загрузка...
 
§ 15. Возможности применения генно-инженерных методов к животным.
Повернутись до змісту

§ 15. Возможности применения генно-инженерных методов к животным.

Использование культур клеток насекомых

Несмотря на то, что животные представляют собой гораздо более сложноустроенные организмы, чем бактерии, грибы или растения, в настоящее время уже существуют реальные возможности направленного изменения их генетической информации.

Одна из сложностей генно-инженерных манипуляций с клетками животных заключается в невозможности использования плазмидных векторов для введения ДНК в клетки животных. Однако во второй половине 20-го века, благодаря успехам вирусологии и молекулярной биологии, стало понятно, что в качестве векторных молекул могут быть использованы нуклеиновые кислоты вирусов животных. Более того, совершенствование методик поддержания и даже размножения отдельных клеток животных на искусственных питательных средах, то есть создания так называемых культур клеток, позволило реально приступить к разработке специальных векторных систем на основе вирусов.

Одним из примеров использования вирусов для введения и экспрессии чужеродной генетической информации является генно-инженерное применение бакуловирусов. Эти вирусы с середины 20-го века используются для биологического контроля за численностью насекомых-вредителей в лесном и сельском хозяйстве. Механизм их репродукции в организмах членистоногих достаточно хорошо исследован и заключается в следующем. После попадания вириона бакуловирусов в клетку эпителия кишечника насекомого, он проникает в ядро, где и происходит так называемое «раздевание», т.е. освобождение двунитевой ДНК из белкового капсида. В ядре происходит репликация этой ДНК, затем экспрессия генов, кодирующих белки собственно вирионов, и образование новых вирусных частиц. Некоторая часть вновь образовавшихся вирионов отшнуровывается от клеток и гемолимфой насекомого разносится по организму животного, но большая часть собирается в компактную структуру внутри клетки и покрывается специальной оболочкой, состоящей в основном из белка полиэдрина, т. е. переходит в неактивное состояние. За счет активных вирусов, распространяющихся по организму, постепенно происходит накопление таких полиэдриновых частиц во многих клетках организма насекомого и через 5-6 дней после заражения насекомое погибает. Считается, что за это время происходит 10 раундов репликации вирусных частиц в каждой инфицированной клетке и в теле мертвого насекомого доля содержащих множество вирионов полиэдриновых частиц достигает 25% от сухой массы. Такие полиэдриновые комплексы могут длительное время сохраняться в окружающей среде, пока не будут съедены следующим насекомым. В кишечнике насекомого полиэдриновый матрикс распадается под действием протеаз, и освободившиеся вирионы поражают клетки кишечника.

Эти особенности жизненного цикла бакуловирусов и привлекли к ним внимание генных инженеров. Длительность присутствия вируса в клетках и синтез большого количества белка давал основания для введения в его геном структурных генов чужеродных белков под промотор гена полиэдрина. ДНК бакуловирусов в последней четверти 20-го века была расклонирована в системе E.coli и определена функция основных генов. Было установлено, что цикл развития вируса не нарушается, если из генома удалить структурный ген полиэдрина, т.е. репродукция вирусных ДНК продолжается в обычном порядке, хотя полиэдронов (содержащих вирионы кристалов из полиэдрина) не образуется. Кроме того, оказалось, что промотор гена полиэдрина является очень сильным и работающим конститутивно. Основным видом вируса, на котором проводятся все исследования генно-инженерного направления, является вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (сокращенно AcMNPV). В природе он поражает более 30 видов насекомых и, что более важно, хорошо репродуцируется в культурах клеток.

Удачным оказалось и то, что оказалось возможным нарабатывать ДНК вируса в клетках бактерий Escherichia coli. В результате специально проведенных экспериментов были получены вирусные ДНК, в которых вместо гена полиэдрина встроен фрагмент,

содержащий: 1) точку начала репликации из плазмиды pBR322; 2) ген устойчивости к канамицину;   3) фрагмент гена lacZ, в который встроен сайт интеграции для

транспозируемого фрагмента (наличие этого сайта не препятствует нормальной экспрессии гена lacZ’). Такая генетическая конструкция может реплицироваться в клетках бактерий как плазмида, но поскольку несет практически весь (за исключением гена полиэдрина) геном бакуловируса, ее назвали бакмида. ДНК бакмиды инфекциозна также, как и ДНК собственно бакуловируса - если такой ДНК обработать клетки чувствительного к вирусу насекомого, в клетках происходит репродукция вируса, но без образования полиэдриновых скоплений.

Именно бакмиды в настоящее время наиболее широко используют для введения различных генов в клетки насекомых. Особенность применения бакмид состоит в том, что из-за довольно больших размеров осуществлять встраивание в них нужного гена путем рестрикции и последующего лигирования затруднительно. Для того, чтобы преодолеть эту трудность в последовательность гена lacZ’ встроили не обычный полилинкер, а сайт для транспозируемого фрагмента. Это позволяет делать вставку нужного гена в клетках E. coli за счет особого процесса - транспозиции.

Транспозиция - это перенос определенных фрагментов ДНК из одного места в другое в пределах одной молекулы или из одной молекулы ДНК в другую. Этот процесс естественным образом происходит в клетках бактерий, его открыли и изучили в 70-х годах 20-го столетия. Суть его заключается в следующем. Если в пределах небольшого, включающего несколько генов, участка ДНК имеются так называемые повторы (одинаковые по нуклеотидному составу последовательности), под воздействием определенного фермента, получившего название транспозаза, этот участок может вырезаться из исходной молекулы и вставляться в другое место. Такие окаймленные повторами гены, способные перемещаться из одной молекулы в другую, называются транспозоны, и к настоящему времени их уже открыто большое количество у различных видов бактерий. Это позволяет считать, что перемещение транспозонов из хромосом в плазмиды, перенос их вместе с плазмидами от одних бактерий к другим является одним из природных путей повышения генетического разнообразия прокариотических организмов.

Изучение процесса перемещения транспозонов показало, что для проявления активности транспозазы не имеет значения, какие гены находятся между повторами. Это и использовали для создания системы «загрузки» бакмид нужными генами. В эту систему кроме собственно бакмиды входят еще две плазмиды, способные поддерживаться в клетках Escherichia coli. Одна из них имеет ген устойчивости к антибиотику гентамицину и расположенный недалеко от него полилинкер, вплотную к которому слева примыкает промотор гена полиэдрина, а справа - терминатор этого же гена. Этот фрагмент плазмиды, в свою очередь, окаймлен слева и справа повторами, необходимыми для транспозиции, то есть фактически представляет собой искусственно созданный транспозон. Вне пределов транспозона на этой же плазмиде располагается ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Именно эту плазмиду используют для вставки путем рестрикции и лигирования гена, который необходимо ввести в клетки насекомых, поэтому ее условно называют плазмида-донор.

Вторая же плазмида несет на себе ген транспозазы и ген устойчивости к антибиотику тетрациклину. Ее называют плазмида-помощница и вот почему. Для «загрузки» бакмиды нужным геном ее совмещают в одной клетке с двумя этими плазмидами. Делают это путем трансформации клеток с бакмидами смесью ДНК плазмиды-помощницы и ДНК плазмиды-донора, в которой в искусственном транспозоне уже находится предназначенный для загрузки ген. После высева на среду, содержащую одновременно канамицин, ампициллин и тетрациклин, колонии на ней сформируют только те бактерии, в которых имеются все три плазмиды. Если такие бактерии перенести в жидкую среду и дать им размножиться, то в их клетках будет происходить перенос искусственного транспозона (транспозиция) благодаря активности транспозазы, ген которой находится на плазмиде-помощнице.

Важно, что этот искусственный транспозон будет переноситься не только куда попало, но и в бакмиду, в которой, как вы помните, находится сайт интеграции транспозона в пределах последовательности гена 1ае2’. Теперь, чтобы отобрать клетки, в которых транспозиция произошла именно в это место, бактерии надо высеять на плотную среду, в которой содержатся одновременно антибиотик канамицин, антибиотик гентамицин и уже известные вам из параграфа 8 ИПТГ и Х-Оа1.На этой среде колонии бактерий, в которых транспозиция произошла куда надо, будут иметь белый, а не голубой цвет.

Далее бактерии из такой колонии размножают, выделяют из них ДНК бакмиды и обрабатывают этой ДНК клетки насекомых. В генно-инженерных манипуляциях с клетками животных этот этап традиционно называют не трансформацией, а трансфекцией. Связано это с тем, что термин трансформация еще до появления генетической инженерии уже использовался в медицине для обозначения превращения обычных клеток в раковые, например «...в результате злокачественной трансформации клеток печени...». Имеющийся в составе бакмиды чужеродный ген будет экспрессироваться в клетках насекомых, потому что, как вы помните, он был вставлен между промотором и терминатором гена полиэдрина.

Разработка вот такой бакмидной системы введения генов позволила экспериментально проверить возможность экспрессии более 500 генов. Практическое применение культур клеток насекомых для наработки того или иного белка определяется сравнением эффективности его продукции и необходимого уровня функциональной активности с таковыми, характерными для белков, полученных в других трансгенных системах, например в дрожжах. Наиболее часто такие культуры используются для получения белков возбудителей вирусных болезней человека и животных, например, антигена вируса синего языка, антигена вируса Денге типа I, белка оболочки вируса иммунодефицита человека первого типа, капсидного белка вируса простого герпеса, гемагглютинина вируса гриппа, белка вируса Ласса, белков полиовирусов, гликопротеина вируса бешенства, гликопртеина 50 вируса псевдобешенства, антигена ротавируса обезьян. Это обусловлено тем, что пострансляционные модификации белков таких вирусов в норме определяются системами, характерными для клеток животных, которые могут отсутствовать в клетках других организмов. Кроме имеющих потенциальное вакцинное применение вирусных белков экспрессированы в клетках насекомых ген одного из белков малярийного плазмодия, ген одного из антигенов возбудителя сибирской язвы. Показана также возможность применения клеток насекомых для получения белков человека, имеющих отношение к ряду наследственных патологий: регулятора проницаемости мембран, дефект которого приводит к муковисцидозу; аденозиндезаминазы (ее дефектность приводит к связанному с обменом пуринов Т- и В-клеточному иммунодефициту), липазы поджелудочной железы человека; щелочной фосфатазы (снижение ее количества имеет место при гипотиреозе и при замедленном росте у детей), или белков имеющих различное терапевтическое применение: а- и Р-интерферонов; интерлейкина-2; эритропоэтина. Из белков, не связанных с возможностью медицинского применения, можно упомянуть мышиные моноклональные антитела, ДНК-полимеразу человека а и другие белки человека, получаемые для изучения их структуры и функции (например, белки различных рецепторов, выделение которых из организма в достаточных для изучения количествах затруднительно).

Вопросы к § 15. 1. Почему бакуловирусы оказались пригодными для генно-инженерной работы с клетками животных? 2. Что такое бактериальные транспозоны и каково их значение для жизни и эволюции бактерий? 3. Что такое бакмида? 4. Зачем при получении векторов для трансфекции клеток насекомых нужны ИПТГ и Х-ва1? 5. Подумайте, чем клетки насекомых лучше и чем хуже в качестве продуцентов белков человека по сравнению с дрожжевыми клетками.



загрузка...