Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «ВЕКТОР», Кольцово, Новосибирская обл.
Влияние рекомбинантного TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы (VARV-CrmB) на развитие эндотоксического шока изучали на SPF-мышах линии BALB/c. Шок индуцировали в/б введением сенсибилизирующей (300 мкг/мышь) и, через 16 ч, разрешающей доз ЛПС (350 мкг/мышь), что приводило к 80-100%-ной гибели мышей в течение 72 ч. Концентрация TNF в сыворотке крови через 1 ч после введения разрешающей дозы ЛПС достигала 600-800 пг/мл с последующим ее снижением через 24 ч до уровня < 5пг/мл. Концентрация IFNy в сыворотке крови на фоне шока не изменялась и не превышала уровня 5 пг/мл. Патоморфологическая картина сердца, головного мозга, легкого, печени, почек и брыжейки соответствовала описанной в литературе при экспериментальном эндотоксическом шоке у мышей, включая развитие инфарктов сердца и острой почечной недостаточности. Введение мышам в/б белка VARV-CrmB в дозах 0,2 мкг/мышь и 2 мкг/мышь за 30 мин до инъекции разрешающей дозы ЛПС увеличивало выживаемость животных в группах до 47±10,9 % и 62±8,6 % соответственно. Гистологическое изучение внутренних органов, брыжейки и головного мозга показало, что белок VARV-CrmB в течение первых 24 ч предупреждает появление инфарктов в сердце, снижает степень нарушений кровообращения в сосудах внутренних органов, головного мозга и брыжейки. В период 24-48 ч наблюдается дальнейшая нормализация микроциркуляции и кровоснабжения головного мозга и внутренних органов, не развивается острая почечная недостаточность. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 1. С. 44-49.)
В ходе эволюции вирусами выработаны различные стратегии преодоления защитных реакций организма, развивающихся в ответ на инфекцию. Геномы ДНК-содержащих поксвирусов (180-230 тыс.п.н.) кодируют широкий спектр белковых факторов, которые эффективно нейтрализуют антивирусный ответ организма-хозяина, ингибируя процессы апоптоза, продукцию интер- феронов, хемокинов и воспалительных цитокинов, активность системы комплемента, функции цито- токсических лимфоцитов и натуральных киллеров [8-10]. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия поксвирусных белков с защитными системами человека открывает возможность их использования в терапии различных заболеваний. Показано, что некоторые поксвирусные
белки проявляли активность в ингибировании реакции отторжения алло- и ксенотрансплантатов [12, 15], воспалительных реакций [13, 14], а также бронхоспазма и клеточной инфильтрации в экспериментальной модели бронхиальной астмы [11].
Фактор некроза опухолей (TNF) принимает участие в реализации многих патологических реакций в организме, в частности эндотоксического шока [5]. Разработка препаратов, способных модулировать выработку и/или действие TNF, представляет интерес в плане создания новых лекарственных препаратов. Одним из кандидатов на роль такого препарата может быть TNF-связы- вающий белок вируса натуральной оспы (VARV- CrmB) [8]. Нами получен рекомбинантный бакуло- вирус BTRi67, содержащий в составе своей ДНК ген G2R, кодирующий этот белок. Данный баку- ловирус в клетках насекомых линии Sf21 детер
минирует синтез секретируемого рекомбинантного белка VARV-CrmB [2]. Разработан способ выделения этого белка из культуральной среды [4]. Полученный рекомбинантный белок эффективно ингибирует цитотоксическое действие человеческого, мышиного и кроличьего TNF на культуру мышиных фибробластов линии L929 [3].
Цель данного исследования — изучение влияния белка VARV-CrmB на характер патологогистологических изменений органов и выживаемость мышей при эндотоксическом шоке, вызванном введением бактериального липополисаха- рида (ЛПС).
Получение и анализ сывороток крови. У животных 1-й и 2-й групп индивидуально забирали кровь из ретроорбитального синуса через 1, 3, 6 и 24 ч после введения разрешающей дозы ЛПС, выдерживали при комнатной температуре до образования сгустка. Образцы сывороток получали путем центрифугирования крови при 1000 g в течение 10 мин, затем помещали в пробирки и хранили при -70 °С. Концентрацию TNF и IFNу в сыворотках крови определяли иммуноферментным методом, используя наборы DueSet Mouse TNF и DueSet Mouse IFNy (R&D Systems, USA). Оптическую плотность в 96-луночных планшетах измеряли на приборе Microplate Reader ELx808, (Bio-Tek Instruments, Inc., USA) при длине волны 490 нм.
Реагенты. Рекомбинантный белок VARV-CrmB выделяли по методу, описанному в работе Л.Р. Лебедева и др.[4]. Эндо- токсический шок индуцировали бактериальным ЛПС L2880 E. coli серотипа 055:B5 (Sigma, USA).
Животные. Самцов мышей линии BALB/с (возраст 3-4 недели), свободных от патогенной микрофлоры (SPF), получали из НПП «Питомник лабораторных животных» филиала института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Пущино Московской обл.). Опыты на животных проводили после двухнедельной адаптации в соотвествии с Протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор». Группы по 8-10 мышей формировали для визуального наблюдения и изучения выживаемости; и по 15-20 животных— для получения сывороток. Эксперименты повторяли от 2 до 6 раз.
Индукция эндотоксического шока и изучение действия ре- комбинаниного белка VARV-CrmB. Контрольным животным дважды (через 16 ч) вводили в/б по 100 мкл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (группа 1). Эндотоксический шок вызывали введением сенсибилизирующей (300 мкг/мышь) и, через 16 ч, разрешающей доз ЛПС (350 мкг/мышь) в 100 мкл
9%-ного раствора хлорида натрия (группа 2).
Белок VARV-CrmB вводили мышам в/б за 30 мин до введения разрешающей дозы ЛПС (0,2 мкг/мышь) (группа 3). Мыши группы 4 по этой же схеме получали белок VARV-CrmB в дозе
мкг/мышь. По этой же схеме вводили в/б рекомбинантный белок VARV-CrmB контрольным мышам в дозах 0,2 мкг/мышь и
мкг/мышь (группы 5 и 6).
Наблюдение за животными и учет гибели проводили в течение 72 ч.
Гистологическое исследование проводили на мышах групп
2, 4 и 6, включавших 4, 38, 39 и 23 животных соответственно. Животных умерщвляли путем декомпозиции шейных позвонков через 1, 3, 6, 24, 30 и 48 ч после индукции шока. Иссекали образцы головного мозга, миокарда, печени, легких и почек и фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида. Проводку в гистологическом автомате и заливку в парафин осуществляли стандартным методом. С каждого образца готовили 3-5 срезов, которые окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. У этих же животных иссекали брыжейку вместе с тонкой кишкой, растягивали на предметном стекле и высушивали в холодильнике на воздухе. Готовый препарат исследовали в бинокулярной лупе МБС-1 при различных увеличениях. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили на световом микроскопе Jenaval (Carl Zeiss, Jena, Germany).
Характеристика эндотоксического шока. Мыши, получившие сенсибилизирующую и, через
ч, разрешающую инъекции бактериального ЛПС (группа 2), становились вялыми и малоподвижными, с взъерошенной и влажной шерстью. В течение 72 ч наблюдения смертность животных составила 80-100 %. В группах 1, 5 и 6 не было зафиксировано ни одного случая падежа (рис. 1), поведение и внешний вид животных не изменялись по сравнению с интактными животными.
В сыворотках крови животных группы 2 через
ч после индукции шока концентрация TNF резко возросла и составила 750 ± 150 пг/мл, затем постепенно снижалась и достигала уровня контрольных образцов к 24 ч. На рис. 2 представлена динамика содержания TNF в сыворотках крови мышей через 1, 3, 6 и 24 ч после индукции шока. Уровень TNF в сыворотке крови животных группы 1 был ниже уровня чувствительности используемой тест-системы (5 пг/мл) на протяжении
Рис. 2. Изменения содержания TNF в сыворотках крови мышей при эндотоксическом шоке, вызванном введением ЛПС (группа 2)
Показаны средние величины и стандартное отклонение средних.
всего периода наблюдения (данные не приведены). Уровень IFNy во всех исследованных образцах сыворотки крови мышей групп 1 и 2 не изменялся в течение периода наблюдения и не превышал уровня чувствительности используемой тест-системы (5 пг/мл) (данные не приведены). Полученные результаты свидетельствуют, что в используемой нами экспериментальной модели развитие эндотоксического шока сопровождается резким ростом продукции TNF.
Гистологическое исследование внутренних органов и брыжейки мышей группы 2 в течение первых трех часов после введения разрешающей дозы ЛПС выявило нарастающие нарушения в системе кровотока, к которым в дальнейшем присоединялись дистрофические и некротические изменения. Наиболее отчетливыми изменения кровотока были в брыжейке, где нарушалось кровенаполнение сосудов микроциркуляторного русла, а после 6-часового периода развивалось запусте- вание просвета артерий и вен. У некоторых животных выявлялись небольшие геморрагии. Нарушения кровотока в брыжейке сохранялись в течение всего периода наблюдения, достигая максимальной степени выраженности через 24-30 ч (рис. 3А). Нарушения микроциркуляции регистрировались в почках, сердце, головном мозге, легких и печени уже через час после индукции эн- дотоксического шока и заметно усиливались к 6 ч наблюдения (рис. 4А). В этот период в миокарде мышей выявлялись крупные участки некроза кардиомиоцитов, становились отчетливыми дистрофические изменения в почках и печени.
Через 24 ч после индукции шока патологические изменения в головном мозге и внутренних органах нарастали. В ткани головного мозга появлялись плазморрагии, сосуды мягкой мозговой оболочки, мелкие сосуды и капилляры нервной ткани были переполнены форменными элементами крови, наблюдался сладж-феномен. В сердце регистрировались крупные очаги некроза кардио- миоцитов, отек стромы, капилляры сердечной мышцы были переполнены эритроцитами, встречались мелкие диапедезные кровоизлияния. В почках наблюдались изменения, указывающие на выраженное нарушение кровообращения и функций органа. Просветы извитых канальцев и собирательных трубочек местами были кистозно расширены, большинство из них было переполнено плотным эозинофильным веществом. Цитоплазма нефроцитов была вакуолизирована. Гломерулярные клубочки набухшие, их капилляры полнокровны. В зоне мозгового вещества просвет канальцев сужен, видны диапедезные кровоизлияния и диффузная лимфоцитарная инфильтрация. Сосуды коркового вещества полнокровны, артерии находились в состоянии спазма, периваскулярные пространства расширены, встречались диапедез- ные кровоизлияния и плазморрагии. В печени и легких также наблюдались отчетливые признаки нарушения кровоснабжения и дистрофических изменений паренхиматозных клеток. В легких выявлялся бронхоспазм, накопление фибрина в просветах альвеол и сосудов.
Через 30 ч после индукции шока характер патологических изменений головного мозга и внутренних органов сохранялся, но степень их нарастала, отражая, в первую очередь, рост нарушений в системе кровоснабжения. В ткани головного мозга появилась диффузная мононуклеарная инфильтрация. В почках регистрировались перивас- кулярные кровоизлияния, плазморрагии и тубу- лодилатация (рис. 4В). В легких сохранялся бронхоспазм, выявлялись признаки васкулита сосудов системы легочной артерии.
Через 48 ч после индукции шока у мышей вышеописанные патологические изменения органов усиливались. В почках отмечались признаки острой почечной недостаточности: коллапс, малокровие гломерулярных клубочков и тубу- лодилатации.
Таким образом, развитие у мышей эндотоксического шока, индуцированного введением ЛПС, сопровождалось нарушениями микроциркуляции и развитием умеренно выраженного геморрагического синдрома; нарастанием дистрофически- некротических изменений в клетках паренхиматозных органов; повреждением эндотелия сосудов и развитием васкулита в сосудах системы легочной артерии; явлениями лейкостаза и формированием фибриновых тромбов; развитием бронхоспазма и ранней стадии острой почечной недостаточности. Эти изменения соответствуют описанным в литературе при развитии экспериментального эндотоксического шока у мышей [1, 6, 7].
В
/
Рис. 3. Кровенаполнение сосудов брыжейки мышей через 24 ч после введения разрешающей дозы ЛПС
А — брыжейка мыши группы 2 (эндотоксический шок); Б — брыжейка мыши группы 4 (введение рекомбинантного белка VARV-CrmB на фоне эндотоксического шока); В — брыжейка мыши группы б (введение рекомбинантного белка VARV-CrmB); Г — брыжейка мыши группы 1 (введение 0,9%-ного раствора хлорида натрия). На рис. А видны кровоизлияния в ткань брыжейки и более выраженное кровенаполнение сосудов. Тотальный препарат. Микрофото, увеличение в 7 раз.
Рис. 4. Ткань легких и почек мышей с эндотоксическим шоком, получивших и не получавших инъекцию рекомбинантного белка VARV-CrmB
А — респираторная ткань легких через 6 ч после введения ЛПС (группа 2). Дистелектаз, васкулит, десквамация эндотелиоцитов. Гематоксилин и эозин, х 400; Б — респираторная ткань легких через 30 ч после введения рекомбинантного белка VARV-CrmB на фоне эндотоксического шока (группа 4). Нормальная воздушность легких, отсутствие патологических изменений паренхимы. Гематоксилин и эозин, х 250; В — паренхима почки после через 30 ч после введения ЛПС (группа 2). Полнокровие, расширение просветов почечных канальцев. Гематоксилин и эозин, х 250; Г — паренхима почки через 30 ч после введения рекомбинантного белка на фоне эндотоксического шока (группа 4). Полнокровие, гиалиновые цилиндры в просветах канальцев. Гематоксилин и эозин, х 400.
Эффект введения рекомбинантного белка VARV-CrmB интактным мышам и на фоне эн- дотоксического шока. Введение животным рекомбинантного вирусного белка VARV-CrmB в дозах
2 мкг/мышь и 2 мкг/мышь не вызывало гибели животных (см. рис. 1, группа 5 и 6) и видимых изменений их поведения и внешнего вида. Гистологическое строение и состояние кровеносного русла внутренних органов, брыжейки (рис. 3В) и головного мозга мышей, умерщвленных через 1, 3, 6, 24, 30 и 48 ч после введения рекомбинантного вирусного белка VARV-CrmB (группа 6), не отличалось от аналогичных показателей у мышей контрольной группы 1 (рис. 3Г). Это свидетельствует об отсутствии токсического действия данного белка на организм при использованной схеме введения.
Введение рекомбинантного белка VARV-CrmB в дозах 0,2 мкг/мышь и 2 мкг/мышь животным с индуцированным эндотоксическим шоком увеличивало выживаемость животных в группах 3 и 4 до 47 ± 10,9 % и 62 ± 8,6 % соответственно (см. рис. 1).
Гистологическое исследование показало, что введение рекомбинантного белка VARV-CrmB мышам с эндотоксическим шоком (группа 4) не оказывает заметного действия на морфологию внутренних органов и головного мозга через 1, 3 и 6 ч после индукции шока. На гистологических срезах и препаратах брыжейки наблюдались такие же нарушения кровотока и дистрофические изменения, как и у мышей группы 2. Но через 24 ч наблюдения появилась заметная тенденция к уменьшению патологических изменений у мышей группы
по сравнению с животными группы 2: степень нарушений кровотока в брыжейке была меньше (рис. 3Б), отсутствовали некрозы миокарда.
Через 30 ч опыта у животных группы 4 интенсивность патологических изменений головного мозга и внутренних органов была существенно ниже, чем у мышей группы 2. Во всех исследованных органах отмечалась нормализация кровообращения, в первую очередь — в сосудах микро- циркуляторного русла. Признаки геморрагического синдрома присутствовали только в легких (рис. 4Б). Наиболее яркие отличия регистрировались в почках (рис. 4Г). Так, если у мышей группы 2 наблюдались спазм артерий, полнокровие сосудов коркового слоя, диапедезные кровоизлияния и плазморрагии, то у мышей группы 4 выявлялось лишь полнокровие сосудов.
Через 48 ч наблюдения у мышей группы 4 отмечалось дальнейшее улучшение состояния внутренних органов и головного мозга по сравнению с мышами, не получавшими белка VARV-CrmB. У животных отмечалась дальнейшая нормализация состояния кровеносной системы всех изученных органов и головного мозга. Таким образом, введение рекомбинантного белка VARV-CrmB мышам с индуцированным ЛПС эндотоксическим шоком приводит к отчетливому улучшению патогистологической структуры внутренних органов по сравнению с животными, не получавшими этого белка.
Анализ полученных данных показывает, что рекомбинантный белок VARV-CrmB вируса натуральной оспы, обладающий TNF-связывающей активностью, ослабляет проявления экспериментального эндотоксического шока у мышей. В частности, введение белка предупреждает появление инфарктов в сердце, снижает степень нарушений кровообращения в сосудах брыжейки, а на более поздних сроках приводит к нормализации микроциркуляции и кровоснабжения головного мозга и внутренних органов, предупреждает развитие острой почечной недостаточности.
Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ, проект 1685р.
Барштейн Ю.А., Персидский Ю.В., Грутман М.И. Взаимосвязь структурной перестройки эндотелия микрососудов печени с изменениями в клетках Куп- фера и гепатоцитах при развитии грамотрицательной инфекции // Арх. па- тол. — 1990. — № 12. — С. 33-38.
Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максютов З.А. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-G2R, содержащая фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующий белок-аналог рецептора TNF, и штамм бакуловируса BTRi67, продуцирующий растворимый рецептор TNF вируса натуральной оспы // Заявка на изобретение № 2002129177 от 31.10.02. Бюл. изобр. — 2004. — № 21. — С. 183.
Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максютов З.А. и др. Сравнительное изучение свойств ортопоксвирусных растворимых рецепторов фактора некроза опухолей // Докл. РАН. — 2003. — № 390. — С. 160-164.
Лебедев Л.Р., Рязанкин И.А., Сизов А.А. и др. Способ очистки антагонистов фактора некроза опухолей и исследование их некоторых свойств // Биотехнология. — 2001. — № 6 — С. 14-18.
Игонин А.А., Кукес В.Г., Пальцев М.А. Сепсис: молекулярные механизмы системного воспаления в качестве модели для изучения перспективных терапевтических мишеней // Мол.мед. — 2004. — № 2. — С. 3-12.
Пермяков Н.К.,Яковлев М.Ю., Галанкин В.Н. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита // Арх. патол. — 1989. — № 5. — С. 3-11.
Черствой Е.Д., Сятковский В.А., Григорьев Д.Г. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при эндотоксиновом шоке // Арх. патол. — 1990. — № 9. — С. 51-56.
Alcami A., Koszinowski U.H. Viral mechanismas of immune evasion // Trends Microbiol. — 2000. — Vol. 8, № 9. — P. 410-418.
Johnston J.B., McFadden G. Poxvirus immunomodulatory strategies: current perspectives // J. Virol. — 2003. — Vol. 77, № 11. — Р. 6093-6100.
Dabbagh K., Xiao Y., Smith C. et al. Local blockade of allergic airway hyperreactivity and inflammation by the poxvirus-derived pan-CC-chemokine inhibitor vCCI // J. Immunol. — 2000. — Vol. 165, № 6. — Р. 3418-3422.
Anderson J.B., Smith S.A., Kotwal G.J. Vaccinia virus complement control protein inhibits hyperacute xenorejection // Transplant. Proc. — 2002 — Vol. 34, № 4. —Р. 1083-1085.
Liu L.Y., Lalani A., Dai E.B. et al. The viral anti-inflammatory chemokine-bind- ing protein M-T7 reduces intimal hyperplasia after vascular injury // J. Clin. Invest. — 2000. — Vol. 105, № 11. —Р. 1613-1621.
Lucas A., Liu L., Macen J. et al. Virus-encoded serine proteinase inhibitor SERP-1 inhibit atherosclerotic plaque development after balloon angioplasty // Circulation. — 1996. — Vol. 94, № 11. — Р. 2890-2900.
P. Gileva, E.M. Malkova, T.S. Nepomnyashchih,I.V. Vinogradov, L.R. Lebedev, G.V. Kochneva, A.A. Grazhdantseva, E.I. Ryabchikova, S.N. Shchelkunov State Scientific Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Novosibirsk region
Effect of recombinant variola virus TNF-binding protein (VARV-CrmB) on endotoxic shock development has been studied using SPF BALB/c mice. Induced by i.p. injection of a sensitizing dose (300 mg/mouse) and re-exposure to 350 mg/mouse of LPS 16 h later, endotoxic shock resulted in 80-100 % mortality during 72 h. The serum TNF level in mice elevated up to 600-800 pg/ml during 1 h after re-injection of LPS and decreased to the level less than 5 pg/ml during next 24 h. IFNy level being less than 5 pg/ml didn't change during whole experimental period. Histological characteristics of heart, brain, lungs, liver, kidneys and mesentery were identical to those observed in mice with endotoxic experimental shock including development of heart and renal failure. Recombinant VARV-CrmB protein was injected i.p. in doses of 0,2 and 2 mg/mouse 30 min before re-injection of LPS. Mice survival increased up to 47 ± 10,9 % and 62 ± 8,6 %, respectively. Histological examination revealed that injection of VARV-CrmB protein prevented development of heart infarction, decreased alteration of blood circulation in microvessels of visceral organs, brain and mesenterium during first 24 h of experiment. Further improvement of microcirculation and blood circulation of brain and visceral organs was observed up to 48 h. Acute renal failure did not develop in mice treated with VARV-CrmB protein. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 1. P. 44-49.)
/