В цитокиновый пул тимуса вносят вклад все его структурные элементы.
Данные о выработке цитокинов различными клетками тимуса суммированы в табл. 1.
Стромальные клетки мезенхимального происхождения. Менее всего конкретных сведений о вкладе во внутритимусный цитокиновый пул элементов соединительнотканной стромы. A priori представляется наиболее вероятным, что в этом отношении соединительнотканная строма тимуса аналогична строме костного мозга, которая, как известно, служит источником гемопоэтических факторов. Стромальные клетки тимуса, вероятно, фиб- робласты, являются источником цитокинов, ответственных за ранние этапы гемопоэза — фактора стволовых клеток (SCF) и Flt-3-лиганда, мишени которых присутствуют в субкапсулярной зоне тимуса [2, 70, 71]. В эмбриональном периоде в стромальных клетках тимуса обнаружена экспрессия мРНК SCF, IL-1a, GM-CSF [48]. Экспрессия мРНК GM-CSF в фибробластах индуцируется под влиянием IL-1 в, но слабее, чем в эпителиальных клетках. В то же время относительно выработки этими клетками наиболее важного в функциональном отношении цитокина тимуса — лимфо- поэтина IL-7 нет единого мнения: в них не обнаружено экспрессии мРНК этого интерлейкина [62]; с другой стороны, сообщалось о его выработке фиб- робластами субкапсулярной зоны. Считается, что эти клетки презентируют (с участием межклеточного матрикса) IL-7 главным мишеням этого фактора — CD44+CD25+-тимоцитам [68]. Вероятно, фибробласты тимуса вырабатывают некоторые хемокины, однако прямые данные на этот счет отсутствуют. Наконец, эти клетки служат основным источником ростовых факторов — эпидермального (EGF), тромбоцитарного (PDGF) и фибробласт- ного (FGF) [74], а возможно, и других, содержат мРНК трансформирующего фактора роста (TFR) Р2 и Р3 [63]. Какие-либо подробности относительно индукции и регуляции выработки цитокинов клетками соединительнотканной стромы неизвестны.
Тимусные эпителиальные клетки (ТЭК). ТЭК служат основным источником цитокинов в тимусе. Цитокины, вырабатываемые ТЭК, можно разделить на 6 групп: гемопоэтины (IL-7, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, SCF, IL-15 [19, 47, 48, 50, 80, 99]), провоспа- лительные цитокины (IL-1 а и в, TNFa, IL-6 [19, 46, 47, 99]), цитокины семейства IL-6 (помимо уже упомянутого IL-6, лейкемия-ингибирующий фактор — LIF и онкостатин М — OSM), супрессорные цитокины (TGFP подклассов 1-3 [79]) и хемокины группы CXC (а) — SDF-1, IP-10, MIG, ITAC и группы (в) — TECK, SLC, МСР-1, MDC, ELC, TARC, I-309, эотак- син [5, 12, 18, 40, 51, 56, 59, 66, 93, 100].
Наибольшей секреторной активностью обладают ТЭК субкапсулярной и медуллярной зон, которые являются производными эктодермы [37]. Хотя при описании секреции цитокинов in vitro не всегда указывается гистогенетическая природа ТЭК, вырабатывающих цитокины, практически во всех случаях, когда эта природа указана, в качестве клеток-продуцентов выступают медуллярные или субкапсулярные ТЭК. Лишь в единичных работах сообщается о секреции кортикальными ТЭК IL-1 и других цитокинов [23]. Описаны линии клеток тимуса со свойствами кортикальных ТЭК, которые секретируют in vitro IL-1a, IL-6, IL-7, GM-CSF [27].
В кортикальных ТЭК эмбрионов мышей выявлена мРНК для IL-7, SCF и в значительно меньшем количестве — для IL-1a и GM-CSF [62]. Для TNFa не только не установлена природа продуцирующих его ТЭК, но даже строго не доказано, что его вырабатывают ТЭК: экспрессия мРНК и секреция этого цитокина изучались почти исключительно в суммарных популяциях стромальных или лимфоидных клеток тимуса, а в культуре клонированной линии нетрансформированных ТЭК продукция TNF а не была обнаружена [19].
Существует определенная пространственная приуроченность секреции цитокинов к местам их наибольшего потребления. Так, выработка IL-7 максимальна в субкапсулярной зоне тимуса, где находятся его клетки- мишени [94], а хемокины вырабатываются в местах, куда направляется миграция клеток — главным образом, в субкапсулярной, кортикомедулярной зонах, мозговом слое [5, 14, 29, 40, 66].
Обстоятельства продуцирования цитокинов в ТЭК и его зависимость от стимуляции (табл. 2) изучены слабо. Экспрессия цитокиновых генов в ТЭК может происходить «спонтанно», т.е. без очевидной стимуляции клеток. In vitro так вырабатываются, в частности, M-CSF [32], GM-CSF (в малых количествах), но не IL-1 [31]; по другим данным, при культивировании в бессывороточной среде секретируются IL-6 и IL-8, но не GM-CSF [80]. В нести- мулированных ТЭК обнаружена экспрессия генов IL-7, IL-1?, IL-6, TNFa, GM-CSF, SCF, рецепторного антагониста IL-1 (raIL) [99]. По-видимому, существует определенная иерархия условий, побуждающих ТЭК к секреции цитокинов. Так, в монокультуре медуллярных ТЭК эмбриона человека в бессывороточной среде спонтанная секреция IL-6 и IL-8 усиливается при стимуляции IL-1 или антителами к мембранным молекулам (ICAM-1, LFA-1); IL-1, но не антитела к молекулам адгезии индуцируют выработку LIF и GM-CSF, подавляемую гидрокортизоном; секреция IL-7 и IL-3 во всех этих ситуациях отсутствует [80].
В описанном выше эксперименте антитела к молекулам адгезии, очевидно, моделируют контактные взаимодействия ТЭК с окружающими клетками (прежде всего с тимоцитами), которые, по-видимому, служат источником стимуляции ТЭК in situ. Существуют прямые свидетельства роли контактных взаимодействий ТЭК с тимоцитами в модификации выработки цитокинов теми и другими клетками. Так, сообщалось об усилении экспрессии гена IL-1 ? и в то же время ослаблении экспрессии гена IL-7 в ТЭК под влиянием их контакта с тимоцитами; на этом фоне ретиноевая кислота подавляла экспрессию в ТЭК гена IL-1 и усиливала экспрессию генов IL-7 и IL-6 [57]. При контакте с тимоцитами и клетками Т-гибридомы в кортикальных ТЭК усиливалась экспрессия гена ^-1, а в медуллярных ТЭК — гена ^-6 [23] и стимулировалась секреция ^-6 [28].
Дендритные клетки. Значительно меньше сведений накоплено относительно выработки цитокинов дендритными клетками и макрофагами тимуса. В последние годы получены интересные данные о различном спектре цитокинов, вырабатываемых тимусными дендритными клетками лимфоидного/ плазмоцитоидного и миелоидного типов. Относительно выработки этими клетками ^-12 существуют определенные противоречия: есть данные о секреции ^-12 плазмоцитоидными дендритными клетками тимуса [91], в то же время показано, что зрелые дендритные клетки лимфоидного типа не продуцируют цепь р70 ^-12 [56]. Незрелые (плаз- моцитоидные) дендритные клетки лимфоидного типа вырабатывают, подобно их аналогам на периферии, ГРМа, но не спонтанно, а под влиянием стимуляции вирусом [10]. Относительно миелоидных дендритных клеток тимуса известно, что они экспрессируют мРНК M-CSF и хемокина М1Р-1а [91]. В ближайшее время можно ожидать значительного пополнения сведений относительно выработки цитокинов дендритными клетками тимуса параллельно с уточнением их гистогенеза.
Миоидные и тучные клетки. Важные, хотя и мало изученные миоидные клетки тимуса также способны вырабатывать цитокины. Сообщалось о секреции ими провоспалительных цитокинов — TNFa, ^-6, ^-8 [96]. В мозговой зоне и кортикомедуллярной связке тимуса обнаружены тучные клетки, экспрессирующие мРНК для TNFa; не исключено, что тучные клетки являются главным источником TNFa в тимусе [64].
Тимоциты. Наряду с ТЭК тимоциты являются важнейшим источником цитокинов. Преимущественно, но не исключительно, их вырабатывают зрелые медуллярные клетки, особенно клетки хелперного фенотипа — CD4+CD8-. Эти клетки секретируют цитокины более интенсивно, чем наивные
периферические Т-клетки того же фенотипа, и сопоставимы в этом отношении с Т-клетками памяти [8]. Оценка экспрессии цитокиновых генов в нестимулированных тимоцитах показала, что спектр продуцируемых ими цитокинов частично перекрывается с таковым для ТЭК (IL-7, IL-1, IL-6), но включает также ряд цитокинов, которые ТЭК не продуцируют (IFNy и TNFP и др.) [99].
Небольшое количество цитокинов могут секретировать незрелые CD4-CD8--клетки-предшественники. Активация смесью форболового эфира и ионофора Са2+ приводит к достаточно интенсивной выработке CD44+-тимоцитами IL-2, IFNy и TNFa, тогда как более зрелые CD44--тимоциты в этих условиях не вырабатывают цитокины, напоминая в этом отношении CD4+CD8+-тимоциты [105]. Экспрессия цитокиновых генов в CD4-CD8-- клетках меняется под влиянием их сокультивирования с ТЭК, в частности, ослабляется экспрессия IL-7 и усиливается — IL-4 [65]. У кур CD3--тимоциты (по-видимому, в основном CD4-CD8-) экспрессируют гены TGFP типов 2, 3 и 4 [63].
Сложилось представление, что способность тимоцитов экспрессировать цитокиновые гены, в частности, в условиях активации, убывает от стадии CD4-CD8-CD44+CD25- до стадии CD3loCD4+CD8+, на которой она вообще прекращается [106]. Установлено, что экспрессия цитокиновых генов в кортикальных CD3loCD4+CD8+-тимоцитах, не прошедших селекцию, блокирована [92]. Лишь после успешного завершения селекции способность к экспрессии генов цитокинов (в частности, гена IFNy [62]) в CD3hiCD4+CD8+ -тимоцитах восстанавливается. Двойные положительные тимоциты до и после селекции (соответственно CD3lo и CD3hi) коренным образом различаются по способности экспрессировать гены цитокинов: у первых эта способность отсутствует, тогда как у вторых наблюдается экспресия генов IL-2 и IFNy; однако экспрессия гена IL-4, наоборот, ослабевает при переходе CD3lo-клеток на стадию CD3hi [90].
CD3+CD4-CD8--тимоциты после стимуляции иммобилизированными антителами к CD3 способны секретировать цитокины. apTCR+-тимоциты указанного фенотипа продуцируют IL-4, IFNy и TNFa, тогда как y8TCR+-клетки вырабатывают IL-2, IFNy и TNFa [103]. У мышей немногочисленные ySNKT-клетки тимуса служат источником как IL-4, так и IFNy [7].
Условия продуцирования цитокинов зрелыми ти- моцитами и их зависимость от стимуляции (см. табл. 2) изучены слабо. Вероятно, в определенном количестве некоторые цитокины могут вырабатываться нестимулированными тимоцитами. Так, показано, что в трабекулах, кортикомедуллярной и мозговой зонах клетки спонтанно экспрессируют мРНК IFNy [64]. Кортизон-резистентные тимоциты спонтанно секретируют in vitro IL-2 и IL-3, но не IFNy, для индукции выработки которого этими клетками требуется активация; максимальный уровень секреции ^-2 и ^N7 наблюдается через 1 сут. после активации, а ^-3 — на 4-е сут. [24]. Простое сокультивиро- вание с ТЭК включает секрецию ^-4 и ^-6 Qа-1 +CD4+-тимоцитами, дифференцирующимися из Qa-1--клеток в процессе сокультивирования [52].
Стимуляция клеток митогеном, безусловно, усиливает выработку и секрецию названных цитокинов. При стимуляции конканавалином А индуцируется продукция тимоцитами ^-2, ^-4, ^-6, ^-10 и ^N7 [75]. Активация смесью форболмиристатацетата (ФМА) и антител к CD3 (или иономицина) индуцирует секрецию CD4+CD8--тимоцитами ^-2, ^-4, ^-5 и лишь при стимуляции смесью ФМА, анти-CD3 и ^-12 (но не ^N7) индуцируется выработка сверх указанных цитокинов ^N7, ^-10 и TGFp [56]. Под влиянием суперантигенов в тимоцитах экспрессируется мРНК ^-2, ^-4, ^-5, ^-13, ^N7, лимфотактина и RANTES [104]. Стимуляция тимоцитов моноклональными антителами к СD3 в сочетании с костимуляцией через CD2, CD28 и дополнительным воздействием ^-2 приводит к индукции секреции ^-4 (преимущественно СD4+-тимо- цитами), ^N7 (преимущественно CD8+-клетками), ^-5, ^-10 и ^-13 (теми и другими клетками). Под влиянием экзогенного ^-4 усиливается секреция ^-4 за счет подключения к этому процессу CD8+-клеток, а под влиянием ^-12 усиливается секреция ^N7 как CD8+-, так и CD4+-клетками [102]. Как показано в опытах с нокаутом одновременно генов CD28 и CD7, для индукции выработки ^N7 тимоцитами, стимулированными антителами к CD3, требуется костимуляция через CD28 и CD7 [39].
Это означает, что стимуляция через TCR или иными путями приводит к дифференцировке CD4+-тимоцитов в клетки, аналогичные по спектру вырабатываемых цитокинов периферическим хел- перам №2-типа, тогда как для их дифференциров- ки в аналоги хелперов ТМ-типа требуется дополнительный стимул, реализуемый. как правило, в виде ^-12. С другой стороны, сообщалось о том, что спектр секретируемых CD4+-тимоцитами цитоки- нов меняется в процессе их ответа на стимуляцию: сначала клетки, несущие много антигена HSA (HSAhi), секретируют в основном ^-2, затем, после перехода на стадию HSAlo, они выделяют наряду с ^-2 большие количества ^-4, ^-5, IL-13 и ^N7 [9]. Один из восьми HSAloСD4+-тимоцитов секретиру- ет IL-2, один из тридцати — ^-4 (что выше, чем на периферии) [9]. При ретровирусной инфекции (мышиный СПИД) уровень выработки ^-2, IL-4 и ^-6 тимоцитами существенно колеблется во времени, тогда как уровень выработки тимоцитами ^N7 постоянно сохраняется на высоком уровне [97]. Малая субпопуляция зрелых NK1.1+CD4+CD8--тимоцитов секретирует большие количества ^-4 и ^N7 в ответ на стимуляцию через TCR [9].
NK1-СD4+СD8--тимоциты мышей при стимуляции через TCR продуцируют много IL-4 [6]. Поскольку тимоциты этого фенотипа, полученные от мышей BALB/c (генетически детерминированных к преобладанию №2-ответа), вырабатывают в 9 раз больше IL-4, чем те же клетки мышей C57BL/10 (с преобладанием Thl-ответа), авторы пришли к выводу, что выработка IL-4 CD4+-тимоцитами служит источником этого цитокина для обеспечения дифференцировки периферических CD4+- и CD8+-Т-клеток в продуценты комплекса цитокинов 2-го типа [18]. Сообщалось также о выработке в условиях вирусной инфекции IL-4 (в большом количестве), но не IFNy, малой фракцией мышиных тимоцитов фенотипа CD3+CD4+CD8-Thy-1-HSAhi; этим клеткам также приписана роль источника IL-4, направляющего дифференцировку периферических №2-лимфоцитов [16].
Выработка клетками тимуса хемокинов. В разделе 1 упоминалось о том, что ТЭК и, в меньшей степени, дендритные клетки и тимоциты вырабатывают хемокины. Большая часть хемокинов тимуса вырабатывается спонтанно; имеющиеся данные свидетельствуют о том, что их основным источником служат клетки медуллярного эпителия. Установлено, что ТЭК кортикальной зоны вырабатывают два хемокина — СХС-хемокин SDF-1 (он секретируется также фибробластами [59]) и СС-хемокин TECK. Список хемокинов, вырабатываемым в медуллярной зоне, значительно обширнее. Он включает СХС-хемокины IP-10, MIG, ITAC, SDF-1 [76], и CC-хемокины эотаксин (как и SDF-1, он продуцируется медуллярными ТЭК, формирующими тельца Гассаля [77, 103]), TECK [66, 93], MDC [27], МСР-1 [51], SLC [66, 86], ELC [13], TARC [41], I-309 [87]. Хемокины MDC и ELC вырабатываются разными субпопуляциями медуллярных ТЭК: продуценты MDC локализуются в наружной части телец Гассаля, а клетки, вырабатывающие ELC, — в периваскулярных пространствах [5]. Молекулы SLC и ELC продуцируются не только ТЭК, но и сосудистым эндотелием соответственно кортико-медуллярных и медуллярных венул [33, 66]. СХС-хемокин IP-10 и СС-ххемокины ТЕСК, TARC и эотаксин вырабатываются не только ТЭК, но и лимфоидными дендритными клетками [66, 93].
Данные о выработке хемокинов тимоцитами крайне немногочисленны: сообщалось о продукции СХС-хемокина IP-10 активированными тимоцитами [32], а также лимфотактина — CD4-CD8--тимоцита- ми и активированными CD4-CD8+-клетками [66].
Выработка клетками тимуса хемокинов. В разделе 1 упоминалось о том, что ТЭК и, в меньшей степени, дендритные клетки и тимоциты вырабатывают хемокины. Большая часть хемокинов тимуса вырабатывается спонтанно; имеющиеся данные свидетельствуют о том, что их основным источником служат клетки медуллярного эпителия. Установлено, что ТЭК кортикальной зоны вырабатывают два хемокина — СХС-хемокин SDF-1 (он секретируется также фибробластами [59]) и СС-хемокин TECK. Список хемокинов, вырабатываемым в медуллярной зоне, значительно обширнее. Он включает СХС-хемокины IP-10, MIG, ITAC, SDF-1 [76], и CC-хемокины эотаксин (как и SDF-1, он продуцируется медуллярными ТЭК, формирующими тельца Гассаля [77, 103]), TECK [66, 93], MDC [27], МСР-1 [51], SLC [66, 86], ELC [13], TARC [41], I-309 [87]. Хемокины MDC и ELC вырабатываются разными субпопуляциями медуллярных ТЭК: продуценты MDC локализуются в наружной части телец Гассаля, а клетки, вырабатывающие ELC, — в периваскулярных пространствах [5]. Молекулы SLC и ELC продуцируются не только ТЭК, но и сосудистым эндотелием соответственно кортико-медуллярных и медуллярных венул [33, 66]. СХС-хемокин IP-10 и СС-ххемокины ТЕСК, TARC и эотаксин вырабатываются не только ТЭК, но и лимфоидными дендритными клетками [66, 93].