загрузка...
 
Регуляторные эффекты цитокинов при исследовании двигательных функций фагоцитов у детей с травматической болезнью
Повернутись до змісту

Регуляторные эффекты цитокинов при исследовании двигательных функций фагоцитов у детей с травматической болезнью

О.Н. Злакоманова, А.В. Чукичев, А.В. Зурочка

Научно-исследовательский институт иммунологии Челябинской Государственной медицинской академии

В статье обобщаются и анализируются результаты собственных исследований регуляторных эффектов цитокинов на локомоторные функции фагоцитов периферической крови у детей в различные периоды травматической болезни. Обследовано 169 пациентов в возрасте от 6 до 14 лет с травматической болезнью. Результаты свидетельствуют о том, что цитокины оказывают дифференцированное влияние локомоторные функции фагоцитов, характер которого во многом детерминирован их биорегуляторными свойствами. Направленность регуляции определяется этапом воспалительного процесса и его активностью. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 2. С. 30-36.)

Ключевые слова: цитокины, фагоциты, локомоторные функции, травма, дети.

Хемотаксис и хемокинез — одни из важнейших механизмов фагоцитов, определяющих многоплановость их функций в организме. Сложность клеточных и гуморальных механизмов, которые обеспечивают хемотаксис и хемокинез, делает локомоторную функцию одной из самых уязвимых форм реактивности фагоцита [5].

Развитие воспалительного ответа сопровождается привлечением фагоцитирующих клеток. При этом эффективность формирующейся фагоцитарной реакции во многом определяется характером и интенсивностью ее начального этапа — хемотаксиса [1, 3, 7]. Способностью же инициировать хемотаксис и хемокинез обладают различные факторы, в том числе и хемокины [6].

Дефекты хемотаксиса являются одной из основных причин вторичного иммунодефицита при различных заболеваниях (диабет, кожно-слизистый кандидомикоз, болезнь Ходжкина, лепрома- тоз, саркоидоз, цирроз печени, экзематозный и пустулезный дерматит и др.) [7, 8, 12].

Сведения о цитокиновой регуляции хемотакти- ческой функции фагоцитов в различные периоды травматической болезни у детей практически отсутствуют. Цель исследования — изучение влияния цитокинов in vitro на двигательную активность (хемотаксис и хемокинез) нейтрофилов и моноцитов периферической крови у детей в различные периоды травматической болезни.

Материалы и методы

Исследования проведены in vitro на нейтрофилах и моноцитах периферической крови 41 клинически здорового ребенка, 169 детей в различные периоды травматической болезни (острый период (ОП), катаболическую (КФ) и анаболическую фазу (АФ) периода развернутой клинической картины). Нейтрофилы и моноциты выделяли путем центрифугирования периферической крови на двойном градиенте плотности фиколла-верографина [14]. Хемотаксис, хемоки- нез и спонтанную миграцию фагоцитов изучали под агарозой по методу R.D. Nelson еt al. [13]. В качестве хемоат- трактантов были использованы препараты рекомбинантных цитокинов — известных регуляторов иммунного воспаления: IL-1P (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), IL-2 (ронколейкин), IL-8 (НИИ биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова), GM-CSF («лейкомакс», USA), смесь IFNa2(^a2(d) («Мосагроген» НИИ Генетики РАН), естественный цитокиновый комплекс (лейкинферон (Лф), НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) и пептидосодержащее вещество, выделенное с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления на модифицированных селикогелях из А5-фракции нейтрофилокинов [4]. Контролем служил хемотаксис фагоцитов к стандартному хемоаттрактанту — С5а-ком- поненту комплемента сыворотки, активированной зимозаном. Хемотаксис оценивали по изменению движения клеток против градиента концентрации цитокинов, хемокинез — по изменению спонтанного движения клеток в ответ на инкубацию с хемоаттрактантом. Учет результатов исследования осуществляли под микроскопом (увеличение 56) с помощью окулярмикрометра. Результаты исследований обрабатывали на ПК с использованием пакета прикладных программ «Statistica 5.0». Статистическую обработку результатов исследований проводили стандартными методами, с определением средней арифметической вариационного ряда (М), среднеквадратичного отклонения (о) и ошибки средней арифметической (т). О достоверности различий средних величин судили по ^критерию Стьюдента с использованием таблиц граничных значений по Вебер [2]. На рисунках приведены средние арифметические.

 

 

Результаты и обсуждение

Для оценки влияния цитокинов на локомоторную функцию большое значение имеет исходное состояние клетки: возможные повреждения, нарушения метаболизма, уровень экспрессии соответствующих рецепторов. В этой связи необходимо было уточнить роль цитокинов в регуляции кинетической функции нейтрофилов и моноцитов у здоровых детей.

Практически все исследуемые хемоаттрактанты (рис. 1-2) обладают выраженной хемоаттрактант- ной активностью, сила которой не уступает, а у ряда веществ (^-ір, ^-2) даже превосходит таковую стандартного хемоаттрактанта — С5а-фраг- мента комплемента. Лишь смесь №Ма2(с)а2^) инициировала достоверно (< 0,001) более низкую локомоторную активность по сравнению как с контролем, так и с другими регуляторами. Низкий хе- мотаксический потенциал смеси №Ма2(с)а2^) по сравнению с другими модуляторами миграционной функции, возможно, связан с частичным экранированием эффектов цитокинов, причиной которого являются общие рецепторы для ряда цитокинов. Например, ^-1 в и ГРМа2(с)а2^) имеют общий рецептор. В этом случае разница в действии цитокина при сохранении направленности обусловлена неодинаковым сродством к цитокину. Невысокое сродство смеси №Ма2(с)а2^) к рецептору и определяет умеренную хемотаксическую реакцию клеток, индуцируемую данным цитокином.

Необходимо подчеркнуть, что изучаемые регуляторы иммунного воспаления инициируют достоверно более выраженный хемотаксис у моноцитов. При этом ^-ір, ^-2 и GM-CSF обладают наибольшим хемоаттрактантным эффектом.

Оценивая хемокинетикотропный эффект модуляторов миграционной функции следует подчеркнуть, что все исследуемые биомодуляторы снижали хемокинез фагоцитов здоровых детей, и уровень хемокинеза был достоверно ниже спонтанной миграции данных клеток (рис. 3-4).

Таким образом, в результате проведенных исследований нами установлено, что изучаемые регуляторы иммунного воспаления обладают выраженными хемокинетикотропными свойствами по отношению как к нейтрофилам, так и к моноцитам здоровых детей. Однако при непосредственном воздействии биорегуляторов данные клетки реагируют снижением двигательной активности.

С5а И-1 ІІ-2 И-8 йМ-СБР ІЧР Лф А5

— Нейтрофилы здоровых детей

Рис. 1. Хемотаксис нейтрофилов здоровых детей к регуляторам иммунного воспаления

 

 

Рис. 4. Хемокинетическая реакция моноцитов здоровых детей при воздействии регуляторов иммунного воспаления

Учитывая, что исследуемые биологически активные вещества тем или иным образом влияют на двигательную активность фагоцитов в норме, возникает вопрос, насколько и каким образом будет изменяться регуляция кинетической функции нейтрофилов и моноцитов под влиянием данных веществ in vitro у детей в условиях травматической болезни.

Механическая травма вызывает индуцированную форму вторичного иммунодефицитного состояния, характеризующегося изменениями активности иммунокомпетентных клеток, и приводит к расстройству их цитокиновой регуляции [4, 9—11]. Нами установлено, что нейтрофилы и моноциты по-разному реагируют на изучаемые биологически активные вещества в различные периоды травматической болезни.

При исследовании хемотаксиса фагоцитов детей с травмой к стандартному хемоаттрактанту С5а мы наблюдали достоверное снижение индекса хемотаксиса в остром периоде приблизительно в 1,5 раза у нейтрофилов и в 1,2 раза — у моноцитов (см. рис. 3-4). В последующие периоды отмечали четкую тенденцию роста целенаправленной миграции как нейтрофилов, так и моноцитов, уровень которой, однако, в анаболической фазе еще не достигал нормы. Такой тип реакции клеток в процессе развития травматической болезни мы расценивали как «стандартный» (рис. 5).

Сопоставляя изменения хемотаксиса фагоцитов у детей с травмой в различные периоды болезни к исследуемым модуляторам, нами были обнаружены 3 типа ответной реакции клеток на изучаемые вещества:

й    тип — угнетение хемотактической активности фагоцитов во все периоды травматической болезни с максимальной выраженностью в анаболическую фазу. Такой профиль хемотактической реакции нейтрофилов наблюдался к провоспали- тельному цитокину IL-8, а со стороны моноцитов — к лейкинферону (рис. 6).

й    тип — максимальное снижение хемотаксиса в катаболическую фазу и тенденция к нормализации — в анаболическую фазу. Данную ответную реакцию регистрировали к IL-1P, GM-CSF и лейкинферону у нейтрофилов, а у моноцитов — к IL-2 и GM-CSF (рис. 7).

И, наконец, для 3-го типа было характерно волнообразное изменение хемотактической чувствительности фагоцитов — угнетение хемотаксиса в острый период и анаболическую фазу и увеличение — в катаболическую фазу. Такой профиль реагирования регистрировали у нейтрофилов к А5-фрак- ции, а у моноцитов — к IL-1 в, IL-8 и А5-фракции (рис. 8). При этом, в отличие от нейтрофилов, максимальное угнетение хемотактической активности моноцитов к А5-фракции отмечали не в остром периоде, а в анаболическую фазу периода развернутой клинической картины заболевания.

Профиль ответной хемотактической реакции нейтрофилов к IL-1 в и смеси IFNa2(^a2(d) и моноцитов— к смеси IFNa2(^a2(d) был схож со «стандартным». Однако амплитуда колебания по-

2,5-г

1 ?-

0,5 

О    1    1    1

Норма     ОП   КФ   АФ

- -ф- —Нейтрофилы  —?   Моноциты

 

Рис. 5. Стандартный тип ответа фагоцитов на хемоаттрактанты

- -О-     Нейтрофилы    —?   Моноциты

 

Рис. 6. «Первый» тип ответа фагоцитов на хемоаттрактанты

- -ф-     Нейтрофилы    —?   Моноциты

 

Рис. 7. «Второй» тип ответа фагоцитов на хемоаттрактанты

- -0-     Нейтрофилы    —?   Моноциты

 

Рис. 8. «Третий» тип ответа фагоцитов на хемоаттрактанты

казателя хемотаксиса нейтрофилов к ^-1р и смеси №Ма2(с)а2^) в остром периоде механической травмы была более низкой, а у моноцитов — наоборот, более высокой. Так, хемотактическая активность нейтрофилов к ^-1р снижалась в остром периоде в 1,4 раза и к смеси №Ма2(с)а2^) — в 1,1 раза, а хемотаксис моноцитов угнетался соответственно в 1,72 и в 1,9 раза.
Таким образом, в различные периоды травматической болезни фагоциты по-разному реагируют на изучаемые биологически активные вещества. Однако, в целом, после травмы происходит снижение целенаправленного движения фагоцитов как к стандартному хемоаттрактанту, так и к изучаемым биомодуляторам. Последнее, вероятнее всего, обусловлено изменением состояния рецепторного аппарата нейтрофилов и моноцитов после повреждения тканей. Угнетение целенаправленной миграции к изучаемым веществам, на наш взгляд, обусловлено уменьшением числа функционирующих (обладающих высоким сродством к цитокину) мембранных рецепторов. Максимальное снижение активности рецепторов наблюдали в острый период травматической болезни. По мере стихания асептического воспаления отмечалась четкая тенденция к регрессу двигательных нарушений данных клеток.

Неоднозначность изменения степени активации двигательной функции фагоцитов к цитокинам, по нашим данным, во многом зависит от биологического значения цитокинов. Воспринимающая способность нейтрофилов к провоспалительным ци- токинам — ^-1, ^-8 и GM-CSF в период разгара заболевания более высока по сравнению со «стандартным» профилем. В анаболическую фазу чувствительность к ^-1 и GM-CSF остается повышенной, тогда как к ^-8 она резко снижается. Аналогичной динамикой рецепции обладают нейтро- филы и по отношению к лейкинферону. Восприятие же нейтрофилами противоспалительного ци- токина — ^-2, а также смеси IFNa2сa2d, во все наблюдаемые периоды травматической болезни снижается, особенно в ее острой стадии. И, наконец, рецепторная чувствительность полиморфноядерных лейкоцитов к А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов изменялась волнообразно — снижалась в острый период и анаболическую фазу и незначительно повышалась в катаболическую фазу.

Важно подчеркнуть, что по сравнению со стандартным хемоаттрактантом С5а, рецепция нейт- рофилами здоровых детей ^-1р и ^-2 достоверно возрастает. В процессе развития асептического воспаления эта тенденция сохраняется к про- воспалительному цитокину — ^-1р, а к ^-2 — наоборот, снижается. Последнее, по-видимому, отражает его биологическое значение.

В то же время, ^-8, являющийся, по данным многих авторов, «профессиональным» хемокином, у обследуемых нами здоровых детей не усиливал хемотаксис нейтрофилов. Однако в острый период и фазу катаболизма посттравматической деструкции полностью реализовывал свой стимулирующий потенциал как активного хемоаттрактан- та и, наоборот, утрачивал его в период стабилизации травматического процесса.

Что же касается смеси интерферонов, то в норме рецепция нейтрофилов к ней снижена по сравнению с контролем. Аналогичная ситуация наблюдается и при развитии асептического воспаления, однако необходимо все-таки отметить умеренное повышение уровня рецепции, особенно в остром периоде.

Особое место среди исследуемых биологических факторов занимает GM-CSF. Если у здоровых детей чувствительность нейтрофилов к этому веществу мало повышается, то при тканевой деструкции отмечается максимальный рост экспрессии рецепторов клеток к нему, что подчеркивает его выраженное провоспалительное действие. И, наконец, рецепция нейтрофилов к А5-фракции, выделенной из супернатантов активированных ней- трофилов, практически не изменялась после травмы, если не принимать во внимание незначительный ее рост в катаболическую фазу.

При анализе воспринимающей способности моноцитов к изучаемым веществам во многом наблюдалась диаметрально противоположная картина. Рецепторная чувствительность моноцитов здоровых детей ко всем без исключения биологически активным веществам была достоверно выше таковой по отношению к контролю (С5а). Наиболее выраженное увеличение индекса хемотаксиса этих клеток наблюдалось к провоспали- тельным цитокинам — ^-1р и GM-CSF. При механической травме воспринимающая способность рецепторов моноцитов изменялась, резко снижаясь к ^-1р в остром периоде болезни и постепенно восстанавливаясь в последующие стадии. К другим провоспалительным цитокинам — ^-8 и GM-CSF — рецепция оставалась сниженной на протяжении всех периодов травматической болезни, особенно в ее анаболическую фазу. Прогрессивное снижение чувствительности рецепторного аппарата к смеси интерферонов IFNa2(с)a2(d), а также к лейкинферону отмечено во все периоды травматической болезни. Наиболее выраженное снижение рецепции к лейкин- ферону наблюдалось в анаболическую фазу, а к смеси интерферонов — в острый период патологического процесса. Для изменения чувствительности моноцитов к А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов был характерен волнообразный профиль. Снижение рецепции к данному веществу в остром периоде сменялось незначительным ростом в фазу катаболизма и еще более выраженным ее угнетением в анаболическую стадию болезни.

Анализируя полученные данные, следует подчеркнуть, что изменения чувствительности рецепторного аппарата нейтрофилов и моноцитов к ^-2, А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов и смеси IFNa2(с)a2(d) имеют однотипную тенденцию во все исследуемые периовернутой клинической картины. В анаболическую фазу травмы двигательная активность этих клеток под воздействием биомодулятора не превышала спонтанную подвижность.

Динамика изменений хемокинетикотропной активности моноцитов под воздействием биологически активных веществ также имела свои особенности. ^-1Р, IL-2, GM-CSF, смесь IFNa2(с)a2(d) и А5-фракция оказывали стимулирующее действие на двигательную функцию моноцитов во все периоды после механической травмы, но наиболее ярко эта стимуляция проявлялась в остром периоде.

Под воздействием лейкинферона отмечали некоторое снижение хемокинеза моноцитов по сравнению со спонтанной подвижностью этих клеток в остром периоде. В последующие периоды травматической болезни данные биорегуляторы индуцировали локомоцию моноцитов.

Моноциты оставались толерантными в остром периоде болезни к действию ^-8. В катаболичес- кую фазу отмечали умеренную стимуляцию хе- мокинеза, которая сменялась в анаболическую стадию угнетением ненаправленной подвижности.

Таким образом, цитокины оказывают дифференцированное влияние на хемокинетическую функцию фагоцитов, характер которого во многом детерминирован их биорегуляторными свойствами. Направленность регуляции определяется этапом воспалительного процесса и его активностью. Вызываемое большинством исследуемых регуляторных факторов торможение миграции нейтро- филов и моноцитов в место проникновения патогена предотвращает гиперактивацию данных клеток, сопровождающуюся истощением их функциональных возможностей и развитием иммунопатологических реакций. Кроме этого, нейтро- филы и моноциты сами регулируют степень своей чувствительности к цитокинам, сбрасывая в состоянии гиперактивации рецепторы к ним. При этом снижение экспрессии рецепторов может происходить как в результате шеддинга, так и путем их интернализации внутри клетки. Слущен- ные с поверхности нейтрофилов рецепторы становятся своеобразными ловушками для цитоки- нов, снижая уровень их воздействия на чувствительные клетки.

Изучаемые биомодуляторы в норме не стимулируют хемокинез. Более того, они вызывают некоторую двигательную гипофункцию, что вполне логично, так как цитокины оказывают стимулирующее влияние только на чувствительные клетки. Различная динамика хемокинетикотропной активности фагоцитов, наблюдаемая после механической травмы, вероятнее всего, связана с изменением чувствительности рецепторного аппарата по мере развития воспалительного процесса.

Известно, что факторы, инициирующие воспаление, являются одновременно и индукторами иммунитета, на что указывал еще И.И. Мечников, рассматривая воспалительные реакции как «механизм для защиты против атаки бактерий и для охраны неприкосновенности организма». Доказано, что цитокины, в особенности про- воспалительные, участвуют в обеспечении антибактериальной защиты. Для реализации этой функции клетки должны иметь достаточное количество активных (функционирующих) рецепторов к цитокинам. Дефицит же их может привести к формированию иммунодепрессии, сопровождающейся повышенной чувствительностью к инфекции. С другой стороны, чрезмерное воспаление, запускаемое провоспалительными цитокинами, сопряжено с избыточной продукцией и секрецией агрессивных высокоактивных радикалов и может привести к массивным повреждениям клеток и тканей организма. В связи с этим система противовоспалительных (деактивирующих и ингибирующих) цитокинов чрезвычайно важна и физиологически оправдана для контроля регуляции воспалительного процесса. Длительные нарушения рецепторного поля, особенно к противовоспалительным ци- токинам, могут привести к развитию хронического воспаления и истощению функциональной активности фагоцитов.

Механическая травма вызывает изменение хемотаксиса фагоцитов к различным регуляторам иммунного воспаления уже в остром периоде болезни, от которого во многом зависит дальнейшее течение заболевания. Именно в этот период наблюдалась гиперчувствительность нейтрофилов к провоспалительным цитокинам, за исключением ^-2. У моноцитов в этот период отмечали угнетение их чувствительности ко всем исследуемым регуляторам миграционной функции.

При непосредственном воздействии биомодуляторов нами также было выявлено изменение восприимчивости фагоцитов, при этом нейтрофи- лы реагировали снижением чувствительности ко всем исследуемым регуляторам, а моноциты, наоборот, некоторым повышением воспринимающей способности.

Анализируя результаты исследований восприимчивости нейтрофилов и моноцитов к исследуемым регуляторным факторам, необходимо отметить, что нейтрофилы уже в острую, а моноциты — в катаболическую стадию травматической болезни утрачивают способность регулировать степень своей чувствительности к ци- токинам, обнаруживая либо гипервосприимчи- вось, либо резкое угнетение восприимчивости к действию биорегуляторов. Наблюдаемое явление может привести к истощению функциональных возможностей фагоцитов и развитию дисфункции иммунной системы и повышению чувствительности к инфекции.

Заключение

Целенаправленная двигательная активность клеток — сложный и динамичный процесс, изменяющийся под влиянием разнообразных факторов как in vivo, так in vitro. Нечувствительность к хемотаксическому стимулу может обусловливать неэффективность элиминации чужеродного агента или быть причиной ряда заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

Галанкин В.Н., Токмаков А.М., Боцманов К.В. О структурных основах снижения неспецифической антибактериальной резистентности организма, связанной с функционированием системы нейтрофильного лейкоцита // Арх. патол. — 1989. — № 3. — С. 49-54.

Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. — М.: Практика,

— 459 с.

Долгушин И.И., БухаринО.В. Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург УрО РАН, 2001. — 277 с.

Зурочка А.В. Иммунобиологические свойства секреторных продуктов нейт- рофилов (нейтрофилокинов). — Дисс. ... докт. мед. наук. — СПб., 1991. — 231 с.

Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. — Новосибирск: Наука, 1989. — 344 с.

Ковальчук Л.В., Сайгитов Р.Т. Хемокины — новое семейство цитокинов, регулирующих миграцию лейкоцитов // Ж. микробиол. эпедимиол. иммуноби- ол. — 2000. — № 1. — С. 69-70.

Серов В.В. Иммунологические и иммунопатологические аспекты воспаления // Воспаление: Руководство для врачей — М., 1995. — С. 219-240.

Учитывая такое значение двигательной функции фагоцитов в защите организма, возникает необходимость коррекции нарушений миграционной способности клеток, развивающихся после травмы, а разнообразность и сложность дефектов двигательной активности фагоцитов определяет необходимость поиска конкретных методов и способов их коррекции в различные периоды травматической болезни.

 

Стефани Д.В., Вельтищев Ю.Е. Клиническая иммунология и иммунопатология детского возраста: Руководство для врачей — М.: Медицина, 1996. — 384 с.

Студеникина Ю.Н. Значение исследованния локомоторной функции нейтро- филов в определении вида возбудителя. — Дисс. ... канд. мед. наук. — Челябинск, 2000. — 215 с.

Фрейдлин И.С. Прикладные аспекты современного учения о цитокинах: Лекция // Тихоокеанский мед. ж. — 1999. — № 3. — С. 13-19.

Чукичев А.В. Иммунобиологическая активность нейтрофилов при травматической болезни. — Дисс. ... докт. мед. наук. — Челябинск, 1996. — 325 с.

Maderazo E.F., Anton T., Ward P.A. Serum-associated leukocyte migration abnormalities and their significance in seriosly traumatized patients // Ann. Surg. — 1983. — Vol. 198. — P. 738-739.

Nelson R.D., Quie P.G., Simmons R.L. Chemotaxis under agarose: A new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes // J. Immunol. — 1975. — Vol. 115, № 6. — P. 1650-1656.

Wong L., Wilson J.D. The identification of Fc and C3 receptors on human neutrophils // J. Immunol. Methods. — 1975. — Vol. 7. — P. 69-76.

 

Regulatory effects of cytokines on phagocytes locomotory functions in children with traumatic disease

O.N. Zlakomanova,A.V.Chukichev,A.V. Zurochka Institute of Immunology of the State Medical Academy, Chelyabinsk

Regulatory effects of cytokines on locomotory functions of phagocytes in children's peripheral blood during distinct periods of traumatic disease are summarized and analyzed in this article. 169 patients aged from 6 to 14 years with traumatic disease were examined. The results show that cytokines differentially influence locomotory functions of phagocytes according to their bioregulatory properties. The vectors of regulation depend on the stage of inflammatory process and its activity. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 2. P. 30-36.)

Key words: cytokines, phagocytes, locomotory functions, trauma, children.

V конференция иммунологов Урала



загрузка...