загрузка...
 
Влияние введения эритропоэтина на экспрессию генов цитокинов (^-10, ^-1Р, ЕРО-Р) в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях и их функциональные параметры у мышей
Повернутись до змісту

Влияние введения эритропоэтина на экспрессию генов цитокинов (^-10, ^-1Р, ЕРО-Р) в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях и их функциональные параметры у мышей

Е.В. Якушенко, А.Ф. Повещенко, Е.В. Маркова, Н.А. Короткова,

В.В. Абрамов, В.А. Козлов ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск

Известно, что цитокины являются медиаторами различных процессов не только в иммунной и гемопоэтической системах, но также опосредуют процессы пролиферации, дифференци- ровки и функционирования клеток других систем, в том числе и нервной ткани.

Целью данной работы было исследование характера изменений экспрессии одних и тех же генов (^-1Р, ^-1И, ЕРО-И) в лимфоидной, гемопоэтической и нервной тканях после введения рекомбинантного человеческого эритропоэтина (ЕРО). ЕРО использовался в качестве фактора, стимулирующего гемопоэз, а также иммунопоэз и процессы функциональной активности в нервной ткани, как показано в ряде последних работ. ЕРО вводили в дозе по 10 ед. 3 раза через день подкожно. мРНК генов ^-1р, ^-1И, ЕРО-И выделяли из клеток селезенки, костного и головного мозга мышей (СВАхС57В1^1 через 1 сут. после последнего введения ЭП. Определение уровня экспрессии мРНК генов ^-1р, ^-1И, ЕРО-И проводили с использованием метода ИТ-РСИ.

Итак, нами было показано, что введение ЕРО: 1) в клетках селезенки увеличивает уровень экспрессии всех указанных генов; 2) в костном мозге не оказывает достоверного влияния на уровень экспрессии генов ^-1р и его рецептора ^-1И, но стимулирует уровень экспрессии гена рецептора ЕРО (ЕРО-И); 3) в головном мозге подавляет уровень экспрессии генов ^-1р и ^-1И и стимулирует экспрессию гена ЕРО-И. Известно, что многие цитокины, в том числе ^-1 и ЕРО, определяют активность клеток иммунной, гемопоэтической и нервной тканей, в связи с чем изучали функциональные параметры перечисленных тканей после введения ЕРО. В данной работе исследовали, как изменяются эффекторные функции указанных органов в ответ на введение ЕРО в сопоставлении с экспрессией названных генов. В селезенке мышей на фоне усиленной экспрессии всех изучаемых генов наблюдали стимуляцию гуморального иммунного ответа, который тестировали с помощью подсчета АОК. В костном мозге введение ЕРО привело к увеличению количества КОЕс-8, причем мы предполагаем, что это увеличение связано с повышением доли эритроидных предшественников, на которые и оказывает влияние ЕРО. Влияние ЕРО на поведение животных мы исследовали в тесте «открытое поле». Исследовательская активность мышей в этом тесте была значительно повышена по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ЕРО на эффекторные функции нервной системы, причем происходит это на фоне повышенного уровня экспрессии гена рецептора ЕРО и сниженного уровня экспрессии гена провоспалительного цитокина ^-1р и его рецептора в клетках головного мозга животных. Эти данные свидетельствуют о том, что ЕРО влияет на функции органов лимфоидной, гемопо- этической и нервной тканей и свой эффект он может опосредовать через изменение уровня экспрессии генов ^-1Р, ^-1И, ЕРО-И.

 

Цитокины: IL-1, рецепторный антагонист IL-1(IL-1Ra),

IL-4, IL-8, TNFa, G-CSF, IFNa, IFNy Компоненты комплемента: С3, С4, С5, С3а, С5а, Cl-ингибитор, фактор Н Полная комплектация, включая 96-луночные планшеты, стандартные образцы, буферные растворы, окрашивающие реагенты, подробные инструкции. Высокая чувствительность, низкие цены, доставка по России курьерской почтой. 197110, Россия, Санкт-Петербург, Пудожская ул., д.7

Тел. (812)230-48-88, тел./факс (812)230-49-46, E-mail:

 

 


МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА ЦИТОКИНОВ

 

 

 

 

Active repression of IL-5 transcription by the glucocorticoid receptor involves histone deacetylase recruitment

Y.-K. Jee, P. Lavender Department of Allergy, Guy's Hospital, King's College London. UK

Glucocorticoids are the mainstay of therapy for asthma. It is known that Th2 cytokines, including interleukin (IL)-4 and IL-5 are transcriptionally repressed following steroid administration, however, the mechanism of repression has been unclear. In previous studies we have suggested that the glucocorticoid receptor (GR) might mediate transcriptional repression of GM-CSF via binding to non-consensus NFAT/AP-1 response elements located within a distal enhancer. Here, we have tested whether this model is true for other cytokine genes. Accordingly, GR repression of IL-5 transcription is mediated by an NFAT/AP-1 response element located within the proximal promoter. Transcriptional repression can be partially relieved by treatment with the HDAC inhibitor TSA, and enhanced by co-expression of HDAC1. Furthermore, we show that GR, HDAC1 and Sin3 are able to form a complex in vivo. These data suggest that repression of cytokine transcription is an active process involving histone deacetylation.

Identification and characterisation of new JNK inhibitors

P. Juillard, V. Potier, A. Nichols, M. Camps, P. Gaillard, Y. Chvatcko,

S. Arkinstal, J.-P. Gotteland Serono Pharmaceutical Research Institute, 14, Chemin des Aulx 1228, Plan-Les- Ouates, Geneva, Switzerland

The c-Jun N-terminal Kinase (JNK) signalling pathway plays a key role in the activation of transcription factors such as c-Jun and ATF2 in various cell types, which in turn regulates diverse biological processes.

A proprietary drug discovery program was therefore initiated aimed at discovering JNK inhibitors for the treatment of diverse inflammatory diseases. A new, potent and selective JNK inhibitor (hJNK3, Ki = 50 nM) was selected and further evaluated in vitro and in vivo. This compound was established to be highly potent in cells (c-jun reporter gene, IC50 = 50 nM) and reduced LPS-induced TNFa secretion by murine bone marrow derived macrophages. In vivo, the inhibitor demonstrated a dose response inhibition of circulating TNFa levels when orally administered in LPS-treated mice (70 % at 20 mg/kg). Further characterisation of this compound will be presented proving the value of JNK inhibitors as new chemical entities for the treatment of inflammatory diseases.

Конструирование и экспрессия гуманизированных антицитокиновых антител для лечения инфекционных и иммуно-опосредованных заболеваний

В.П. Завьялов1, Т.К. Алиев2, В.Г. Коробко2, А.А. Панина2, Л.Е. Петровская2, Л.Н. Шингарова2, С.В. Беневоленский3, Д.Г. Козлов3, А.Н. Марченко3,

Г.А. Завьялова4, А.М. Чугунов4, С.Ф. Аверин4, Л.А. Денисов4 всероссийский центр молекулярной диагностики и лечения, Москва; 2Институт биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва;

3ГНЦ НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва;

4Центр инженерной иммунологии, Любучаны, Московская область

Пять больных, зараженнных спорами сибирской язвы в результате прошлогодней террористической атаки в США, погибли, несмотря на интенсивную антибиотикотерапию. Эта гибель связана с действием летального токсина, который провоцирует гиперпродукцию TNFa макрофагами, приводящую к септическому шоку и смерти. рН6-антиген возбудителя чумы также индуцирует секрецию TNFa макрофагами. Поэтому логично использовать нейтрализующие TNFa моноклональные антитела (мАТ) для лечения инфекций, вызываемых этими потенциально наиболее опасными и доступными агентами биотерроризма. Однако, имеющееся на рынке анти-TNFa мАТ (INFLIXIMAT, производимое Centocor) имеет химерную природу (мышь—человек) и вызывает существенную продукцию человеческих анти- химерных антител. Мы клонировали и секвенировали мышиное анти-TNFa мАТ F10, которое связываало TNFa с высоким сродством (Kd = 5,86х1010 M-1) и нейтрализовало его цитотоксичность. Построена модель пространственной структуры Fv части мАТ F10. Химерное мышь-человек мАТ сконструировано с использованием константной части Н-цепи IgG2 человека, чтобы снизить способность мАТ активировать воспалительные реакции. Химерный Fab-фрагмент был экспрессирован в E. coli и S. cerevisiae. Целое химерное мАТ было экспрессировано в клетках почек CHO, COS и Н1299. Наилучшая экспрессия была получена в клетках CHO. Мышиные FW-участки химерного мАТ были заменены на FW-участки из консенсусной последовательности Vl и Vh доменов человека. Гуманизированное мАТ было экспрессировано в клетках CHO. Аффинность гуманизированного мАТ была практически такой же, как и у мышиного мАТ F10.

Все доступные в настоящее время на рынке мАТ производятся с помощью культур клеток млекопитающих. Но такая продукция имеет высокую стоимость. Производство же биологически активного мАТ с помощью дрожжей ограничено проблемой правильного гликозилирования Fc субъединицы. Однако для нейтрализации воспалительных цитокинов Fab-фрагмент может быть более выгодным по сравнению с целым мАТ, так как он практически лишен способности активировать воспалительные реакции. Мы клонировали и секвенировали мы-

 


шиное анти-IFNy мАТ H3-1, которое связывало IFNy с высоким сродством (Kd = 4,2х10п М-1). Построена модель пространственной структуры Fv части мАТ H3-1. Для производства секрети- руемой формы химерного Fab-фрагмента клетки штамма S. cerevisiae, несущего экспрессионные кассеты для продукции химерных L- и H-цепей (Fd части), выращивали на среде YPDG. Уровень экспрессии составил около 20 мг на литр. Очистка была достигнута с помощью простой трехступенчатой процедуры. Аффинность химерного Fab-фрагмента была практически такой же, как у мышиного мАТ H3-1.

Данная работа выполнена по контракту № 403662-G2 с Тихоокеанской Северо-Западной Национальной лабораторией департамента энергетики США.

Экспрессия альтернативных форм мРНК IL-4 и IL-6 в эритроидных клетках человека

А.Н. Силков, С.В. Крысов, Т.В. Инжелевская, С.В. Сенников, В.А. Козлов ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск

Установлено, что эритроидные клетки человека и мыши, наряду с другими клетками кроветворной и иммунной систем, способны экспрессировать мРНК ряда цитокинов и продуцировать сами медиаторы. Эти данные позволяют рассматривать клетки эритроидного ряда как регуляторные клетки, цитокин- синтезирующая активность которых во многом определяет пролиферацию и дифференцировку клеточных элементов в ге- мопоэтических органах. В работах ряда авторов доказано участие механизмов альтернативного сплайсинга мРНК в образовании различных вариантов цитокинов в иммунокомпетентных клетках, которые могут играть существенную роль в тканеспецифической экспрессии изоформ цитокинов. В работах W.J. Alms et.al (1996) и D.P. Kestler (1995) et al. продемонстрировано, что в экспрессии генов IL-4 и IL-6 в мононуклеарных клетках человека участвуют механизмы альтернативного сплайсинга с образованием альтернативных форм мРНК с де- лецией второго экзона, которые авторами названы IL-482 и altIL-6. Показано, что рекомбинантные белковые продукты альтернативных вариантов значительно отличаются по своим биологическим эффектам от полноразмерных форм. Целью настоящего исследования было изучение экспрессии альтернативно сплайсированных вариантов мРНК цитокинов в эритро- идных клетках костного мозга и фетальной печени человека, поскольку именно в этих органах эритроидные клетки являются доминирующим компонентом микроокружения клеток- предшественников и могут активно участвовать в процессах регуляции гемо- и иммунопоэзов.

Материалом исследования послужили эритроидные ядросодержащие клетки человека, выделенные из костного мозга здоровых доноров и фетальной печени, а также эритроидные клетки из отдельных КОЕ-Э. Экспрессию мРНК IL-4 и IL-6 оценивали методом RT-PCR. Использованные праймеры позволяли амплифицировать последовательности указанных цитокинов с первого по четвертый экзоны. Продукцию цитокинов оценивали с помощью меченных поли- и моноклональных антител элек- трохемилюминисцентным методом. Установлено, что эритроид- ные ядросодержащие клетки человека продуцируют IL-4 и IL-6. Так как в настоящее время еще не разработаны методические подходы для идентификации изоформ этих цитокинов на уровне белка, мы изучили их экспрессию в эритроидных клетках на уровне мРНК с помощью техники RT-PCR. Продемонстрировано, что эритроидные ядросодержащие клетки экспрессируют как полноразмерные, так и альтернативные формы мРНК IL-4 и IL-6, причем эти изоформы обнаружены как в клетках фетальной печени, так и в клетках костного мозга. Факт наличия мРНК IL-482 и altIL-6 подтвержден на эритроидных клетках отдельных колоний (КОЕ-Э), выращенных из клеток костного мозга и фетальной печени человека.

Таким образом, установлено, что эритродные ядросодержащие клетки фетальной печени и костного мозга человека продуцируют IL-4 и IL-6. Причем на уровне мРНК в этих клетках экспрессируются как полноразмерные, так и альтернативно- сплайсированные формы. Предполагается, что, используя механизмы альтернативного сплайсинга, эритроидные клетки могут участвовать в тонких механизмах регуляции гемо- и имму- нопоэза как на ранних этапах онтогенеза, так и во взрослом состоянии.



загрузка...