ГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова МЗ РФ»
Методом проточной цитометрии выявлено снижение внутриклеточного синтеза И-1р, И-10, И-12 в макрофагах децидуальной оболочки плаценты женщин с синдромом задержки развития плода (СЗРП). В экстрактах децидуальной ткани при СЗРП были снижены уровни ^-1р и И-10 и повышено содержание ^-12. Децидуальные макрофаги при СЗРП характеризовались сниженной экспрессией антигенов МНС II и увеличением пула CD11b+-клеток. Таким образом, при СЗРП в децидуальной оболочке плаценты наблюдается неадекватная активация децидуальных макрофагов, сопровождающаяся нарушением их синтетической и антигенпрезентирующей функции. (Цито- кины и воспаление. 2006. Т. 5, № 1. С. 16-20.)
Ключевые слова: синдром задержки развития плода, цитокины, децидуальные макрофаги.
Беременность — физиологический процесс, во время которого действуют особые механизмы, регулирующие взаимоотношения между аллогенными организмами. Основные события, определяющие процессы формирования и роста плаценты, а также выполнения ее барьерной и трофической функций происходят в зоне разделения кровотока матери и плода — в децидуальной оболочке плаценты (ДО) [7]. Как показывают многочисленные исследования, главными действующими лицами во всех этих процессах выступают клетки иммунной системы, инфильтрирующие децидуальную ткань [8]. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что нарушение процессов активации и дифференцировки клеток, продукции и рецепции цитокинов способствует развитию акушерской и перинатальной патологии [18]. На экспериментальной модели синдрома задержки развития плода (СЗРП) было показано наличие аккумуляции лейкоцитов в ткани матки [14]. Данные ряда исследователей свидетельствуют об изменении продукции ряда ростовых и провоспалительных цитокинов при СЗРП [10, 15]. Активными продуцентами цитокинов, регулирующих направленность иммунного ответа, являются макрофаги [5], однако данные о продукции цитоки- нов макрофагами ДО немногочисленны. В то же время децидуальные макрофаги не только обеспечивают барьерную функцию плаценты, но и продуцируют широкий спектр ростовых факторов, регулирующих процессы роста тро- фобласта, ангиогенеза и децидуализации эндометрия [6].
Целью проведенного исследования было определить особенности функциональной активности децидуальных макрофагов при СЗРП.
Материалом для исследования служили плаценты, полученные в результате своевременных родов в сроке 38-40 недель гестации. Группу с физиологическим течением беременности (ФБ) составили 32 женщины с неосложненным течением беременности, родившие детей без перинатальной патологии, группу с СЗРП — 25 женщин, беременность которых не сопровождалась выраженной угрозой невынашивания и гестозом. Однако на момент обследования в группе женщин с СЗРП в 36% случаев отмечались признаки экстраге- нитальной патологии в виде анемии I и II степени, в 68% случаев — признаки хронической внутриутробной гипоксии плода, в 44 % — признаки фетоплацентарной недостаточности. Дети, родившиеся в данной группе, имели при знаки СЗРП I и II степени асимметричного типа (76 % и 24 %, соответственно).
Плаценту получали в течение 10-15 мин после родов. Поверхность плаценты со стороны базальной пластинки омывали от крови большим количеством физиологического раствора (ФР). Децидуальная ткань срезалась ножницами небольшими пластинами площадью до 3 см2, причем толщина срезаемого слоя не превышала 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержавшие 200 мл ФР, отмывали от крови и от клеток трофобласта, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин.
Для получения экстрактов отмытые кусочки децидуальной ткани слегка подсушивали на фильтровальной бумаге и взвешивали. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани — 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20 °С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об./мин при температуре +4 °С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20 °С до проведения ИФА.
Мононуклеарные клетки из ДО выделяли бесферментатив- ным методом, путем механического измельчения кусочков ткани ножницами до кашеобразного состояния на часовом стекле. Затем полученную массу гомогенизировали в фарфоровой ступке и помещали в химические стаканы с 50-100 мл среды 199. Взвесь клеток перемешивали в течение 15-20 мин при комнатной температуре на магнитной мешалке. При этом большинство клеток лейкоцитарного инфильтрата вымывались из измельченной ткани в среду 199. Далее клетки фильтровали через 8 слоев плотной марли и осаждали центрифугированием при 1500 об./мин. Все выделенные клетки ресуспендировали в 6 мл среды 199, наслаивали на градиент плотности фиколла-урографина (d = 1,114 г/см3) и центрифугировали при 1500 об./мин 30 минут. Кольцо клеток на границе фаз среды 199 и фиколла-урографина содержало чистую фракцию мононуклеарных клеток децидуальной оболочки плаценты, содержащую 25-35 % лимфоцитов, 60-70% макрофагов и менее 5 % детрита. Полученные клетки отмывали центрифугированием при 1500 об./мин 10 минут и доводили средой 199 до концентрации 2 х 106 в 1 мл. При помощи данного бесферментативного метода были получены 0,2-0,5 х 106 клеток из 1 г децидуальной ткани.
Внутриклеточную экспрессию цитокинов оценивали методом проточной цитофлюоримет- рии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA) с использованием моноклональных антител ICO-1 (анти-HLA-DR), ICO-46 (анти-^45),
ICO-116 (анти-^16), ICO-174 (анти- CD14), ICO-GM1 (анти-CDHb) производства НПЦ «МедБиоСпектр» (Москва); анти-IL-^, анти-К-6, анти-IL-W, анти-К-12 и анти-IFNy фирмы «CALTAG Laboratories» (USA). Мак- рофагальный гейт строили по экспрессии антигенов CD14 и CD45.
ИФА проводили на микроплан- шетном ридере Multiscan EX,
Labsystems (Finland). Использовали тест-системы следующих фирм: IL-1P и IFNy производства ООО «Цитокин»
(С.-Петербург); IL-6, VEGF и EGF фирмы «CYTIMMUNE» (USA); IL-10 и К-12р70 фирмы «DIACLONE» (France); PLGF фирмы «R&D Systems» (USA); TGFP2 компании «Bender MedSystems» (Austria); эндотелин производства «BIOMEDICA» (Austria).
Статистическая обработка данных включала определение среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследований внутриклеточной экспрессии цитокинов макрофагами лейкоцитарного инфильтрата ДО и содержания цитокинов в экстрактах децидуальной ткани представлены в табл. 1.
Анализ данных внутриклеточной экспрессии цитокинов децидуальными макрофагами при ФБ показал, что большинство клеток продуцировали IL-10, IL-6, IL-12 и IFNy. Наименьшую популяцию составили IL-10-позитивные макрофаги.
При СЗРП мажорную популяцию составляли IL-6+ макрофаги, однако данный показатель не отличался от такового в контрольной группе (p > 0,05). Внутриклеточная экспрессия IL-12 и IFNy децидуальными макрофагами при СЗРП была сопоставима друг с другом. Наименьший процент макрофагов при СЗРП составили IL-10+- и ^-1р+-клетки.
Сравнительный анализ внутримакрофагальной экспрессии цитокинов вДО при ФБ и при СЗРП показал, что характерной особенностью децидуальных макрофагов при СЗРП было достоверное снижение внутриклеточного синтеза IL-1в, IL-10, IL-12 (p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05; p < 0,001, соответственно). Уровень №^+-макрофагов в децидуальной оболочке плаценты при СЗРП не имел достоверных различий с показателем группы ФБ (p > 0,05).
Таким образом, при СЗРП нарушалась продукция децидуальными макрофагами основных про- воспалительных цитокинов, кроме IL-6. Одним из регуляторных цитокинов, способных подавлять синтез большинства провоспалительных цитоки- нов, является ^-10 [2]. Однако ингибиция продукции цитокинов при СЗРП не может определяться высоким уровнем ^-10, т.к. продукция ^-10 макрофагами ДО была достоверно ниже, чем при ФБ.
Отмеченное снижение продукции провоспали- тельных цитокинов макрофагами не может в полной мере определять общий характер изменений цитокинового профиля в децидуальной оболочке при СЗРП, т. к. известно, что продуцентами цито- кинов могут быть и сами децидуальные клетки [6]. В связи с этим нами было проведено исследование содержания аналогичных цитокинов в экстрактах децидуальной ткани.
Результаты сравнительного анализа показали, что изменения в содержании цитокинов в экстрактах децидуальной ткани в большинстве своем соответствовали таковым во внутриклеточном содержании цитокинов в макрофагах ДО. Для СЗРП было характерно достоверное снижение уровня ^-1р, ^-10 в экстрактах децидуальной ткани (р < 0,001; p < 0,01, соответственно) при одновременном повышении в них содержания ^-12 (р < 0,05) и отсутствии достоверных изменений в содержании ^-6 и №N7 (р > 0,05 в обоих случаях), по сравнению с показателями при ФБ. Таким образом, однонаправленность изменений внутриклеточного синтеза цитоки- нов макрофагами и содержания их в децидуальных экстрактах позволяет предположить, что уровень провоспалительных цитокинов и ^-10 в ДО определяется сниженной синтетической активностью самих макрофагов лейкоцитарного инфильтрата.
Некоторые из полученных нами результатов согласуются с данными других исследователей. Так, ранее было показано, что при СЗРП в децидуальной ткани снижается экспрессия мРНК ^-10 [10]. Потомство мышей с дефектом локальной продукции ^-10 рождалось с признаками СЗРП [12]. Кроме того, задержка развития плода ассоциировалась со сниженной продукцией ^-10 моноцитами периферической крови [13], а введение мышам с неосложненной беременностью моноклональных антител к ^-10 приводило к развитию транзиторного СЗРП [16].
Отсутствие достоверных изменений в продукции ^-6, установленное нами при исследовании внутриклеточного содержания макрофагами ДО, и уровня цитокина в экстрактах децидуальной ткани хорошо согласуется с аналогичными данными по экспрессии мРНК П1-6 в децидуальной ткани при СЗРП [10]. С другой стороны, в литературе имеются сведения об усилении экспрессии мРНК ^-6 в трофобласте плацент при СЗРП [10]. Наиболее высокие концентрации ^-6 выявлены в зоне синцитиотрофобласта [11]. В то же время, наши исследования показали, что при СЗРП клетки, продуцирующие ^-6, представляют самую многочисленную популяцию децидуальных макрофагов. Известно, что высокий уровень П1-6 способствует поликлональной активации В-лимфо- цитов и развитию аутоиммунных реакций, способных приводить к повреждению тканей плаценты и плода [5]. Отсутствие достоверных различий в содержании П1-6 вДО при ФБ и при СЗРП может определяться необходимостью стабильной регуляции процессов созревания антителопродуцирующих клеток и самой продукции иммуноглобулинов, способствуя выполнению плацентой барьерной функции. Возможно, перераспределение относительного содержания макрофагов в сторону преобладания ^-6+-клеток в децидуальной ткани и высокий уровень цитокина в плодовой части плаценты являются одними из пусковых факторов аутоиммунных реакций отмечаемых различными авторами при СЗРП [9].
В работе Н.В. Астраух [1] имеются данные об усилении системной и локальной продукции ^-1р при гестозе беременных. В работе Ы. Hahn-Zoric et al. [10] было отмечено, что уровень мРНК ^-1а и ГЬ-1р в децидуальной оболочке значительно повышается в том случае, когда СЗРП развивается на фоне преэклампсии. Данных о корреляции между сниженным синтезом ^-1р и состоянием плода при рождении в доступной нам литературе найдено не было. Однако известно, что ^-1 оказывает непосредственное стимулирующее действие на процессы репликации клеток трофобла- ста [6]. В то же время, ^-1 является основным ци- токином, осуществляющим дистантное взаимодействие между иммунной и эндокринной системами. Среди метаболических изменений, наблюдающихся при СЗРП, наиболее важными являются нарушения углеводного и липидного обмена [4]. На экспериментальной модели было показано опосредованное через PGE2 стимулирующее действие ^-1 на синтез глюкокортикоидных гормонов [4].
Особый интерес представляют противоречивые данные о содержании ^-12 в экстрактах децидуальной ткани и во внутриклеточном содержании цитокина в макрофагах ДО. Можно предположить, что основная часть ^-12 в децидуальной ткани синтезируется не макрофагами. Однако вДО плаценты нет иной значительной популяции клеток, продуцирующих ^-12. Возможно, меньшая при СЗРП, по сравнению с показателями при ФБ, популяция ^-12+-макрофагов осуществляет более интенсивный синтез данного цитокина. Кроме того, моноклональные антитела к ^-12 позволяли нам определить ^-12+-макрофаги, содержащие субъединицы ^-12р40 и ^-12р70, но не клетки, содержащие свободные ^-12р35 структуры. В ИФА нами была установлена концентрация субъединицы ^-12р70, которая, как известно, со
стоит из более мелких субъединиц IL-12p40 и IL-12p35, связанных дисульфидными связями, определяющими активность цитокина. Таким образом, мы не учитывали свободные фракции IL-12p40 и IL-12p35. Известно, что субъединица p40 не имеет биологической активности, но участвует в связывании с рецептором для IL-12. Субъединица р35 необходима для трансдукции сигнала. При сопоставлении данных, полученных двумя методами, можно предположить, что при ФБ повышен синтез IL-12p40 субъединицы (по данным проточной цитометрии), в то время как при СЗРП, по данным ИФА, продукция макрофагами биологически активного ^-12р70 значительно превышает физиологическую норму. Полученные нами данные об увеличении содержания IL-12 в экстрактах ДО при СЗРП хорошо согласуются с отмеченным нами ранее повышением содержания NK-клеток в лейкоцитарном инфильтрате ДО [17]. Общеизвестно, что IL-12 является фактором дифференцировки NK-клеток [2]. Возможно, усиленная продукция в ДО биологически активного IL-12 при СЗРП отражает активацию макрофагов слабопатогенными в норме микроорганизмами, например, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, отмечавшуюся нами ранее [3]. В связи с этим встает вопрос о характере функциональной активности макрофагов при СЗРП.
Изучение экспрессии функциональных молекул на клеточной поверхности децидуальных макрофагов показало, что при СЗРП нарушена экспрессия молекул, обеспечивающих межклеточное взаимодействие децидуальных макрофагов с другими клетками иммунной системы и с клетками сосудистого эндотелия. Данные приведены в табл. 2.
Следует отметить, что большинство децидуальных макрофагов как в норме, так и при СЗРП, экспрессировали на своей поверхности рецептор FcyR III типа (CD16). Причем достоверных различий по содержанию CD^+^акрофагов в двух сравниваемых группах не отмечалось (р > 0,05). В то же время, в группе СЗРП децидуальные макрофаги характеризовались достоверно сниженной экспрессией антигенов MHC II класса (р < 0,05).
Однако наиболее выраженным отличием децидуальных макрофагов при СЗРП было увеличение пула CD11b+-клеток (р < 0,01). Таким образом, для СЗРП характерно снижение антигенпрезентиру- ющих свойств макрофагов и усиление их способности к адгезии к сосудистому эндотелию, при этом экспрессия поверхностных структур, обеспечивающих начальные этапы антителозависимого фагоцитоза, при СЗРП не изменяется. Следовательно, задержка развития плода в значительной степени коррелировала с изменением экспрессии молекул межклеточного взаимодействия. Наши данные соответствуют описанному ранее усилению экспрессии адгезионных молекул (CD11a и CD11b) на поверхности периферических нейтрофилов при СЗРП [14]. Проведенные нами исследования позволили выделить несколько основных форм нарушений функции макрофагов при СЗРП: снижение продукции провоспалительных (^-10) и регуляторных цитокинов (1Ъ-10); повышение концентрации ^-12 в экстрактах децидуальной ткани; угнетение антигенпрезентирующей функции макрофагов; усиление адгезии к эндотелию сосудов.
Таким образом, при СЗРП вДО плаценты наблюдается неадекватная активация децидуальных макрофагов, сопровождающаяся нарушением их синтетической и антигенпрезентирующей функции. Можно предположить, что нарушение функции макрофагальных клеток играет важную роль в нарушении развития плода.
Работа поддержана грантом Президента РФ НШ-2245.2003.4
Астраух Н.В. Особенности фенотипа и цитокинового профиля децидуальных лимфоидных клеток при гестозе. — Дисс. ... канд. мед.наук. — Иваново. —
— 157 с.
Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В.,Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. — М.: РГМУ, 2001. — 20 с.
Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Веденеева М.В., Панова И.А. Особенности дифференцировки и активации Т-хелперов децидуальной оболочки плаценты при синдроме задержки развития плода (СЗРП) // Russ. J. Immunol. — 2004. — Vol. 9, № 1. — P. 318.
Медведев М.В., Юдина Е.В. Задержка внутриутробного развития плода. — М.: РАВУЗДПГ, 1998. — 208 с.
Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб: Наука, 2001. — Т. 1. — 231 с.
Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. — Екатеринбург: УрО РАН, 2002. — Т. 2. — 379 с.
BiUington W.D. The nature and possible functions of MHC antigens on the surface of human trophoblast. In: Reproductive Immunology (Ed. by S.K. Gupta). — Narosa Publishing House, New Delhi. — 1999. — P. 7l-77.
Chernyshov V.P., Slukvin I.I., Bondarenko G.I. Phenotypic characterization of CD7+, CD3+ and CD8+ lymphocytes from first trimester human decidua using two-color flow cytometry // Am. J. Reprod. Immunol. — 1993. — Vol. 29, № 1. — P. 5-16.
D'Anna R., Scilipoti A., Leonardi J. et al. Annticardiolipin antibodies in pre-eclampsia and intrauterine growth reyardation // Clin. Exp. Obstet. Gynecol. — 1997. — Vol. 24, № 3. — P. 135-137.
Hahn-Zoric M., Hagberg H., Kjellmer I. et al. Aberrations in placental cytokine mRNA related to intrauterine growth retardation // Pediatr. Res. — 2002. — Vol. 51, № 2. — P. 201-206.
Kameda T., Matsuzaki N., Sawai K. et al. Production of interleukin-6 by normal human trophoblast // Placenta. — 1990. — Vol. 11. — P. 203-213.
Lohler K.R., Rennick D., Rajewsky K., Muller W. Interleukin-10 deficient mice develop chronic enterocolitis // Cell. — 1993. — Vol. 75. — P. 263-274.
Marzi M., Vigano A., Trabattoni D. et al. Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile in physiologic and pathologic human pregnancy // Clin. Exp. Immunol. — 1996. — Vol. 106. — P. 127-133.
Miyakoshi K., Ishimoto H., Nishimura O. et al. Role of leukocytes in uterine hypoperfusion and fetal growth retardation induced by ischemia-reperfusion // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. — 2001. — Vol. 280. — P. 1215-1221.
Reid G.J., Flozak A.S., Simmons R.A. Placental expression of insulin-like growth factor receptor-1 and insulin receptor in the growth-restricted fetal rat // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2002. Vol. 9, № 4. — P. 210-214.
Rijhhsinghani A.G., Thompson K., Tygrette L., Bhatia S.K. Inhibition of in- terleukine-10 during pregnancy results in neonatal growth retardation // Am. J. Reprod. Immunol. — 1997. — Vol. 37, № 3. — P. 232-235.
17.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V., Vedeneeva M.V., Panova I.A. Systemic and local mechanisms of immunoregulation in normal and IUGR pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. — 2004. — Vol. 51, № 6. — P. 468.
Wegmann T.G. Maternal T cells promote placental growth and prevent spontaneous abortion // Immunol. Let. — 1988. — Vol. 17. — P. 297-302.