§ 8. Особенности методического арсенала современной генетической инженерии.
Современные векторы, улучшенные варианты отбора клонов, электропорация
Вы уже знакомы с основным принципом клонирования генов и отбора клонов бактерий, обладающих направленно введенной генетической информацией. Описанный в параграфе 5 вариант клонирования с помощью плазмиды pBR322 занимает несколько дней, поскольку основан на первоначальном отборе любых плазмидсодержащих клонов и затем уже поиске среди них клонов, имеющих плазмиду со вставкой. В настоящее время разработаны походы, при которых уже при первом выращивании колоний можно отобрать среди них нужные.
Один из примеров такого подхода является использование в качестве вектора для клонирования плазмид из серии pUC. Эти плазмиды предназначены для клонирования генов в клетках Escherichia coli, но необходимо использовать особые штаммы этих бактерий, у которых удалена из хромосомной ДНК часть лактозного оперона.
Лактозный оперон - это группа генов, кодирующих белки, необходимые для использования бактериями содержащегося в молоке млекопитающих углевода - лактозы. Лактоза представляет собой дисахарид, состоящий из остатков глюкозы и галактозы, и для того, чтобы питаться лактозой, бактериям необходимо сначала разделить эту молекулу на ее составляющие. Сделать это может специальный фермент, который называется Р- галактозидаза. Аминокислотная последовательность этого фермента кодируется геном lacZ, который входит в лактозный оперон наряду с генами lacY и lacA.
Главная особенность оперонной структуры в организации генетической информации заключается в следующем. Вы уже знаете из параграфа 6, что гены имеют так называемые промоторные области, без которых невозможна транскрипция. Но у бактерий, которые имеют минимум генетической информации (см. параграф 5), не все гены обладают собственным промотором. Наоборот - большинство прокариотических генов собраны в группы и расположены в этих группах так, что их структурные части фактически примыкают друг к другу. При этом у первого гена в каждой такой группе есть промотор, а вот терминатор транскрипции (последовательность нуклеотидов, которая обеспечивает отделение РНК-полимераза от ДНК) есть только у последнего гена. Поэтому если транскрипция начинается, то получается так называемая полицистронная мРНК, в которой содержится информация сразу о нескольких белках. Эти белки, как правило, нужны для выполнения одной, но жизненно необходимой в данных условиях функции. Например, в лактозном опероне первый ген (lacZ) кодирует Р-галактозидазу, второй (lacY)
Р-галактозидпермеазу, а третий ген (lacA) - Р-галактозид-трансацетилазу. Все эти белки появляются в клетке тогда, когда необходимо питаться лактозой, и отсутствуют тогда, когда в окружающей среде лактозы нет. Таким путем бактериальная клетка «экономит» внутриклеточное пространство и материальные ресурсы, в частности молекулы АТФ и аминокислоты, из которых строятся белки.
Но особенно важно, что транскрипция собранных в один оперон генов может включаться именно тогда, когда это действительно необходимо. Работа различных оперонов регулируется разными путями, но один из путей регуляции активности лактозного оперона использован в плазмидах серии pUC. Как уже указывалось выше, при отсутствии лактозы в окружающей клетку среде транскрипция с промотора lacP не происходит. Это связано с тем, что в промоторной области лактозного оперона между местом прикрепления РНК-полимеразы и первым нуклеотидом структурной части гена Р- галактозидазы имеется специальный участок, получивший название оператор и обозначаемый lacO. К этому участку может присоединяться специальный белок LacI, кодируемый отдельным, не входящим в лактозный оперон геном lacI. Этот ген находится рядом с лактозным опероном, но имеет свой собственный промотор. Четыре молекулы (тетрамер) белка LacI, присоединенные к оператору, препятствуют транскрипции за счет того, что на пути движущейся по молекуле ДНК РНК-полимеразы возникает механическое препятствие. Таким путем подавляется (репрессируется) активная работа лактозного оперона, поэтому белок LacI назвали белок-репрессор.
Для того, чтобы лактозный оперон перешел в активное состояние, необходимо отсоединение тетрамера LacI от оператора. Это происходит при взаимодействии с белком- репрессором углеводных молекул, относящихся, как и лактоза, к Р-галактозидам. Более того, если молекула репрессора связана с Р-галактозидом, она уже не может присоединяться к ДНК. Фактически, лактоза и схожие с ней по химической природе молекулы обеспечивают включение лактозного оперона в работу (индуцируют его активность), поэтому их называют индукторами. В свою очередь, опероны, которые переходят в активное состояние только при наличии индуктора, называют индуцибельными оперонами.
Для бактериальной клетки это очень хороший путь регуляции - сама лактоза, которой можно питаться, включает в клетке систему, которая для этого питания нужна. Пока лактозы много, все вновь образующиеся молекулы белка-репрессора LacI (а ген lacI, имея собственный промотор, активен постоянно) связываются с ней и, следовательно, не могут связаться с оператором лактозного оперона, Когда все молекулы лактозы будут использованы для питания, новые молекулы репрессора останутся без нее, присоединяться к оператору, и лактозный оперон выключиться. И правильно, зачем синтезировать те белки, которые сейчас не нужны?
Вот теперь, когда вы уже знаете про этот путь (кстати, лишь один из нескольких из уже открытых путей регуляции жизнедеятельности клетки), можно посмотреть, как его использовали в генетической инженерии.
При создании плазмид серии pUC в стандартную маленькую плазмиду, обладающую точкой начала репликации и геном устойчивости к ампициллину, встроили фрагмент хромосомной ДНК Escherichia coli. В этом фрагменте имеется ген lacI с собственным промотором, промотр лактозного оперона lacP, оператор и часть структурной последовательности гена lacZ. Важно подчеркнуть, что для целей генетической инженерии этот фрагмент немного изменили (модифицировали). Модификация заключалось в том, что между оператором и началом структурного гена вставили короткую последовательность, содержащую сайты узнавания для 14 рестриктаз (EcoRI, SacI, KpnI, XmaI, Smal, BamHI, Xbal, Sail, HincII, AccI, PstI, BspMI, SphI, HindIII). Такие последовательности в генетической инженерии и молекулярной биологии называют полилинкерами и их существует в настоящее время несколько разновидностей, отличающихся набором сайтов для рестриктаз. Необходимость использования разных полилинкеров при создании плазмид-векторов различного назначения объясняется тем, что во всей остальной части плазмиды не должно быть таких же сайтов, как в полилинкере. Говоря по-другому, все входящие в полилинкер сайты для рестиктаз должны быть в ДНК этой плазмиды-вектора единственными (уникальными). Только в этом случае клонируемый фрагмент будет встраиваться туда, куда надо. И еще одна важная особенность - наличие полилинкера в этом месте фрагмента не влияет на обычный характер работы лактозного оперона.
Первые этапы клонирования с использованием векторов pUC ничем не отличаются от обычных. ДНК, являющуюся источником клонируемого фрагмента, и ДНК плазмиды pUC обрабатывают одной из перечисленных выше 14-ти рестриктаз. Затем полученные рестрикты смешивают, проводят лигирование и трансформацию клеток специального штамма Escherichia coli из серии XL-Blue, у которых в хромосомной ДНК отсутствует находящийся в плазмиде фрагмент лактозного оперона.
После трансформации бактерии высевают на плотную питательную среду, содержащую 1) антибиотик ампициллин, 2) изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид
(сокращенно ИПТГ), 3) 5-бром-4-хлор-3-индолил- P-D-галактопиранозид (сокращенно X- Gal). Каждый из этих компонентов среды имеет свое назначение.
Ампициллин обеспечивает размножение только тех клеток, которые в результате трансформации получили плазмиду.
ИПТГ проникает в плазмидосодержащие клетки и, будучи Р-галактозидом, взаимодействует с белком-репрессором Lad, что приводит к отсоединению репрессора от оператора. В результате этого начинается транскрипция находящегося на плазмиде фрагмента лактозного оперона и в клетках появляется фермент Р-галактозидаза. Говоря коротко, ИПТГ - это индуктор для лактозного оперона, причем на среде с ИПТГ лактозный оперон «включается» в несколько раз быстрее, чем на среде с лактозой. И еще важно, что этот Р-галактозид, в отличие от лактозы, Р-галактозидазой не расщепляется, и, следовательно, лактозный оперон на такой среде все время будет находиться в дерепрессированном состоянии.
Х-Оа1 же, в отличие от ИПТГ, является субстратом для Р-галактозидазы, но при воздействии на него этого фермента он из бесцветного вещества превращается в вещество голубого цвета, которое дальше клетками не используется. Поэтому продуцирующие Р- галактозидазу клетки образуют на этой среде голубые колонии.
А теперь самое важное: если при лигировании между промотором и началом структурной части гена Р-галактозидазы (а именно здесь, как вы помните, и находится полилинкер!) встроился клонируемый отрезок ДНК, в трансформированных клетках не появляется Р-галактозидаза. А это значит, что вещество голубого цвета в клетках не образуется, и колонии, клетки которых имеют плазмиду со встроенным геном, будут не голубыми, а белыми. То есть сразу же, при первом высеве трансформированных клеток, вы легко отличаете нужные колонии от ненужных! Именно поэтому векторы серии рис получили в настоящее время наиболее широкое распространение.
Входящие в серию варианты плазмид отличаются друг от друга либо полилинкерами, либо генами антибиотикорезистентности, что дает возможность клонировать очень широкий спектр фрагментов ДНК из различных организмов. ДНК всех этих вариантов; штаммы бактерий, предназначенные для использования конкретного варианта; соответствующие антибиотики, Х-Оа1 и ИПТГ производятся и продаются
специализированными фирмами. Это дает возможность в настоящее время проводить клонирование и последующие этапы генно-инженерных работ с меньшими затратами времени и большей эффективностью, чем в 90-х годах 20-го века.
Улучшились также и методы введения нужных молекул ДНК в клетки. В отдельных случаях именно этап трансформации клеток бактерий, грибов, растений или трансфекции клеток животных являлся камнем преткновения в молекулярно-биологических и генноинженерных исследованиях. В настоящее время эффективность этого этапа значительно повышена в результате разработки и применения так называемой электропорации. Суть этого приема заключается в применении кратковременного, длящегося миллисекунды воздействия постоянного электрического тока на клетки, находящиеся в растворе молекул ДНК. Считается, что электрический импульс вызывает образование в мембранах клеток существующих мгновения пор, что и позволяет довольно крупным молекулам ДНК проникать в цитоплазму, после чего мембрана восстанавливает свое прежнее состояние. Несмотря на то, что часть клеток при таком воздействии гибнет, выжившие клетки практически все оказываются трансформированными.
Работающим над усовершенствованием метода электропорации молекулярным биологам, физикам и инженерам удалось подобрать оптимальные условия подготовки клеток, режимы воздействия тока и сконструировать соответствующие приборы (электропораторы) для работы с клетками различных организмов. Поэтому в настоящее время имеется возможность вводить молекулы ДНК практически в любые клетки.
Вопросы к § 8. 1. Что такое оперон и как он организован? 2. Что такое оператор и зачем он нужен в опероне? 3. Какие опероны называют индуцибельными? 4. Фрагмент какого оперона использован в плазмидах серии pUC? 5. Какие вещества и зачем добавляют в питательную среду при использовании плазмид серии pUC? 6. Что такое полилинкер? 7. Что такое электропорация и для чего она нужна?