Такие реакции используются для так называемых высокодисперсных антигенов, представляющих собой отдельные молекулы. Основные отличия их от реакций агглютинации заключаются в более медленном (как правило) образовании осадка (преципитата), меньшей его плотности и способности со временем диссоциировать.
Наиболее быстрый вариант (экспресс-метод) преципитации - это реакция кольцепреципитации. Для ее постановки используют специальные узкие пробирки, обычно называемые преципитационными. Небольшой диаметр таких пробирок должен препятствовать смешиванию двух растворов, содержащих соответственно антиген и антитела. Необходимо, чтобы оба раствора были прозрачны и не содержали видимых взвешенных частиц. Сначала в пробирку до половины объема наливают один из растворов, а затем медленно по стенке, не допуская перемешивания с уже налитым раствором, приливают второй в таком же объеме. В результате диффузии молекул антигена и антител будут создаваться меняющиеся соотношения концентраций, и, когда они окажутся эквивалентными, образуется располагающийся на границе двух растворов осадок, обычно имеющий форму кольца, что и дало название реакции. Обычно кольцо образуется в течение 5-15 мин, но затем из-за продолжающейся диффузии концентрации выйдут из зоны эквивалентности, комплексы антиген- антитело начнут диссоциировать и кольцо осадка может исчезнуть. Поэтому учитывать результат такой реакции следует не позже, чем через час после ее постановки, что в целом считается одним из ее недостатков.
С целью избежать диссоциации образующихся осадков были разработаны варианты реакций преципитации в гелях, получившие название реакций иммунодиффузии. Используемые для таких реакций гели чаще всего готовят из агара или агарозы в концентрациях от 1 % до 2 % на веронал-ацетатном буфере с рН 6,8 и ионной силой 0,1. Нагретый гелеобразующий раствор наносят слоем равной толщины на прозрачную стеклянную или пластиковую пластинку или дно чашки Петри и после застывания в геле изготавливают лунки равной глубины и диаметра. В зависимости от варианта реакции в лунки будут вноситься растворы антигенов или антител, при диффузии которых в геле будут создаваться эквивалентные концентрации. Хотя такая диффузия будет происходить медленнее, чем в жидкостях, что удлиняет время протекания реакций, образующиеся в геле осадки сохраняются гораздо большее время. Кроме того, можно улучшить визуализацию результатов проведенной реакции путем обработки гелей раствором связывающихся с белками красителей (например, Кумасси синего).
Одним из наиболее распространенных вариантов таких реакций является двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (ил. 47). Для постановки реакции в разные лунки, расположенные на расстояниях 4-10 мм друг от друга, вносят суспензии антигенов и антител. Молекулы реагентов диффундируют в гель, и в случае соответствия антигена и антитела в геле между лунками образуется полоска преципитата. Иммунодиффузия получила название двойной в силу того, что оба компонента движутся в геле навстречу друг другу. Результаты учитывают каждые 24 часа в течение 6-7 суток. Время образования преципитатов варьирует в зависимости от температуры инкубирования гелей (реакцию можно проводить при +4°С, +18-20°С или +37°С) и от молекулярной массы антигенов.
Метод позволяет анализировать сыворотки на содержание антител различной специфичности. В этом случае вокруг одной заполняемой сывороткой лунки располагаются лунки, в которые вносятся различные антигены. По сходной схеме возможно определить наличие в анализируемом растворе нескольких различных антигенов, но в этом случае анализируемый раствор вносят в центральную лунку, а лунки вокруг заполняют различными моноспецифическими сыворотками. При наличии двух или более полос между конкретными лунками делается вывод о наличии в анализируемых смесях нескольких антигенов, способных связываться с антителами сыворотки, но обладающих различной скоростью диффузии. По ширине образующихся полос преципитата можно предположительно оценивать разницу в концентрациях того или иного реагента в анализируемых смесях, однако этот метод не является истинно количественным.
Для определения количества реагирующих компонентов используется простая радиальная иммунодиффузия по Манчини (ил. 48). Для постановки этой реакции один из компонентов (например, антитела) вносят в гелеобразующий раствор до застывания и перемешиванием добиваются равномерного его распространения. После застывания геля в слое образуется одинаковая концентрация этого компонента в любой точке геля. После изготовления лунок их заполняют растворами, содержащими второй компонент (в нашем примере молекулы антигена). В данном случае диффундирующим считается только один, вносимый в лунки, компонент, поэтому такая иммунодиффузия и получила название простой, а не двойной. При соответствии антигенов и антител по специфичности в силу равномерной диффузии по всем направлениям (отсюда название «радиальная диффузия») преципитат образуется в зоне, представляющей окружность вокруг лунки. При этом площадь занятой преципитатом ок
ружности, определяемая по формуле Б = пё , пропорциональна количеству диффундирующего компонента. Измеряя диаметр образованных преципитатом окружностей вокруг каждой из лунок и соотнося полученные величины с построенным заранее по результатам специально проведенного эксперимента графиком соотношения квадрата диаметра и известных концентраций одного из компонентов реакции (калибровочным графиком), можно точно определить концентрацию его в анализируемом растворе. Следует помнить, что условия проведения опытных реакций и реакций, дающих данные для построения калибровочного графика, должны быть полностью идентичными. Только в этом случае полученные в опыте данные можно считать достоверными. Наиболее часто используемыми температурами для проведения такой иммунодиффузии являются +4°С или +18-20°С, время учета результатов - 40-48 часов.
Определенными недостатками преципитации в гелях являются длительность проведения реакций и нечеткость результатов при невысоких концентрациях антигенов. С целью преодолеть эти недостатки во второй половине ХХ века были разработаны методы, сочетающие белковый электрофорез и иммунопреципитацию, которые получили общее название иммуноэлектрофорез (ил. 49). Помимо выигрыша во времени и повышения разрешающей способности такие методы дают возможность более четко отличить белковые антигены, имеющие одинаковые антигенные детерминанты, но отличающиеся по молекулярной массе. Для этого достаточно так называемого обычного иммуноэлектрофореза. Для его постановки изготавливают гель, в котором помимо обычных стартовых лунок готовят также желобок для сыворотки. Желобок располагают между дорожками в направлении от электрода к электроду, т. е. вдоль фронта движения белков. Гель из желобка не удаляют, чтобы не нарушать прохождение электрического тока во время фореза. Сначала в соответствующем буферном растворе проводят электрофорез образцов, анализируемых на присутствие искомого антигена. После снятия электрического поля пластинку геля переносят во влажную камеру, из желобка удаляют гель и вместо него вносят сыворотку или суспензию моноклональных антител. Результаты учитывают после инкубирования геля во влажной камере в течение 12-24 часов. В случае соответствия антигенов и антител в зоне между желобком и дорожками образуются преципитаты в виде дуг, вогнутой стороной направленных в сторону места расположения антигена. Для лучшей визуализации гель прокрашивают красителем, связывающимся с белком. Фактически такой метод является вариантом двойной иммунодиффузии, но имеет большую разрешающую способность и дает существенный выигрыш во времени.
Для некоторых белковых антигенов возможно применить вариант иммуноэлектрофореза, еще в несколько раз ускоряющий процесс. Это так называемый встречный электофорез (электросинерез). Метод основан на том, что различающиеся по аминокислотному составу белки в щелочной среде могут приобретать противоположные заряды и мигрировать при электорофорезе навстречу друг другу. Для проведения такого фореза используют буфер с рН 8,0, а в геле готовят лунки у противоположных концов (у катода и анода соответственно). В одну из лунок вносят антитела, в другую - содержащий антиген раствор. Под действием электрического поля компоненты двигаются гораздо быстрее, чем при обычной диффузии, поэтому преципитаты в центральной части геля будут образовываться в течение 1-3часов. К тому же чувствительность электросинереза приблизительно в 10 раз выше, чем у метода Оухтерлони, т. е. можно обнаруживать антигены, присутствующие в небольших концентрациях. Недостаток метода в том, что он не может быть применим к любым антигенам.
Описанные выше варианты иммуноэлектрофореза позволяют выявить антиген, но не определить его количество. Количественным методом (фактически модификацией иммунодиффузии по Манчини) является так называемый ракетный иммуноэлектрофорез. Для его постановки в охлажденный до 50°С гелеобразующий раствор вносят подогретую до такой же температуры сыворотку с таким расчетом, чтобы она составляла 1-5 % геля, перемешивают и готовят пластинку геля. После внесения в лунки антигенов проводят электрофорез, условия которого подбирают так, чтобы максимально ограничить смещение молекул антител в электрическом поле (чаще всего используют барбиталовый буфер с рН 8,6 и низкое напряжение). Время электрофореза должно обеспечить выход всех молекул антигена из лунки в гель и вхождение их в состав преципитата, обычно это происходит в течение двух часов. Преципитаты в таких условиях образуются в зонах по ходу движения антигена, которые имеют форму вытянутого конуса (ракеты). Длина зоны образования преципитата пропорциональна концентрации антигена, что дает возможность, измерив длину «ракеты» и используя специально построенный калибровочный график, определить количество антигена в пробе.
Вариантом ракетного иммуноэлектрофореза является так называемый перекрестный электрофорез. Для его постановки готовят обычной гель и проводят обычный электрофорез анализируемой пробы. При этом используют одну пробу и лунку располагают у одного из краев пластинки. После проведения электрофореза часть пластинки (около 4/5 от исходного размера) отрезают и удаляют, оставляя только ту часть, в которой находится дорожка первого электрофореза. Затем в ту же камеру заливают гелеобразующий раствор с сывороткой так, чтобы оставшийся участок пластинки объединился с новым, содержащим сыворотку, гелем. Меняют положение пластинки (или электродов) так, чтобы направление движения антигенов было перпендикулярным тому, которое было при первом форезе, и проводят второй форез в условиях, как для ракетного. Учет результатов проводят, как описано выше. В таком варианте результаты могут оказаться более точными, в силу того, что при втором форезе анализируемыми образцами, фактически, оказываются чистые однородные белки.
Описанные выше реакции агглютинации и преципитации были введены в практику еще в конце XIX века и не утратили своего значения до сих пор, но уже в первые годы их применения стало понятно, что их разрешающая способность не всегда удовлетворяет исследователей. В частности, при малых концентрациях того или иного реагента образующиеся комплексы настолько невелики по размерам, что даже с применением микроскопии не могут быть фиксированы исследователем. Поэтому постоянно проводились попытки подобрать условия для более выраженной визуализации результатов взаимодействия антиген- антитело. Одной из успешных попыток стало применение эритроцитов крови в качестве носителей антигена.