содержит только соответствующие экзонам нуклеотиды, то есть фактически кодирует аминокислотную последовательность нужного белка. Затем с помощью обратной транскриптазы проводят реакцию синтеза ДНК на матрице этой РНК. Полученные таким образом молекулы (их принято называть комплементарными ДНК или сокращенно кДНК) объединяют с промотром какого-нибудь прокариотического гена и вводят путем лигирования в состав плазмиды-вектора по уже знакомой вам схеме. После трансформации такой векторной ДНК бактерий в их клетках будет продуцироваться эукариотический белок.

Вопросы к § 6. 1. Зачем нужны промоторные области в генах? 2. Чем отличаются промоторы про- и эукариотических генов? 3. Чем отличаются структурные части про- и эукариотических генов? 4. Почему при клонировании некоторых генов эукариот приходится использовать обратную транскриптазу? 5. Что такое кДНК?