Помимо методов генно-инженерных манипуляций с культурами клеток насекомых в конце 20-го века были разработаны подобные методы и для культур клеток млекопитающих. Связано это с давно имеющим место повышенным интересом исследователей к медицинским, ветеринарным и другим животноводческим проблемам. Кроме того, как указывалось выше, некоторые белки позвоночных животных и человека не экспрессируются в полной мере в гетерологичном генетическом окружении из-за отсутствия тех или иных систем их посттрансляционной модификации.
Векторы для введения чужеродной генетической информации разрабатывались по уже известному вам принципу, предполагающему осуществление основных подготовительных манипуляций и наработку гибридных ДНК в системе Е.соН , поэтому включают все те же фрагменты: тот или иной полилинкер, ген ампициллинустойчивости и опУ из рВЯ322. Еще одним необходимым компонентом таких векторов является фрагмент, обеспечивающий отбор трансфецированных клеток млекопитающего (селективный маркер).
В качестве таковых наиболее часто используются несколько: 1) поставленный под тот или иной обеспечивающий транскрипцию в клетках конкретного вида животных промотор ген неомицинфосфотрансферазы из бактериальных транспозонов. Его применение оказалось возможным потому, что нечувствительные к канамицину клетки млекопитающих чувствительны к генетицину, известному как соединение 0-418. Это блокирующее трансляцию на эукариотических рибосомах вещество инактивируется неомицинфосфотрансферазой за счет фосфорилирования, поэтому синтезирующие этот фермент клетки выживают. 2) ген дегидрофолатредуктазы (ВНРЯ), обеспечивающей разрушение токсичного для клеток метотрексата (Это вещество - его химическое название 4-Амино-Ш0-метилптероилглутаминовая кислота - тормозит синтез ДНК и приводит к остановке митоза, поэтому его используют для лечения раковых заболеваний). Поскольку нормальные клетки млекопитающих также продуцируют этот фермент, векторы с таким селективным геном используют только для трансфекции специальных ВИЕЯ" - клеточных линий. Существенно, что уровень устойчивости к метотрексату зависит от числа копий гена, поэтому, повышая концентрацию этого вещества в среде, можно отобрать такие клетки, в которых количество копий вектора (а значит, и копий веденного на нем чужеродного гена) наиболее высокое. 3) ген глутаминсинтетазы, которая присоединяет ионы NH4+ к аминокислотам, тем самым участвуя как в синтезе аминокислот, так и в освобождении некоторых тканей и органов (в частности, мозга у человека) от образующегося там аммиака. Поэтому этот фермент всегда имеется в клетках млекопитающих, но при попадании в клетки токсичных производных аминокислот его может не хватать для их обезвреживания. Одним из таких токсичных соединений является метионинсульфоксимин. Если его добавлять в среду культивирования клеток, выживать на ней будут лишь те, у которых имеет место сверхэкспрессия гена глутаминсинтазы, т.е. клетки несущие много копий вектора.
И последним обязательным компонентом вектора должен быть фрагмент, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках животных. В качестве таковых здесь используются гены различных вирусов млекопитающих, таких как ретровирусы, вирусы простого герпеса, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы.
Основой для получения ретровирусных векторов являются ретровирусы мыши. Их геном состоит из двух одинаковых одноцепочечных молекул РНК, которая функционально разделена на шесть областей: 1) 5’-LTR (long terminal repeat) - правый длинный концевой повтор; 2) не кодирующую белков, но ответственную за упаковку РНК в капсид область пси+ (у+); 3) кодирующую три белка внутренней оболочки капсида (gag);
кодирующую обратную транскриптазу и интегразу (pol); 5) кодирующую белок оболочки (env); 6) 3’-LTR - левый длинный концевой повтор.
Жизненный цикл вируса заключается в синтезе комплементарной ДНК на матрице геномной РНК сразу же после проникновения вириона и разрушения его капсида. Это возможно потому, что в капсиде вируса уже содержится несколько молекул обратной транскриптазы, упакованных в него еще при сборке вириона. Затем кДНК транспортируется в ядро, где встраивается в определенные сайты хромосом благодаря имеющимся в ее последовательности концевым повторам. После встраивания с сильного промотора, локализованного в 5’-LTR, осуществляется транскрипция, и вновь синтезированные РНК перемещаются в цитоплазму, где в результате трансляции появляются белки Gag, Pol и Env. При этом часть молекул РНК не транслируется, а упаковывается в формирующиеся капсиды вместе с молекулами обратной транскриптазы. Сформированные вирионы освобождаются из клетки-хозяина и могут в дальнейшем инфицировать новые клетки.
Наличие ДНК-стадии в жизненном цикле ретровирусов делает возможным осуществление всех генно-инженерных манипуляций на уровне ДНК, поскольку и она оказывается инфекциозной. Для создания ретровирусных векторов кДНК генома вируса объединили с ДНК стандартной плазмиды pBR322 E.coli и получили «обезоруженные» укороченные варианты, лишенные областей env, pol и части области gag. Вставку ДНК чужеродного гена осуществляют в стык с оставшейся частью области gag, что делает возможной транскрипцию этой ДНК в клетке животного с вирусного промотора, локализованного в 5’-LTR. Чужеродный ген (или несколько генов) могут иметь и свои пригодные для экспрессии в клетках млекопитающих промоторы. ДНК такого гибридного вируса можно непосредственно вводить в клетки кальциевым методом или электропорацией, но эффективность перемещения ее в ядро и интеграции в хромосомы хозяина является невысокой по сравнению с таковой нормального вируса. Учитывая это, была разработана система упаковки гибридных вирусных молекул в капсиды.
Для этого используют специальную линию клеток мыши, в геноме которых присутствуют два укороченных варианта ретровируса. Один из вариантов представляет собой последовательность 5’-LTR + gag + 3’-LTR, второй - 5’-LTR + pol, env + 3’-LTR, т.е. оба варианта лишены необходимой для упаковки РНК в капсид области у+. В клетках такой линии синтезируются все необходимые для построения капсида белки и обратная транскриптаза, но формирующиеся капсиды остаются пустыми. Если в такие клетки дополнительно ввести несущий чужеродную генетическую информацию ретровирусный вектор, в котором, как обсуждалось выше, имеется ^-область, происходит упаковка РНК вектора, т.е. гибридной. Получающиеся вирусные частицы сепарируют от культуры клеток «пакующей» линии и используют в дальнейшем для трансфекции нужных клеток, либо (если это позволяют свойства клетки-мишени) совместно культивируют «пакующую» линию и выбранные для трансфекции клетки, а затем проводят высев на селективную среду, обеспечивающую отбор только трансфецированных клеток-мишеней. Такая система введения гетерологичных генов в клетки млекопитающих оказывается высоко эффективной, но емкость ретровирусных векторов не превышает 8 т.п.н., так как молекулы, большие, чем РНК вируса дикого типа, не упаковываются.
Еще одна система векторных молекул для клеток млекопитающих разработана на основе вируса простого герпеса 1 типа (сокращенно HSV от англ. herpes simple virus). Этот вирус привлекает, с одной стороны, хорошо изученным геномом, состоящим из двунитевой ДНК длиной 152 т.п.н. (сравните с 8 т.п.н. для ретровирусных векторов), и, с другой стороны, выраженной нейронотропностью. Он размножается в нервных клетках человека, куда проникает за счет слияния вириона с поверхностью тела нейрона, причем его репродукция не происходит постоянно, а инициируется определенными изменениями на уровне организма (т.е. он относится к латентным вирусам). Поэтому его и рассматривают как потенциальный вектор для генно-инженерной терапии длительно текущих нервных болезней.
В геноме вируса выявлены области, замена которых на чужеродную ДНК не сказывается на основных этапах репродукции, но введение ДНК непосредственно в геном вируса затрудняется его существенными размерами. Поэтому создана и используется специальная, основанная на особенностях репликации ДНК вируса система, состоящая из двух компонентов. Первый компонент - это плазмиды E.coli, несущая два участка из генома HSV:1) последовательность, необходимую для упаковки вирусной ДНК в капсид, и 2) точку начала репликации ДНК вируса. Между этими участками располагается полилинкер, по которому и встраивается в выбранный для введения в клетки млекопитающих ген. Второй компонент - вирус простого герпеса, из генома которого удалены последовательности, обеспечивающие инициацию репликации и упаковку вирусной ДНК в капсид.
Для получения несущих нужный чужеродный ген вирусных частиц этим вирусом инфицируют клетки, а затем трансфецируют их ДНК плазмиды с нужным геном. За счет кодируемых генами вируса белков начинается репликация ДНК плазмиды, причем происходит она, как и положено для вируса простого герпеса, по модели «катящегося кольца: в точки инициации репликации происходит однонитевой разрыв и к 3’-концу присоединяются новые нуклеотиды, тогда как вторая нить остается ковалентно замкнутой матрицей. Отходящая новая нить в свою очередь становится матрицей для построения второй нити. По достижении растущей двунитевой ДНК размера, соответствующего размеру вирусного генома, происходит отрезание фрагмента, а процесс продолжается дальше. Параллельно идет наработка белков вирусного капсида и отрезанные фрагменты упаковываются. Таким образом чужеродный ген не только попадает в вирусные частицы, но и амплифицируется: поскольку длина плазмидной ДНК примерно в 10 раз меньше длины нормальной ДНК HSV, в каждой вирусной частице оказывается 10 копий вводимого гена. Это и послужило основанием для названия таких плазмид ампликон- плазмидами.
Эти, а также не рассмотренные здесь векторные системы на основе аденовирусов, находят применение при изучении особенностей функционирования клеток млекопитающих, то есть используются пока чисто в научных целях. Однако имеется потенциальная возможность и ведутся разработки использования таких систем для получения трансгенных животных и для лечения наследственных болезней человека (это направление условно называют генотерапией).
Для генотерапии человека разрабатываются и другие методы введения генетической информации, называемые невирусными системами доставки генов. Среди них бомбардировка определенных тканей через разрез микрочастицами золота; использование липосом (комплексы из положительно заряженных липидов и отрицательно заряженных ДНК, предлагаемые для этих целей, называются липоплексы, входят они в клетку хорошо, но в клетке из-за слияния с ними лизосом большая часть ДНК в них разрушается); использование ДНК-конъюгатов (ДНК смешивают с поли-Ь-лизином, к которому ковалентно пришито много молекул белка, комплементарного какому-нибудь клеточному рецептору. Поли-Ь-лизин образует вокруг ДНК оболочку и такая структура после введения в организм взаимодействует с рецептором. Далее этот комплекс поглощается путем эндоцитоза подобно комплексу гормон-рецептор, и поэтому образовавшаяся эндосома не сливается с лизосомами, а находящаяся в ней ДНК не повреждается); и даже простое введение суспензии молекул ДНК в мышцу с помощью шприца. Частота трансфекции клеток такими методами значительно ниже, чем при использовании вирусных систем. Но их продолжают улучшать и разрабатывать, поскольку часть из них снимает характерное для вирусных систем ограничение по емкости вектора, и, вероятно, они могут понадобиться для введения в клетки искусственных хромосом человека, так называемых микрохромосом.
Разработка таких хромосом ведется на основе объединения теломерных участков, центромерных последовательностей и точек инициации репликации. В конце 90-х годов 20-го века была продемонстрирована возможность получения трех вариантов микрохромосом. Один из них был получен путем укорочения исходной хромосомы, второй - также укорочения + замена центромерной области на другую, введенную путем трансфекции; третий - посредством лигирования in vitro двух теломерных и одного центромерного участка и затем введения этой конструкции в клетки. Естественно, что все это пока подготовительные работы и до практического (генотерапевтического) применения микрохромосом пока еще далеко. На мышах для введения чужеродных ДНК значительной протяженности опробована система на основе искусственных дрожжевых хромосом (YAC), которые можно вводить либо в мужской пронуклеус зиготы микроинъекцией, либо в эмбриональные стволовые клетки кальциевым методом или электропорацией.
Вопросы к § 16. 1. Какие гены наиболее часто используются в качестве селективных маркеров при работе с клетками млекопитающих? 2. Какие особенности жизненного цикла ретровирусов обусловили их применение в качестве векторов, несмотря на то, что они являются РНК-содержащими? 3. Что такое ампликон-плазмида? 4. Что такое емкость генно-инженерного вектора и чем она ограничивается при использовании вирусных векторных систем? 5. Как можно создать искусственную хромосому человека?