загрузка...
 
АННОТАЦИЯ 
Повернутись до змісту

АННОТАЦИЯ 

Журнал содержит информацио о цитокинах в тимусе, биологической активности и функциях цитокинов в тимусе,действиях цитокинов на тимоциты, действиях цитокинах на ТЭК.

 

© Ярилин А.А., 2003 УДК 612.015.11:611.438

 

 

 

Цитокины в тимусе. Биологическая активность и функции цитокинов в тимусе

А.А. Ярилин

ГНЦ — Институт иммунологии Минздрава России, Москва

Обзор литературы. Рассмотрены функции цитокинов в тимусе: роль в миграции, пролиферации и апоптотической гибели тимоцитов, регуляции контактов тимоцитов с тимусными эпителиальными клетками.

Ключевые слова: тимоциты, тимусные эпителиальные клетки, цитокины, хемоцины, рецепторы цитокинов.

Как известно, основная функция тимуса состоит в обеспечении развития Т-лимфоцитов, и его непосредственное участие в «общих делах» организма традиционно считается минимальным. Хотя он и подвержен различным патологическим процессам, в том числе воспалительным, вклад патологии тимуса в список заболеваний человека и животных невелик. Из сказанного следует, что роль цитокинов, образующихся в тимусе, должна состоять по преимуществу в поддержании конститутивных процессов, реализуемых в этом органе. Основным таким процессом в тимусе является Т-лимфопоэз. Кроме того, цитокинам по самой их природе подходит роль координаторов межклеточных взаимодействий, в том числе межтканевых, которую они и осуществляют в тимусе. Непрерывная миграция лимфоидных клеток из кроветворных органов в тимус, внутри него и из тимуса в периферический отдел иммунной системы нуждается в направляющих влияниях, которые осуществляют хемотаксические цитокины, хемокины.

В тимусе постоянно вырабатываются те же цитокины, которые образуются в периферическом отделе иммунной системы в условиях стимуляции (при воспалении и иммунном ответе). В связи с этим естественно предположить, что функции одних и тех же цитокинов в тимусе и на периферии могут существенно различаться. Иными могут быть и функциональные взаимодействия между цитокинами.

Данный обзор посвящен анализу функций цитокинов в тимусе и особенностей их биологической роли в этом органе.

Действие цитокинов на тимоциты

Участие цитокинов в развитии тимоцитов

Наибольшие усилия предприняты для выяснения роли цитокинов тимуса в развитии тимоци- тов (рис. 1) и полнее всего осмыслена эта роль в отношении ранних этапов созревания тимоцитов. Одним из самых «ранних» факторов, действующих на клетки Т-ряда, является SCF (stem cell factor, фактор стволовых клеток). Как уже отмечалось [98], его рецептор c-kit экспрессируется на CD44+ клетках [91], для которых SCF, наряду с IL-7, служит фактором роста и выживаемости. SCF и IL-7 действуют синергично, причем SCF преимущественно способствует пролиферации CD25-/l0 клеток, а IL-7 — CD25+ клеток [41]. Размножение клеток-предшественников в тимусе примерно на 50 % зависит от SCF [64]. В отсутствие SCF общая численность тимоцитов снижается в 3-4 раза, численность CD4-CD8- клеток — в 40 раз. SCF способствует также регенерации опустошенного тимуса за счет экспансии костномозговых клеток-предшественников [23]. Показано также, что с-kit вновь экспрессируется на CD4+CD8- тимоцитах, прошедших положительную селекцию [2]; вероятно, SCF является одним из факторов, обусловливающих дифференцировку тимоцитов после селекции.

IL-7 представляет собой редкий пример цито- кина, чья основная функция уникальна, не замещается действием других цитокинов [60, 84]. Использование мышей, нокаутированных по генам IL-7, a-цепи его рецептора, а также у(с)-цепи, позволило выяснить роль IL-7 в развитии лимфоцитов, включая тимоциты [12, 17, 35, 52, 53, 84]. Поскольку IL-7 обеспечивает ранние этапы развития не только Т-, но и В-клеток (в значительно большей степени у мышей, чем у человека), основным последствием отключения гена IL-7 у мышей является лимфопения, затрагивающая оба лимфоидных ростка с наиболее глубоким снижением численности у5Т-клеток [84]. Клеточность тимуса при этом уменьшена в 15-70 раз, причем численность всех субпопуляций тимоцитов снижена равномерно. Внутри субпопуляции CD4-CD8- регистрируется особенно резкое снижение численности CD44- клеток [40]. Нокаут гена a-цепи IL-7R сопровождается теми же изменениями, только блок дифференцировки регистрируется на более раннем этапе развития тимоцитов, соответствующем переходу от CD44+CD25- к CD44+CD25+ клеткам [18, 52]. При нокауте гена у(с)-цепи равномерно подавлены все стадии развития CD4-CD8- тимоцитов, включая CD44+ клетки [26, 27, 45]. Во всех этих случаях нарушается перестройка у-гена TCR при нормальном осуществлении перестройки генов в- и a-цепей TCR [34, 36, 52]. Нокаут гена тирозинкиназы Jak3, обусловливающей передачу сигнала от у(с)-цепи, приводит к полному спектру изменений, характерных для мышей, нокаутированных по у(с)-цепи, с добавлением дефекта развития тимусного эпителия и нарушения процесса отрицательной селекции, нарастающего с возрастом [25, 47, 51, 74].

У человека дефекты, свойственные мышам, нокаутированным по названным выше генам, проявляются при Х-сцепленном варианте тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с мутацией гена у(с), а также с аутосомными вариантами этой патологии, обусловленными мутациями гена тирозинкиназы Jak3 [70, 80, 87]. При этом заболевании также снижается число всех разновидностей Т-лимфоцитов (в отличие от мышей, у человека развитие В-клеток при этом не страдает), а в тимусе регистрируется низкое содержание или полное отсутствие тимоцитов и дефекты эпителия [44].

Повышенная экспрессия IL-7 при трансфекции его гена [39, 66] сказывается на интенсивности лимфопоэза, существенно усиливая его, но относительно мало затрагивает тимус. Иногда последствием этого является развитие лимфом, в том числе Т-клеточных [62], а также поражение кожи типа дерматита, обусловленное ее усиленной инфильтрацией Т-клетками. Трансфекция гена IL-7 бестимусным мышам nude приводит к восстановлению у них численности клеток за счет внетимусной дифференцировки [63].

Анализ последствий нокаута и трансфекции генов IL-7 и цепей его рецептора, а также изучение действия этого цитокина in vitro позволили реконструировать его роль в развитии тимоцитов. IL-7 в первую очередь является фактором выживаемости CD4-CD8- тимоцитов [29, 30], т.е. юных тимоцитов, в которых реализуется перестройка генов TCR, сопряженная с высоким риском развития апоптоза (поскольку обязательным элементом перестройки генов являются двуцепьевые разрывы ДНК, способные индуцировать апоптоз). Этот эффект IL-7 обусловлен индукцией экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2 [85]. Однако более широко известен ростовой эффект IL-7. In vitro этот цитокин поддерживает пролиферацию тимоцитов [17, 48], действуя по преимуществу на юные CD3-CD4-CD8- клетки, а среди


них — на СБ44+ клетки [82, 83]. Основным источником ^-7 для СБ44+СБ25- тимоцитов служат фибробласты. В качестве его синергистов при этом могут выступать ^-2 и TNFa [5, 20]. С действием ^-7 на выживаемость и пролиферацию тимоцитов связывают его роль в в-селекции пре-Т-кле- ток и в положительной селекции тимоцитов [1].

Помимо этого, ^-7 может рассматриваться как дифференцировочный фактор, обусловливающий превращение СБ44+СБ25- клеток в СБ44+СБ25+ и затем в СБ44-СБ25+ клетки. Нарушение перехода СБ44+СБ25+тимоцитов на стадию СБ44- клеток, наблюдающееся при отключении гена а-цепи IL-7R, связывают с устранением действия цитокина TSLP, рецептор которого имеет общую а-цепь с IL-7R [40]. Дифференцировочный эффект ^-7 проявляется также в его участии во включении процесса перестройки генов TCR; его участие является ключевым для включения перестройки гена у-цепи [4, 34], тогда как при перестройке генов в- и 8-цепей он может рассматриваться в качестве вспомогательного индуцирующего фактора [49, 77]. Предполагается, что связь ^-7 с перестройкой реализуется через его влияние на индукцию генов RAG-1 и RAG-2 [18].

Сведения о действии ^-7 на СБ4+СБ8+ и зрелые медуллярные тимоциты немногочисленны и отрывочны, его участие в процессе селекции не является строго доказанным фактом. Известно, что ^-7 вызывает пролиферацию Т-бластов и может рассматриваться как кофактор пролиферации покоящихся Т-клеток, действуя совместно с митогеном [88].

Ростовые факторы Т-клеток в тимусе

Выше отмечалось, что отключение генов а- и у(с)-цепей IL-7R затрагивает несколько более широкий спектр событий, чем отключение гена ^-7, и упоминалось о «собственных» эффектах цито- кина TSLP, рецептор которого имеет с IL-7R общую а-цепь. Еще шире круг цитокинов, рецепторы которых содержат в своем составе у(с); к ним относятся ^-2, ^-4, ^-9 и ^-15 [20, 44]. С выключением их действия связан ряд нарушений в развитии СБ4-СБ8- клеток тимуса, а также внут- ритимусных NK-клеток.

Первоначально считалось, что одним из ведущих факторов развития тимоцитов является ^-2. Действительно, введение антител к ^-2 в органную культуру тимуса мыши приводит к снижению числа лимфоидных клеток в тимусе [81]. Аналогичный эффект наблюдается при введении таких антител развивающимся, а также облученным мышам [74]. При введении рекомбинантного ^-2 в органную культуру тимуса крысиных эмбрионов сначала увеличивалось содержание тимо- цитов и регистрировалось их созревание. При введении на более длительный срок наблюдался противоположный эффект — тот же, что при введении антител к СБ25: в обоих случаях снижается число тимоцитов, замедляется их созревание, изменяется репертуар aвTCR и повышается содержания NK-клеток [81]. Наиболее выраженный ростовой эффект наблюдался при действии ^-2 на культуры тимуса, эксплантированного в начальный период после его заселения, а также в конце эмбрионального периода [81]. Показана также роль ^-2 в развитии зрелых СБ8+ тимоцитов [50].

Однако у мышей с нокаутом генов ^-2 или а-цепи IL-2R развитие тимоцитов практически не страдает [69], что послужило основой для вывода

о    заменяемости функций ^-2 в тимусе и необязательности его участия в развитии тимоцитов. Тем не менее известно, что у мышей с инактивированным геном ^-2 регистрируются дефекты развития стромы тимуса, проявляющиеся в потере МНСП+ эпителиальных клеток коры [61]. Постепенно нарушается развитие тимоцитов: снижается численность СБ4-СБ8- и СБ4+СБ8+ клеток [61], нарушается структура популяции медуллярных тимоцитов с преобладанием СБ8+СБ4- клеток [55], а по профилю секретируемых цитокинов — ТМ клеток [33]. Наблюдается также снижение числа внутри- тимусных макрофагов [58]. Относительно действия ^-2 на апоптоз тимоцитов имеются противоречивые данные. С одной стороны, установлено, что ^-2 предотвращает развитие апоптоза тимоцитов, индуцированного антителами к СБ3, и даже вызывает пролиферацию клеток, обработанных этими антителами [24]. С другой стороны, показано, что ^-2 участвует в индукции апоптоза СБ4+СБ8 + и СБ4+СБ8- тимоцитов; при апоптозе усиливается экспрессия а-цепи IL-2R и происходит интернализация ^-2, связавшегося с рецептором [8]. Генетически обусловленный дефицит ^-2 приводит к ослаблению отрицательной селекции, что проявляется в развитии аутоиммунных процессов. Ключевая роль внутритимусных событий при этом показана в опытах с отменой аутоиммунных последствий нокаута гена а-цепи IL-2R при трансфекции гена а-цепи IL-2R с ее экспрессией только в тимусе [57], а также при переносе нормальных зрелых Т-клеток.

В опытах на генетически модифицированных мышах показано, что еще один цитокин, в составе рецептора которого содержится у(с)-цепь, — ^-15 — влияет на развитие самых ранних проТ- клеток с фенотипом СБ44+СБ25- [57] и, кроме того, обеспечивает дифференцировку NK-клеток, в том числе тимусных, и поддерживает пролиферацию главным образом СБ4-СБ8+ тимоцитов [75]. Установлено, что ^-15, содержание которого в тимусе увеличивается с возрастом, причастен к атрофии тимуса: его введение ускоряет снижение численности кортикальных и медуллярных тимоцитов [71]; вероятно, этот эффект реализуется через действие на тимусные эпителиальные клетки (ТЭК).

Следующий цитокин, в рецепторе которого содержится у(с)-цепь, — IL-4 — также способен поддерживать пролиферацию тимоцитов, как юных (при прямом действии на них), так и зрелых (при действии совместно с активирующим агентом) [95]. Показана более высокая чувствительность у8+ тимоцитов к ростстимулирующему действию IL-4 [43]. Также он подавляет пролиферацию и дифференцировку тимоцитов в культуре тимуса мышиных эмбрионов 14 сут. развития [55]. При этом он проявляет синергизм с IL-2 [38].

По-видимому, таким же эффектом обладает еще один у(с)-зависимый цитокин — IL-9: антитела к его рецептору снижают, а сам IL-9 повышает число тимоцитов в органной культуре тимуса; его влияние сказывается главным образом на дифференцировке CD34+ клеток-предшественни- ков, а также CD4-CD8- тимоцитов [18]. Возможное участие IL-9 в обеспечении пролиферации ти- моцитов показано также на мышах с гиперэкспрессией трансгенного IL-9, у которых часто развиваются лимфомы тимуса [19].

Провоспалительные цитокины и Т-лимфопоэз

Провоспалительные цитокины играют двоякую роль во внутритимусных процессах. С одной стороны, они влияют на нелимфоидные клетки стромы (см. далее), с другой — служат кофакторами пролиферации тимоцитов. Так, пролиферацию CD4-CD8- тимоцитов in vitro вызывают в различных комбинациях (но не в отдельности) следующие цитокины: IL-1?, TNFa, IL-6, IL-3, GM-CSF [96]. IL-1 и TNF a принимают участие (в качестве кофакторов) в индукции дифференцировки CD4-CD8—rn- моцитов. Они вносят определенный вклад во включение процесса реаранжировки генов TCR [97] и способствуют переходу юных CD44+CD25- тимоцитов на стадию CD44+CD25+ [86, 97], а также индуцируют транзиторную экспрессию CD8 на CD3- тимоцитах [73]. TNFa играет важную роль в регуляции численности CD4-CD8- клеток, индуцируя апоптоз на стадиях CD44-CD25+ и CD44-CD25- (т.е. в процессе перестройки генов TCR) и подавляя пролиферацию этих клеток; у мышей с нокаутом генов рецепторов TNF численность тимоцитов возрастает на 60 % без изменения соотношения CD4+ и CD8+ клеток [7]. TNFa участвует в индукции апоптоза CD4+CD8+ тимоцитов в клетках-нянь- ках [54]; он усиливает также апоптоз CD4+CD8+ клеток, индуцированный глюкокортикоидами [6]. Апоптотический сигнал TNFa передается через рецептор TNFR1, пролиферативный сигнал — через TNFR2 [7].

IL-6, а также два других цитокина его семейства (LIF, OSM) выделяются из группы провоспалитель- ных цитокинов более специфическим участием в Т-лимфопоэзе. У эмбрионов мышей с нокаутом гена цепи gp130, общей для цитокинов этой группы, наряду с грубыми нарушениями эмбриогенеза, несовместимыми с жизнью, регистрируется резкое опустошение тимуса [93]. Нокаут гена IL-6 приводит к снижению содержания тимоцитов всего на 20-40 % [31]. Это обусловлено отменой вклада, вносимого IL-6 в пролиферацию тимоцитов и поддержку жизнеспособности ранних клеток-предшественников [64]. LIF и OSM оказывают сходное, в определенном смысле парадоксальное действие на развитие Т-клеток: они усиливают внетимусный Т-лимфопоэз и ослабляют развитие Т-клеток в тимусе [76]. Гиперпродукция каждого из этих цитокинов (в результате трансфекции их генов, в частности, с их избирательной экспрессией в Т-клетках) приводит к исчезновению кортикальных CD4+CD8+ тимоцитов (в то же время CD4+CD8+ клетки накапливаются в лимфатических узлах), нарушению кортикомедуллярной структуры эпителиального ретикулума и формированию эпителиальными клетками фолликулов, заполненных В-лимфоцитами [13, 68]. LIF и OSM индуцируют дифференцировку CD34+ клеток костного мозга в Т-лимфоциты вне тимуса [14, 22]; гиперэкспрессия OSM обеспечивает (с участием IL-7) дифференци- ровку Т-клеток у бестимусных мышей nude [14].

GM-CSF подавляет дифференцировку ранних CD4-CD8- клеток-предшественников в тимусе [92] и в то же время способствует дифференцировке лимфоидных дендритных клеток [67].

Антагонисты ростовых факторов тимоцитов

Установлено, что IFNy является фактором, способствующим индукции апоптоза моноклональными антителами к CD3; при действии этих антител усиливается экспрессия гена IFNy и секреция самого цитокина, а введение в систему антител к IFNy предотвращает развитие апоптоза. Поскольку при действии антител к CD3 экспрессия IL-2 отсутствует и добавление IL-2 предотвращает апоптоз, считается, что судьбу клеток определяет баланс проапоптотического цитокина IFNy и антиапоптотического цитокина IL-2 [24].

Описана также активность IFNy в качестве антагониста IL-4: он отменяет ингибирующее действие IL-4 на пролиферацию и дифференциров- ку клеток тимуса 14-суточного эмбриона мыши [55]; также IFNy (как и TNFa) отменяет ростовой эффект IL-4 в отношении у8+ тимоцитов [43]. При действии на секреторную активность ТЭК IFNy, напротив, проявил сходство с IL-4, а в отношении секреции IL-6 — даже аддитивность [47].

Ингибитором дифференцировки тимоцитов является IL-10: у трансгенных по нему мышей тимус атрофичен, проявляются отклонения, аналогичные таковым при дефекте генов IL-7 или у(с)-цепи; введение антител к IL-10 отменяет эту симптоматику [65].

В качестве другого супрессорного цитокина в тимусе выступает TGFP1 [59]. В органной культуре тимуса этот цитокин блокирует превращение СБ44+СБ25+ клеток в СБ44-СБ25+ тимоциты. Он предотвращает восстановление органа костномозговыми предшественниками после опустошения 2-дезоксигуанозином; при этом в тимусе блокируется формирование любых клеток, кроме зрелых СБ8+ тимоцитов, дифференцирующихся непосредственно из клеток-предшественников [56, 72]. TGFp подавляет пролиферацию тимоцитов [42] и секрецию ими ^-2, ^-6 и ^-10 [20].

 

Хемокины и миграция тимоцитов

Роль хемокинов в заселении тимуса, перемещении клеток внутри него и их эмиграции из органа может быть реконструирована, исходя из данных о локализации синтеза хемокинов и экспрессии их рецепторов, а также данных о последствиях нокаута соответствующих генов (рис. 2).

Обнаружение выработки хемокинов TECK и SDF-1 в эпителии эмбриональной закладки тимуса, а также экспрессии соответствующих рецепторов (CCR9 и CXCR4) дало основание для предположения о роли этих хемокинов в привлечении в тимус клеток-предшественников из кроветворных органов. У мышей nude, у которых нарушена способность костномозговых предшественников мигрировать в тимус, в эмбриональной закладке стромы тимуса отсутствует экспрессия TECK и SDF-1 [10]. В то же время нокаут гена CCR9 не приводит к существенным нарушениям в процессах лимфопоэза, включая развитие Т-клеток. Только в опытах с конкурентным заселением тимуса клетками из разных источников показано, что у нокаутированных мышей ослаблена способность костномозговых предшественников репопулировать тимус облученных мышей, причем это касается как ав-, так и уб-клеток [78]. У мышей с нокаутом по гену CCR9 задержка в развитии Т-клеток составляет всего

день [89]. Кроме того, оказалось, что CCR9 экспрессируется на ТЭК эмбрионов, но не взрослых мышей [3]. Возможно, ТЕСК играет роль в привлечении клеток-предшественников в тимус, но эта роль ограничена периодом эмбрионального развития и может быть замещена другими хемокинами.

Имеются сведения в пользу участия хемокина SDF-1 в привлечении в тимус клеток-предше- ственников. Помимо данных об экспрессии в субкапсулярной зоне этого хемокина (в ТЭК) и его рецептора CXCR4 (на тимоцитах), сообщалось о способности SDF-1 вызывать направленную миграцию самых юных тимоцитов фенотипа CD44+CD25-, а также CD34+ клеток крови. Однако позже было обнаружено, что экспрессия SDF-1 повышается при превращении CD44+CD25- клеток в более зрелые

Эмиграция из тимуса

CD44+CD25+ клетки [46]. Были получены данные, свидетельствующие о том, SDF-1 скорее всего привлекает в субкапсулярную зону клетки-предшественники, уже мигрировавшие в кортико-медул- лярную зону тимуса [46]. Мутации генов SDF-1 и CXCR4 или их нокаут имеют последствием нарушения В-лимфопоэза, но не влияют на развитие Т-лимфоцитов в тимусе [3], что свидетельствует

об   избыточном обеспечении цитокинами тех функций, которые выполняет данный хемокин в тимусе.

В качестве агентов, имеющих отношение к привлечению клеток-предшественников в тимус, рассматривают также в-хемокин MIP-1a и лимфо- тактин [46], однако конкретных свидетельств их участия в заселении тимуса пока недостаточно.

Поскольку экспрессия CCR9 на поверхности тимоцитов почти 10-кратно возрастает при созревании CD4-CD8- клеток в CD4+CD8+ тимоциты и параллельно резко возрастает способность клеток мигрировать в направлении хемокина TECK, вырабатываемого кортикальными ТЭК, предполагается, что система TECK/CCR9 ответственна за перемещение тимоцитов из наружных в глубокие слои коры тимуса [46]. Осуществлению этого процесса способствует ослабление экспрессии созревающими тимоцитами CXCR4, удерживающего клетки в наружных слоях коры, в которых вырабатывается его лиганд SDF-1. Возможно, в перемещении тимоцитов в глубокие слои коры играет свою роль также пара молекул MIP-1P/CCR5.

Привлечение в медуллярный слой тимуса CD69+CD4+CD8+ тимоцитов, прошедших положительную селекцию, вероятнее всего, осуществляется с участием в-хемокина MDC и его рецептора CCR4, экспрессия которого повышается параллельно с появлением на клетках молекулы CD69. При дальнейшем созревании на MDC отвечают преимущественно СБ4+СБ8- CD62Llo тимо- циты, тогда как привлечение CD4-CD8+ клеток осуществляют эотаксин и 1Р-10 [46]. За удержание зрелых тимоцитов в медуллярном слое ответственны хемокины MDC и TARC, взаимодействующие с рецептором CCR4 на поверхности тимо- цитов [11]. На основании данных о коэкспрессии CCR4 и CD30 сделан вывод о роли системы CCR4/ MDC в осуществлении отрицательной селекции тимоцитов; а-хемокин SDF-1, вырабатываемый в тельцах Гассаля, привлекает дендритные клетки, поглощающие апоптотические тимоциты; на этом основании данному хемокину приписывают роль в контроле элиминации апоптотических клеток тимуса [94]. Его хемотаксический эффект усиливается фибронектином и ламинином [90]. Приведены данные в пользу участия SDF-1 в разделении тимоцитов на субпопуляции CD4+ и CD8 + клеток.

На завершающих этапах созревания тимоцитов снижается экспрессия хемокиновых рецепторов CCR4 и CCR9, что, вероятнее всего, обусловливает ослабление связи тимоцитов с клетками микроокружения. Одновременно усиливается экспрессия CCR5 и CCR8, что ставят в связь с процессом эмиграции тимоцитов. Основными кандидатами на роль факторов, обусловливающих эмиграцию тимоци- тов, являются лиганды CCR5 в-хемокины SLC и ELC [46]. Хотя в тимусе секретируется больше SLC, чем ELC, данные по нокауту соответствующих генов свидетельствуют о незаменимости ELC, но не SLC в обеспечении эмиграции тимоцитов. Эти данные свидетельствуют о преобладающей роли ELC в эмиграции зрелых тимоцитов из тимуса [79] и представляют собой пока единственный пример нарушения развития Т-лимфоцитов при нокауте генов, кодирующих хемокины или их рецепторы.

Действие цитокинов на ТЭК

Интерферон у как активатор ТЭК

Факт действия №N7 на ТЭК является общепризнанным: он активирует их, усиливая экспрессию на их поверхности молекул МНС классов I и

[28] и многих других мембранных белков, включая костимулирующие молекулы и молекулы адгезии, такие, как CD40, CD44, CD29, CD49 [9], CD54 [21]. №N7 в малых дозах усиливает, а в больших ослабляет экспрессию на ТЭК в1-интегринов VLA-5 и VLA-6, соответственно влияя на адгезию на них тимоцитов и выход последних из клеток- нянек [32]. №N7 усиливает секрецию ТЭК П1-6 [15], но подавляет секрецию GM-CSF и G-CSF, индуцированную ^-1 [21]. Полагают, что это способствует проявлению функций ТЭК, в том числе дифференцировочных. Издавна считается, что №N7 является главным фактором, через который тимоциты оказывают действие на ТЭК, реализуемое в их же пользу.

Действие на ТЭК других цитокинов

Установлено, что на ТЭК оказывают влияние провоспалительные цитокины: ^-6 служит для них ростовым фактором [37], ^-1 и в меньшей степени TNFа способствуют их активации, что выражается в усилении секреции ряда цитокинов [70] и экспрессии активационных антигенов на их поверхности [16]. Однако супрессорный цитокин TGFp подавляет пролиферацию ТЭК [37].

Имеются сведения о действии на ТЭК ряда ростовых факторов, реализующих свой эффект с участием рецепторов, содержащих у(с)-цепь. Так, приводились данные о стимулирующем действии ^-7 на ТЭК [72] и развитии дефектов тимусного эпителия при отключении этого цитокина [44]. Дефекты развития стромы тимуса, проявляющиеся в потере МНСП+ эпителиальных клеток коры [61], регистрируются также у мышей с инактивированным геном ^-2, что влечет опосредованное нарушение дифференцировки тимоцитов. Установлена способность ^-4 усиливать секрецию клетками тимусного эпителия ряда цитокинов [47].

Однако остается признать, что учение о цито- киновом контроле пролиферации и функций ТЭК находится на стадии начального накопления фактов, которые пока крайне малочисленны.

Заключение

Накопленные к настоящему времени сведения о функциональной роли цитокинов в тимусе отражены в таблице. При изучении цитокинов тимуса основные усилия предпринимались и основные успехи достигнуты в направлении раскрытия их участия в развитии Т-лимфоцитов. Установлено, что основная роль в образовании Т-клеток принадлежит ГЬ-7, продуцируемому ТЭК. В качестве вспомогательных факторов в этом процессе участвуют продукты ТЭК или клетками стромы (SCF, цитокины семейства П1-6, ^-15, провоспалительные цитокины), или самими тимоцитами (цитокины, действующие через у(с)-содержащие рецепторы — ^-4, ^-2, ^-9). На ранних этапах дифференцировки, соответствующих стадии CD4-CD8- клеток, участие этих цитокинов является обязательным, и их отсутствие приводит к блоку созревания Т-клеток, что и регистрируется при естественных мутациях и искусственном отключении генов соответствующих цитокинов или их рецепторов. Цитокины отвечают также за развитие других клеток тимуса, происходящих из костномозговых предшественников, в частности, тимусных дендритных клеток (GM-CSF, ^-4).

Тимоциты, находящиеся на промежуточных стадиях развития (CD4+CD8+CD3lo), практически не

 

 

 

реагируют на действие цитокинов. Этот период соответствует фазе селекции клонов и дифференци- ровки на субпопуляции, которые определяются исключительно контактными взаимодействиями клеток. После завершения селекции тимоциты вновь приобретают способность реагировать на цитоки- ны и выделять их, причем общие закономерности этих процессов сходны с теми, которым подчиняются зрелые Т-клетки. Однако в силу их локализации в тимусе эти клетки не могут участвовать в иммунном ответе. Поэтому роль цитокинов, которые на периферии иммунной системы являются основными ростовыми (ГЬ-2, ^-4) или дифференцировочными (^-12, ^-4, ^N7) факторами зрелых Т-клеток, в частности, факторами дивергенции на Т-клетки 1 и 2-го типов (ТМ и №2, Тс1 и Тс2), в тимусе может быть иной. Условия секреции этих цитокинов, а главное, их роль в функционировании зрелых ти- моцитов неясны. Вероятно, анализ этой роли позволит вскрыть внутритимусные процессы, о которых пока ничего не известно.

Проблема внутритимусных цитокинов имеет отношение и к другому плохо изученному процессу — контролю популяции ТЭК со стороны тимоцитов. Хотя известно, что сами ТЭК и стромальные клетки тимуса способны секретировать ростовые факторы ТЭК (^-6, ^-1) и факторы, обусловливающие их активацию (ГЬ-1, TNFа); популяция ТЭК сама по себе не способна обеспечить свою нормальную структурную организацию и должный уровень активности. Эта активность состоит в способности обеспечивать развитие тимоцитов и зависит от экспрессии продуктов главного комплекса гистосовместимости II класса, костимулирующих молекул и молекул адгезии, а также секреции цитокинов. Известно, что для проявления упомянутых признаков функциональной активности ТЭК и их нормальной структурной организации необходимо заселение эпителиального каркаса тимоцитами. Среди гуморальных продуктов тимоцитов, обеспечивающих должный уровень активности ТЭК, известен №N7, но конкретные обстоятельства и механизмы его действия на ТЭК изучены недостаточно полно. Показано, что на функцию ТЭК оказывает определенное влияние ^-4. Таким образом, цитокины, являющиеся антагонистами в системе функционирования зрелых Т-клеток на периферии (ТМ/№2), в тимусе участвуют в диалоге между тимоцитами и ТЭК. Пока неизвестно, каково «разделение труда» этих цитокинов при их действии на ТЭК и являются ли их эффекты в данном случае антагонистическими. Этот аспект функционального взаимодействия тимоцитов и ТЭК представляется весьма интригующим.

Наконец, есть еще одно бурно и успешно развивающееся направление в изучении цитокинов тимуса — исследование хемокинового контроля миграции клеток Т-ряда в процессе их развития. Хотя пока многие детали действия хемокинов в тимусе неясны, нет сомнений, что расшифровка хемокино- вого контроля перемещения клеток Т-ряда в процессе их развития (от поступления из костного мозга в тимус до эмиграции на периферию) — вопрос ближайшего времени.

 


Цитокины как регуляторы цитохром Г450-зависимых монооксигеназ. Теоретические и прикладные аспекты

С.В. Сибиряк

Отдел экспериментальной и клинической иммунологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии МЗ РФ, г. Уфа

Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы обеспечивают окислительную биотрансформацию поступающих в организм чужеродных химических соединений (ксенобиотиков), а также эндогенных липофильных биорегуляторных молекул-эндобиотиков (стероидов, арахидонатов, ретинои- дов). Содержание цитохрома Р450 и монооксигеназные активности в печени и других тканях снижаются при развитии бактериальных и вирусных инфекций, иммунизации различными антигенами, в условиях фармакологической иммуностимуляции. Этот эффект опосредован цитокина- ми. Депримирующее воздействие на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы обнаружено у IFNa, IFN?, IFNy, IL-1 и TNF, IL-6, IL-11, IL-2. Цитокины угнетают транскрипцию генов и накопление mRNA различных изоформ цитохрома Р450 в клетках, возможно и посттранскрипционное угнетение синтеза белка некоторых изоформ. Благодаря цитокиновой модуляции процессов моно- оксигенирования на цитохроме Р450, реализуется адаптация механизмов биотрансформации низкомолекулярных ксено- и эндобиотиков в условиях активации иммунной системы («иммунного» стресса). Это обеспечивает, с одной стороны, защиту от последствий возможной неконтролируемой активации потенциально опасной для организма ферментной системы и снижение риска нарушения оксидантного равновесия, с другой - сохранение оптимального уровня и неогенез необходимых для адекватного «ответа» организма низкомолекулярных липофильных сигнальных молекул. С прикладной точки зрения угнетение фармакометаболизирующей функции печени и изменение фармакодинамики и токсичности лекарственных препаратов необходимо учитывать при проведении терапии препаратами рекомбинантных цитокинов.

Ключевые слова: цитохром Р450-зависимые монооксигеназы, цитокины, регуляция гомеостаза.

Иммунная система функционирует в тесной взаимосвязи с другими регуляторными системами организма — нервной и эндокринной. Сформировано отдельное направление иммунологии — психонейроиммуноэндокринология. ^ вызывает сомнения, что нервная и эндокринная системы контролируют иммунологическую реактивность организма, с другой стороны, убедительно аргументировано афферентное влияние иммунной системы на центральную нервную систему, эндокринные функции. Нейроэндокринная регуляция иммунных функций реализуется с помощью нейротрансмиттеров, нейропептидов, гормонов. В свою очередь подавляющее большинство цитоки- нов, вырабатываемых иммунокомпетентными клетками, обладает, помимо специфической имму- нотропной активности, также нейротропной активностью и регулирует эндокринные функции. К примеру, ^-1 обладает выраженным нейротроп- ным эффектом (индукция эмиссии кортикотро- пин-рилизинг фактора, соматотропного гормона, регуляция цикла «сон-бодрствование», регуляция когнитивных функций, пирогенный эффект и др.), на периферическом уровне, как будет показано ниже, регулирует синтез половых гормонов, глю- ко- и минералокортикоидов в стероидогенных тканях. Нейроэндокринными эффектами обладают пептиды тимуса, миелопептиды, ^-2, TGFp и другие цитокины. Накопленный огромный фактический материал вызывает потребность осмыслить целостные механизмы и общие закономерности взаимосвязанного функционирования трех систем, и в последние годы такие работы появляются все чаще [6].

Следует, однако, отметить, что при рассмотрении проблем, касающихся «неимммунных» функ
ций иммунной системы, от внимания исследователей нередко «ускользает» еще один очень важный аспект. Это взаимосвязь иммунной системы с системой биотрансформации низкомолекулярных соединений — системой цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, которая включает цитохром Р450 (ЦхР450) и сопряженную с ним электроннотранспортную цепочку. Уникальный по свойствам гемопротеид ЦхР450 обеспечивает внедрение активированного кислорода непосредственно в молекулу субстрата, что приводит к образованию окисленного, более гидрофильного продукта и молекулы воды (рис. 1). Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы являются одной из важнейших гомеостатических систем организма и выполняют две основные функции: 1) биотрансформация поступающих извне химических соединений (ксенобиотиков), которые не являются участниками нормального биохимизма клеток, с целью их элиминации; 2) окислительная биотрансформация (биосинтез или биодеградация) эндогенных липофильных молекул — эндобиотиков (стероидов, арахидонатов, ретиноидов). ЦхР450, в отличие от большинства биокатализаторов, метаболизирует сотни самых различных молекул — от низкоатомных спиртов до полициклических планарных молекул. В основе этого лежит множественность ЦхР450. Это не один фермент, а целое суперсемейство изоферментов с одинаковой каталитической активностью и различной субстратной специфичностью. Часть семейств изоформ катализируют в основном реакции биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A, CYP2B, CYP2С, CYP2D, CYP2E, СYP3A), другие — эндобиотиков. Важнейшим свойством ЦхР450 является активация транскрипции гена в присутствии субстрата — индукция цитохрома. Механизм активации различен для разных изоформ. Выделение системы цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в отдельную регуляторную гомеостатическую систему организма не является «надуманным». Именно ЦхР450 обеспечивает функционирование организма в окружающем мире низкомолекулярных химических соединений и, кроме того, осуществляет утилизацию кислорода с «пластической» целью. Важно, что в процессе монооксигенирования субстратов ЦхР450 в определенных условиях способен к генерации активных форм кислорода, других короткоживущих сигнальных молекул (оксид азота), может осуществлять «биоактивацию» субстратов и поэтому является одной из основных прооксидантных систем организма.

 

 

Подпись: Рис. 1. Окислительная биотрансформация низкомолекулярных ксено- и эндобиотиков с участием суперсемейства цитохром Р450-зависимых монооксигеназ.
 

 

ЦхР450 монооксигеназы может содержаться практически во всех эукариотических клетках. Тканеспецифическая экспрессия различных изоформ ЦхР450 определяет особенности протекающих монооксигеназных реакций и отражает адаптацию этой универсальной ферментной системы к структурно-функциональной организации той или иной системы организма. Так, особенности тканеспецифической экспрессии ЦхР450 в гепа- тоцитах обеспечивают наиболее активное участие этого органа в биотрансформации ксенобиотиков. В надпочечниках и половых железах в основном экспрессированы изоформы, участвующие в биосинтезе стероидных гормонов, в почках — изоформы, участвующие в биотрансформации ксенобиотиков и витамина Д и т.д.

Несмотря на весьма многочисленные работы, свидетельствующие о тесной связи иммунных функций с механизмами монооксигенирования ксено- и эндобиотиков, попытки системного осмысления проблемы немногочисленны. В числе их следует отметить концепцию «иммунохимического гомеостаза» организма И.Е. Ковалева [2], недавние обзорные работы Даниэля Ниберта [64] и Эдварда Моргана [17, 58]. Безусловно, осветить весь обширный материал, посвященный цитокиновой регуляции цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, невозможно и предлагаемый читателям обзор является лишь попыткой привлечь внимание к этой чрезвычайно интересной проблеме, имеющей как теоретическое, так и прикладное значение.

Почти 100 лет назад А.И. Лифшиц (1907) обнаружил, что активность сердечных гликозидов при инфекции повышается: препараты сердечных гликозидов при использовании в аналогичных дозах вызывали более значительную брадикардию у больных брюшным тифом. За прошедшие годы проведено огромное количество экспериментальных исследований феноменологического характера и клинических наблюдений, свидетельствующих о падении уровня ЦхР450 в печени и других тканях и сопряженном с этим угнетением интенсивности биотрансформации различных ксенобиотиков (включая лекарственные препараты) при развитии бактериальных и вирусных инфекций, паразитарных инвазиях, вакцинации и иммунизации различными антигенами, при асептическом воспалении фис. 2). Традиционно приводимым во многих обзорных работах примером является «случай в Сиэттле», произошедший во
время эпидемии гриппа в 1980 г., когда 11 детей поступили в клинику с тяжелой интоксикацией теофиллином, причем переносимость теофилли- на до инфекции была нормальной [45].

 

 

Подпись: Рис. 2. Факторы, вызывающие «иммунологически опосредованную» депрессию цитохрома
Р450.
 

Параллельно с описанными выше исследованиями накапливался обширный материал, свидетельствующий об угнетении ЦхР450-зависимых монооксигеназ печени и связанной с этим нарушением биотрансформации широкого круга ксенобиотиков в условиях фармакологической стимуляции иммунитета — при введении бактериальных ЛПС, полисахаридов, индукторов интерферона, синтетических иммуномодуляторов, а также при иммунизации животных различными антигенами. Эти сведения представлены в многочисленных оригинальных и обзорных статьях [23, 36, 90]. Важным условием, определяющим депри- мирующий эффект иммуностимуляторов на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы гепато- цитов, является активация макрофагов. Сравнительный анализ влияния различных иммуностимуляторов (бактериальные ЛПС, мурамилдипеп- тид, нуклеинат натрия, Т-активин, миелопид, ле- вамизол, диэтилдитиокарбамат натрия, вакцина БЦЖ, зимозан и др.) на фармакометаболизирую- щую активность печени и основные показатели иммунореактивности у мышей показал, что угнетение активности цитохром Р450-зависимых моно- оксигеназ в печени в первую очередь зависит от способности препарата активировать макрофаги и в значительно меньшей степени — от характера его влияния на гуморальный иммунный ответ, контактную гиперчувствительность, трансплантационный и противоопухолевый иммунитет [3].

Уже в ранних работах было отмечено, что угнетение цитохром Р450-зависимых монооксигеназ при введении иммуностимуляторов in vivo требует латентного периода от 6 до 12 ч и не наблюдается при непосредственном добавлении препаратов в культуру гепатоцитов, не содержащую куп- феровских клеток. Доказательства опосредованного эффекта иммуностимуляторов были получены при использовании различных методических подходов. Так, к примеру, активированные купферовские клетки или моно- нуклеары снижали уровень ЦхР450 и интенсивность монооксигенирования в гепа- тоцитах, отделенных проницаемой для белковых молекул мембраной [71]. Сыворотка, взятая у мышей, спустя 9-12 ч после введения им ЛПС, при введении сингенным или аллогенным реципиентам вызывала падение уровня ЦхР450 и депрессию монооксигеназных активностей [24]. Эти и другие эксперименты показали, что угнетение монооксигеназной активности гепатоцитов при развитии воспаления или введении иммуностимуляторов связано с продуцируемыми активированными макрофагами и другими клетками белковыми факторами.

Впервые способность препаратов очищенных рекомбинантных цитокинов вызывать падение уровня ЦхР450 и монооксигеназных активностей при введении экспериментальным животным, в процессе терапевтического использования у человека и при непосредственном добавлении в культуру гепатоцитов было показана в нескольких лабораториях для IFNa, IFN?, их смеси, а также IFNy [28, 78, 80]. Несколько позднее депримирую- щее влияние на цитохром Р450-зависимые моно- оксигеназы в печени было продемонстрировано для IL-1 и TNF [31, 32, 75] и в дальнейшем — для ряда других цитокинов. Такова краткая история вопроса. Ниже мы приводим основные сведения, касающиеся влияния различных цитокинов на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы.

Интерфероны а, в IFN а, в являются основными цитокинами, обуславливающими депрессию монооксигеназной активности печени при вирусных инфекциях. У животных, генетически детерминировано не отвечающих продукцией интерферонов на тот или иной вирус, падения уровня ЦхР450 и угнетения монооксигеназных активностей при инфицировании не наблюдается [71]. Как отмечено выше, в системах in vitro при добавлении в культуры ге- патоцитов IFN а, в также вызывают снижение уровня белка ЦхР450 и угнетают окислительную биотрансформацию различных модельных субстратов. В настоящее время механизм ингибирующего действия интерферонов установлен [21, 33, 57, 58, 59, 71] (рис. 3). Поскольку при воздействии IFN а, в на гепатоциты падению уровня специфических гемопротеидов различных изоформ ЦхР450 в гепатоцитах предшествует снижение уровня соответствующих mRNA, предполагается, что эффект реализуется на претрансляционном
уровне. Связывание интерферонов с соответствующими рецепторами, экспрессированными на мембране гепатоцита, приводит к активации 2’5’-олигоаденилат [2-5(А)] синте- тазы и специфической протеинкиназы Р1. Образующиеся аденилат-олигомеры блокируют сплайсинг mRNA ЦхР450 и активируют латентную эндорибонуклеазу, которая инициирует разрывы mRNA. IFN-активируемая протеинкиназа в свою очередь блокирует активность эукариотического фактора инициации (е№-2), что также нарушает процесс трансляции. Не исключается также, что под влиянием IFN а, в в гепатоцитах активируется ксантиноксидаза, что приводит к избыточной генерации активных форм кислорода (АФК), которые ингибируют активность цитохрома. Ингибиторы ксантиноксидазы (аллопуринол) устраняют депримирующий эффект IFN а, в на монооксигенирование [56]. Эффект IFN а, в проявляется как в отношении конституитивно экспрессируемых, так и в отношении индуцированных различными ксенобиотиками изоформ ЦхР450. Анализ литературы не позволяет сделать однозначных выводов о селективности депримиру- ющего эффекта IFN а, в на отдельные изоформы. Интерфероны блокируют накопление mRNA, соответствующих белков и угнетают активности изоформ подсемейств CYP1A, CYP2B, CYP2C, CYP2E, CYP3A и таким образом способны изменять метаболизм самого широкого круга ксенобиотиков и лекарственных препаратов, биотрансформация которых осуществляется в печени, — полиароматических углеводородов, некоторых токсинов, некоторых антиаритмических средств, психотропных средств, противосудо- рожных средств и др. [55, 59, 61, 81]. Большинство этих данных получено в экспериментальных исследованиях.

Метаболизирующая функция печени нарушается и в процессе интерферонотерапии у человека. Эти данные немногочисленны, что связано со сложностью адекватной оценки активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в клинических условиях. Обнаружено, что при введении рекомбинантного IFNа (3х106 ЕД) онкологическим больным отмечалось существенное нарушение биотрансформации лекарственных препаратов, входивших в состав «проб-коктейля» — клиренс теофиллина снижался на 33 %, антипирина — на

 

 

Подпись: Ц И Т О „КИНЫ


 % [41]. Аналогичные результаты получены при использовании препаратов IFNa у больных активным гепатитом C — подкожное введение рекомбинантного IFNa2в приводило к статистически значимому угнетению метаболизма эритромицина [19]. Угнетение биотрансформации антипирина (клиренс проблекарства снизился с 49 мл/мин до 41,7 мл/мин) выявлено при лечении IFNa

ВИЧ-инфицированных пациентов [14]. Резкое угнетение (более чем на 60 %) метаболизма проб- лекарств в печени наблюдалось в процессе высокодозовой интерферонотерапии (IFNa2в) у 17 пациентов со злокачественнной меланомой [40] и, более того, в этом исследовании была установлена взаимосвязь между ингибицией ЦхР450 и нейротоксичностью препарата. Анализ монооксигеназ- ных активностей в биоптатах печени пациентов с хроническим гепатитом С, получающих лечение IFNв (3x106-9x106 ЕД в сутки в течение 8 нед.), показал существенное угнетение 7-метоксикума- рин-О-деметилазы и 7-этоксикумарин-О-деэти- лазы, что свидетельствовало об угнетении изоформ CYP1A2 и CYP1A1 [67].

IL-1, TNF

С IL-1 и TNF ассоциируется депрессия уровня ЦхР450 и интенсивности биотрансофрмации различных ксено- и эндобиотиков в печени и других тканях при самых различных ситуациях, связанных с активацией иммунной системы и развитием «острофазного ответа». Так, к примеру, для таких мощных индукторов выброса провоспали- тельных цитокинов, как эндотоксины грамнега- тивных бактерий, при введении экспериментальным животным наблюдается четкая корреляция между способностью вызывать эмиссию IL-1 и TNF и депримирующим эффектом на монооксигеназы печени; угнетение транскрипции гена TNF пентоксифиллином приводит к полному устранению эффекта бактериальных ЛПС [53]. У мышей, генетически резистентных к действию ЛПС и не отвечающих продукцией IL-1 при введении эндотоксинов, угнетения монооксигеназ не наблюдается [90]. При использовании различающихся по составу ЛПС было выявлено, что степень падения уровня цитохрома Р450, аминопирин-^деме- тилазной и анилин-р-гидроксилазной активностей в печени мышей при введении в эквивалентных дозах была «зеркальным отражением» их способности стимулировать синтез IL-1? и TNFa в культуре мононуклеаров [5].

Как IL-1, так и TNF угнетают монооксигеназные активности, накопление mRNA и соответствующих белков различных изоформ при непосредственном добавлении в культуру гепатоцитов; блокада рецепторов к IL-1 и TNF на мембране гепатоцитов полностью устраняет эффект этих цитокинов [82].

Механизм ингибирующего действия этих цитокинов, вероятно, близок к описанному выше для IFN — падению уровня иммунореактивных белков различных изоформ цитохрома предшествует снижение соответствующих mRNA (рис. 3) [11, 62, 92]. Ингибирующий эффект IL-1 и TNF, возможно, опосредуется через активацию NF-kB — в промоторном участке генов, кодирующих некоторые изоформы цитохрома (CYP2C11), выявлены сайты связывания этого транскрипционного фактора, а мутация этого участка приводит к полному устранению супрессорного эффекта ЛПС и IL-1 [38]. Обнаружено также, что у р55/р75 «но- каутных» мышей гораздо выше, нежели у мышей «дикого» типа, содержание и индуцибельность CAR (конститутивно-активируемого рецептора) в гепатоцитах — белка, осуществляющего транс- криптационную активацию изоформ CYP2B, CYP3A [87]. Существует еще один механизм, который связан с TNF-зависимой активацией iNOS как в гепатоцитах, так и в купферовских клетках. Образующийся оксид азота связывается с железом гема цитохрома и инактивирует фермент; он способен блокировать ЦхР450 как на претрансляционном, так и на посттрансляционном уровнях [44, 54]. Таким образом, по крайней мере, для TNF выделяют NO-зависимые и NO-независимые механизмы ингибиции монооксигенирования.

Как IL-1, так и TNF не проявляют селективности в отношении отдельных подсемейств цитохрома Р450. Эти цитокины угнетают монооксигеназ- ные активности, уровни белков и mRNA для всех основных подсемейств, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков — CYP1A, CYP2B, CYP2C, CYP3A и др., и таким образом нарушают биотрансформацию самого широкого круга лекарственных препаратов.

Как IL-1, так и TNF вызывают значимое угнетение изоформ ЦхР450, участвующих в метаболизме стероидов. Рекомбинантный TNFa при введении крысам ингибирует реакции 2а/16а-гидро- ксилирования, 6?-гидроксилирования (изоформы CYP2C11 и CYP3A2), в меньшей степени — реакции a-гидроксилирование и 2^-гидроксилиро- вание (CYP2A1 и CYP2C6) в гепатоцитах [62]. TNFa (0,1-10,0 нг/мл), равно как и IL-1, в культуре клеток Лейдига угнетает базальную секрецию тестостерона и активность ключевых ферментов стероидогенеза— десмолазы P450scc (CYP11A1) и 17а-гидроксилазы (CYP17) [35, 93]. На гранулезных клетках яичника выявлены сайты связывания TNFa, а сам цитокин блокировал ФСГ- и инсу- лин-индуцированный синтез прогестерона, угнетал накопление mRNA десмолазы, ингибировал CYP^-зависимую ароматазную активность и биосинтез прогестерона, эстрона и эстрадиола [12, 88]. Способностью ингибировать ароматазу обладает и IL-1 [30]. Можно полагать, что нарушение репродуктивной функции при воспалительных заболеваниях половой сферы может быть обусловлено топической гиперпродукцией воспалительных цитокинов.

TNFa, как, впрочем, и IL-1, угнетает активность CYP27A гидроксилазы, реализующую конверсию холестерина в 27-гидроксиметаболит, а также CYP7A гидроксилазу, осуществляющую дальнейшую окислительную биотрансформацию холестерина до желчных кислот, причем эффект наблюдается не только в гепатоцитах, но и в других тканях [51, 52]. Этот факт подтверждает важную роль провоспалительных цитокинов в патогенезе атеросклеротических поражений.

IL-6, IL-11

Интерлейкин 6 является представителем семейства IL-6-подобных цитокинов, в которое входят также IL-11, LIF, онкостатин М. В культурах изолированных гепатоцитов крысы, гепатомы человека, фетальных гепатоцитов IL-6 снижает уровни mRNA и энзиматическую активность изоформ основных изоформ, осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков (CYP4501A1/2, CYP2B, CYP3A3, CYP2A, CYP2C), причем это касается как конститутивно экспрессируемых, так и индуцированных различными субстратами активностей [8, 29, 68, 91]. При введении IL-6 in vivo, в отличие от IL-1, эффект которого развивается уже через 12 ч, депримирующий эффект IL-6 наблюдается лишь спустя 24 ч после введения, выражен в меньшей степени, но усиливается при совместном введении с дексаметазоном [92]. Близкие результаты получены при сравнении эффектов цитокинов в витральной системе [53] — IL-1a и TNFa в культуре гепатоцитов блокировали мик- росомальное окисление уже через 12 ч после введения в культуру, а IL-6 — только через 24 ч. Возможно, что различия в динамике депримирующе- го эффекта провоспалительных цитокинов на ЦхР450-зависимые монооксигеназы являются отражением реально существующего поэтапного включения цитокинов в острофазный ответ — эмиссия IL-1 и TNF предшествует выбросу IL-6. При этом именно IL-1 является ключевым цитокином, опосредующим активацию гипоталамо-ги- пофизарно-адреналовой цепи и увеличение уровня глюкокортикостероидов. Последние в свою очередь усиливают экспрессию рецептора к IL-6 на мембране гепатоцитов. Интересно, что нокаут гена IL-6 приводил к почти полному устранению депримирующего влияния индуцированного скипидаром асептического воспаления на CYP1A2, 2A5, 3A11 и частично CYP2E1 [77]. Интересно, что параллельная оценка сывороточного уровня С-реактивного белка, IL-1, TNF, IL-6, IL-8 и интенсивности биотрансформации эритромицина (CYP3A) выявила существенную корреляцию между депрессией метаболизма эритромицина, уровнем С-реактивного белка и IL-6, но не остальных цитокинов [72]. В более поздних исследованиях получены чрезвычайно интересные факты: введение ЛПС приводило к нарастанию CYP2E1-зависимых и особенно CYP4A-зависимых моноокси- геназных активностей в печени и в почках у «дикого» типа мышей BWT B6x126, но не изменяло активностей у ^-6-«нокаутных» животных [89].

Равно как IL-1 и TNFa, IL-6, очевидно, непосредственно участвует в регуляции стероидоге- неза в яичниках, однако складывается впечатление, что характер его влияния на стероид-синте- зирующие монооксигеназы иной, т.к. в культуре гранулезных клеток яичника IL-6 стимулирует базальную и ФСГ-стимулированную продукцию прогестерона и CYP^-зависимую ароматазную активность [50]. Отмечен синергидный индуцирующий эффект на синтез эстрогенов в клетках карциномы MCF-7 для IL-6 и растворимого IL-6R, при этом ароматазная активность возрастала более чем в 21 раз [79]. Важно, что возрастающая интенсивность биосинтеза эстрогенов в жировой ткани при старении и ожирении вследствие нарастания ароматазной активности играет важную промо- торную роль в развитии рака молочной железы и рака эндометрия. Ароматазная активность в опухолевой ткани значительно превышает таковую в нормальной ткани, что коррелирует с уровнем IL-6 [69, 70]. Обнаружено, что все семейство IL-6-подобных цитокинов, продуцируемых присутствующими в нормальной и опухолевой ткани фибробластами, индуцирует ароматазную активность в опухолевых клетках и, возможно, лимфоцитах [70], а иммуносупрессия (циклоспорин А), приводящая к снижению продукции цитокинов, вызывает падение ароматазной активности в опухолевой ткани.

Мощным ингибиторным влиянием на ЦхР450 в гепатоцитах обладает и другой цитокин семейства IL-6-подобных цитокинов— IL-11. При добавлении к гепатоцитам в концентрации 0,1 нг/мл IL-11 более чем на 50 % снижал уровень mRNA и белка CYP2C11, в отличие от IL-8, который не обладал ингибирующим эффектом [39].

IL-2, IFNy

К настоящему времени накоплен достаточный, хотя и менее обширный материал, свидетельс- вующий о депримирующем эффекте IL-2 на процессы монооксигенирования в печени. Введение рекомбинантного человеческого IL-2 мышам (50 000-250 000 ЕД) или крысам (1-25х106 ЕД/кг) приводит к удлинению гексобарбиталового сна, угнетению метаболизма бензпирена, бензфета- мина, этилморфина, депрессии уровня ЦхР450 в гепатоцитах, снижению уровня иммунореактив- ных белков CYP1A2, 2B1/2, 2C11, 2D1 и 3A и соответствующих монооксигеназных активностей, а введение IL-2 совместно с индукторами ЦхР450 препятствует индукции [9, 18, 84]. IL-2 был неэффективен у сублетально облученных и nude-животных, при комбинированном введении с препаратами IFN происходит потенциирование эффектов. В системе in vitro инкубация гепато- цитов крысы с рекомбинантным IL-2 приводит к существенному снижению уровня иммунореак- тивных белков CYP1A1, 2B1/2, 2C11, 2D1, 3A2, причем этот эффект устраняется введением в среду антител к IL-2R или ингибитором тирозин- киназы генистеина [86]. ^ижение уровня цитохрома и mRNA в гепатоцитах связано с гиперэкспрессией c-myc, поскольку, с одной стороны, снижение mRNA ЦхР450 идет параллельно нарастанию mRNA c-myc, с другой стороны, наряду с генистеином, падение цитохрома при воздействии IL-2 устраняется агентами, блокирующими транскрипцию с-тус (ретиноевая кислота, DMSO) и усиливающими деградацию с-тус транскриптов — антисенсорный c-myc олигонуклеотид [85].

Клинические результаты были получены у пациентов с метастазирующим колоно-ректальным раком, получавших иммунотерапию в предоперационном периоде. Определение уровня и активности цитохромов в фрагментах печени, взятых при гепатэктомии у больных, получивших низкодозо- вую терапию IL-2 (3-6х106 ЕД/м2), не выявило существенных отклонений в активности отдельных изоформ. У пациентов, получавших высокодозовую терапию (9-12х106 ЕД/м2), выявлена депрессия уровня иммунореактивных белков CYP1A2, CYP2C, CYP2E1 и CYP3A4 и угнетение соответствующих монооксигеназных активностей [25].

IFNy также снижает уровень ЦхР450 в гепато- цитах, что было продемонстрировано еще в ранних работах. Как при введении IFNy экспериментальным животным, так и в системах in vitro этот цитокин вызывал снижение уровня ЦхР450, угнетение окислительной биотрансформации различных «модельных» субстратов (этоксирезоруфин, бензилоксирезоруфин и др.), вызывал снижение уровня mRNA и соответсвующих иммунореактивных белков различных изоформ ЦхР450 [18-20, 42, 83]. Есть мнение, что механизм депримирую- щего действия IFNy несколько отличается от действия остальных цитокинов. При анализе эффекта цитокинов на конституитивную и индуцированную ксенобиотиками экспрессию mRNA и белков соответствующих изоформ в гепатоцитах кроликов было выявлено, что, в отличие от IL-1 и IL-2, IFNy мало влияет на содержание mRNA конституитивных и индуцированных изоформ CYP1A1/2 и CYP3A6, но снижает уровень белков этих изоформ. Иными словами, эффект IFNy реализуется исключительно на посттранскриптационном уровне [15, 16]. Интересно, что при воздействии комбинации цитокинов (IL-1 + IFNy или IL-2 + IFNy) депримирующее действие на CYP3A6 существенно усиливается. В связи с этим следует подчеркнуть, что цитохромы подсемейства CYP3A участвуют в биотрансформации подавляющего большинства лекарственных препаратов, а также реализуют терминальный оксилительный метаболизм большинства стероидов (60-гидро- ксилирование).

IL-4, IL-10

Особенно интересны результаты, полученные при анализе влияния на монооксигенирование ци- токинов с «противовоспалительной» направленностью эффекта— IL-4 и IL-10. Эти исследования малочисленны, однако складывается впечатление, что их эффект отличается от описанного выше преимущественно ингибиторного влияния других цитокинов. В первичной культуре гепатоцитов IL-4 (150 ЕД/мл) оказывал индуцирующее влияние на конституитивную экспрессию изоформы CYP2E1. Эффект был зависим от активации PKCV и блокировался ингибиторами PKC, в то время как ингибиторы PKA не изменяли его [47]. В исследовании [8] также было обнаружено индуцирующее влияние IL-4 на CYP2E1 и отсутствие влияния на CYP1A1 и CYP3A. Параллельно с индукцией CYP2E1 IL-4 активирует экспрессию ферментов II фазы биотрансформации, в частности, глютатион^-трансферазы (GSTa), интенсивность трансляции гена которой, равно как и уровень белка, возрастают после обработки гепатоци- тов IL-4 [48].

Влияние IL-10 на ЦхР450-зависимые монооксигеназы изучалось на здоровых волонтерах в двойном слепом исследовании. В этой работе IL-10 вводили 5-кратно в дозе 8 мкг/кг и по окончании курса оценивали «метаболический профиль» по интенсивности биотрансформации проб-лекарств — толбутамида (CYP2C9), кофеина (CYP1A2), дек- страметорфана (CYP2D6 и CYP3A4) и мидазола- ма (CYP3A4). В результате было обнаружено, что IL-10 снижает на 12 % CYP3A4-зависимую моно- оксигеназную активность, но не влияет на монооксигенирование, зависимое от остальных изоформ [34].

Заключение

Каков биологический смысл цитокиновой модуляции монооксигенирования в условиях острофазного ответа, при активации иммунной системы? Можно полагать, что этот механизм необходим для обеспечения адекватного новому состоянию уровня липофильных эндобиотиков, участвующих в регуляции воспаления и иммунного ответа. Практически все провоспалительные цитокины (IL-1, TNF, IL-6, IL-11, IFNy) и факторы роста (TGF?, EGF, ?FGF, aFGF, KGF) в той или иной степени ингибируют изоформы ЦхР450, участвующие в биотрансформации глюкокортикоидов; эти сведения детально освещены в недавнем обзоре [37]. Этот механизм, помимо центральной регуляции, обеспечивает сохранение необходимого уровня этих ключевых регуляторов воспалительной реакции в условиях «иммунного» стресса, когда вслед за индуцированным провоспалительными цитокинами (в первую очередь IL-1) массивной эмиссией глюкокортикоидов происходит падение их концентрации в организме. Характерная сопряженная динамика изменений макрофагальной активности, интенсивности монооксигенирования в печени и уровня глюкокортикоидов в ответ на введения самых различных иммуноадъювантов (ЛПС Е. coli или S. marcensens, мурамилдипептида, вакцины БЦЖ) представлена в одной из наших работ [4] — во всех случаях прослеживалась идентичная картина.


Помимо изменения биотрансформации глюкокортикостероидов, опосредованно через ЦхР450, провоспалительные цитокины угнетают биотрансформацию холестерина, что в свою очередь обеспечивает его адекватный — в условиях активации иммунитета — уровень в организме. Концентрация холестерина в микроокружении является важнейшим фактором регуляции активации клеток, их пролиферативной активности и апоп- тоза. Нарастание уровня триглицеридов, интенсивная продукция липопротеидов в гепатоцитах необходима, кроме того, для связывания циркулирующих эндотоксинов [51]. Не совсем понятна пока роль цитокиновой модуляции биосинтеза половых стероидов.

Не менее важно и то, что, ингибируя большинство изоформ ЦхР450, цитокины обеспечивают, как это ни удивительно, снижение риска «гипероксидации» при активации иммунной системы и таким образом участвуют в регуляции нормального баланса про- и антиоксидативных процессов. Интенсивная работа гексозомонофосфатного шунта и усиленная продукция редокс-эквивалентов (НАДФ-Н) — отличительный признак биохимизма и фагоцитов, и гепатоцитов при их активации. В этих условиях избытка НАДФ-Н резко возрастает риск генерации ЦхР450 активных радикалов кислорода на различных этапах монооксигениро- вания [7, 13, 22]. В работе [73] впервые проводится такая параллель: исследователи обнаружили, что введение ^-1, наряду со снижением уровня mRNA CYP2B1 в микросомах, приводит к угнетению ЦхР450 — опосредованнной генерации супероксида. Немаловажно и то, что ЦхР450 (CYP3А) способен катализировать оксидативное расщепление C=NOH связи ^гидроксигуанидинов, ами- доксимов, кетоксимов, альдоксимов с образованием соответствующих С=О-продуктов и оксида

Угнетение большинства изоформ ЦхР450, участвующих в биотрансформации низкомолекулярных липофильных ксено-и эндобиотиков

Индукция изоформ цитохрома, 'ч обеспечивающих синтез эндогенных } антифлогистиков у

Роль цитокин-опосредованной депрессии цитохрома Р450 в механизмах поддержания гомеостаза и адаптации в условиях «иммунного» стресса.

азота — не-i-NOS-зависимое образование N0 из ^гидроксиаргинина [43, 60]. Обнаружено, что подавление CYP3A приводит к супрессии выработки N0 в гепатоцитах, индуцированной ЛПС или цитокинами [27, 46], а индукция CYP3A— к увеличению ЛПС-индуцированной генерации N0 ге- патоцитами.

Не случайна и индукция некоторых изоформ ЦхР450 при острофазном ответе. Это касается подсемейств CYP4A, CYP4F и частично CYP2E1 [10, 74]. Эти изоформы осуществляют биотрансформацию одного из основных медиаторов воспаления — LTB4, а также реализуют «цитохромный путь» метаболизма арахидонатов с образованием гидроксиметаболитов— 17-, 18-, 19-, 20-0Н-ара- хидоновой кислоты (ю/ю-1-окисление) и эпокси- эйкозатриеноевых кислот (EETs) (эпоксигениро- вание). Продукты «цитохромного пути», помимо мощного локального и дистантного вазотропного действия, угнетают экспрессию молекул адгезии, снижают активацию NF-kB, являются антагонистами пирогенного эффекта ^-1, т.е. проявляют эндогенный антифлогистический эффект [63, 66].

Таким образом, благодаря цитокиновой модуляции процессов монооксигенирования на ЦхР450, реализуется адаптация механизмов биотрансформации низкомолекулярных ксено- и эндобиотиков в условиях активации иммунной системы («иммунного» стресса) (рис. 4). Это обеспечивает, с одной стороны, защиту от последствий возможной неконтролируемой активации потенциально опасной для организма ферментной системы, с другой — сохранение необходимого уровня и неогенез необходимых для адекватного «ответа» организма низкомолекулярных липофильных сигнальных молекул. Вмешательство в сложившийся механизм саморегуляции, в частности, индукция монооксигенирования, в условиях воспалительной реакции весьма «небезо-


пасна» для организма, поскольку увеличивает риск альтеративных процессов, в том числе и обусловленных свободнорадикальными механизмами. Все больше накапливается работ, свидетельствующих, что ксенобиотики, вызывающие индукцию ЦхР450 (рифампицин, этанол, полихлорированные дибензодиоксины и др.), вызывают гиперпродукцию провос- палительных цитокинов, повышают чувствительность к бактериальным эндотоксинам, вирусным инфекциям, сенсибилизируют гепатоциты и другие клетки к рецепторно-индуцированному и нерецепторному апоптозу [26, 49, 65, 76].

Резюмируя изложенное, хотелось бы остановиться на следующих моментах. Представленные

сведения, на наш взгляд, расширяют представления о цитокинах как универсальных посредниках, реализующих взаимодействие иммунной системы с другими системами организма, обеспечивающими сохранение гомеостаза и, в конечном счете, выбор адаптационной стратегии [1, 4, 6] в окружающем мире. Углубленное изучение цито- киновой модуляции ЦхР450-зависимого моноок- сигенирования экзо- и эндогенных низкомолекулярных соединений, безусловно, позволит выявить новые закономерности и переосмыслить некоторые уже известные факты, сформировать новые подходы к терапии иммунопатологических состояний.


.

Правила оформления статей

Редакция журнала «Цитокины и воспаление» предъявляет к авторам оригинальных статей следующие требования, которые соответствуют международным правилам построения публикаций и резюме к ним.

Объем. Объем оригинальной статьи — до 15 машинописных страниц (включая рисунки, таблицы, список литературы, русское и английское резюме), число ссылок — не более 15. Объем обзоров согласовывается с редакцией журнала, число ссылок — не более 60.

Структура. В начале первой страницы пишутся: 1) инициалы и фамилии авторов; 2) название статьи; 3) названия учреждений, из которых вышла работа; 4) город (города), где находится учреждение. Затем следуют: введение (с указанием целей исследования); материалы и методы; результаты и обсуждение; благодарности (ссылки на гранты и т.п.); литература; резюме на русском языке; резюме на английском языке; таблицы; рисунки или фотографии; подписи к рисункам. В конце статьи обязательно должна быть собственноручная подпись каждого автора и полностью указаны имя, отчество и фамилия, точный почтовый и электронный (если есть) адрес и телефон того, с кем вести переписку.

Резюме на русском языке (около 200 слов) должно отражать цель исследования, материалы и методы, результаты, заключение, ключевые слова (не более 5). Резюме на английском языке имеет такую же структуру.

При оформлении статей редакция просит соблюдать следующие правила.

Авторский оригинал статьи в 2 экземплярах должен быть напечатан на одной стороне листа формата А4 с двойным интервалом между строками и с обычными полями. Одновременно необходимо прислать статью в электронном виде (на дискете 3,5” или по электронной почте), набранную в текстовых редакторах Word, WordPad или других приложениях Windows. Текст электронной и печатной версий должен быть идентичен. При наборе не нужно выполнять форматирование текста (т.е. заголовки и подзаголовки следует набирать как отдельный абзац, не выделяя их прописными буквами; не расставлять переносы вручную; не использовать пробелы или табуляцию для центровки строк и выравнивания текста; таблицы набирать, используя табуляцию между колонками).

Статья должна быть тщательным образом проверена автором. Химические формулы, таблицы, дозировки, цитаты визируются автором на полях.

Графики и рисунки должны быть предоставлены в электронном виде — по электронной почте или на любом другом носителе — в графических форматах TIF, JPG, BMP, PSD (с разрешением не менее 300 dpi), CDR, AI, FH, в противном случае — напечатаны на лазерном или струйном принтере с разрешением не менее 600 dpi. Диаграммы и графики необходимо сопровождать таблицей цифровых данных, по которым они были построены. Фотографии желательно присылать в виде качественных оригиналов (сканировать самим не нужно). На каждом рисунке или фотографии карандашом на обороте указать номер рисунка, фамилию первого автора и название статьи, обозначить верх и низ. Подписи к рисункам обязательны.

Список литературы должен быть оформлен в соответствии с ГОСТ 7.1-84.

Не допускается направление в редакцию работ, которые уже опубликованы или посланы для публикации в другие издания.

Корректура авторам не высылается. Вся дальнейшая сверка проводится по авторскому оригиналу (для ускорения процесса желателен электронный адрес авторов).

Рукописи рекомендуем отправлять по электронной почте в виде вложенных файлов (attachments). Посылка рукописи по электронной почте не исключает необходимости присылать текст статьи обычной почтой.

 

 

 

© Коллектив авторов, 2003 УДК 616.921.5-0.85:612.017.1

 



загрузка...