ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
Исследовали апоптоз и пролиферативную активность лимфоцитов селезенки и назоассоцииро- ванной лимфоидной ткани (НАЛТ) мышей при гриппозной инфекции и интраназальной вакцинации аттенуированным реассортантным вирусом гриппа (Р 2/6). Обнаружены значительные отличия интенсивности физиологического апоптоза лимфоцитов селезенки и НАЛТ (соответственно 20-30 % и 6-9 %). В обоих органах как нелетальная гриппозная инфекция, так и однократная вакцинация Р 2/6 сопровождались лишь кратковременным (24 ч) увеличением уровня апоптоза лимфоцитов, а повторное введение и патогенного вируса, и Р 2/6 вообще не вызывало усиления апоптоза. В селезенке вторичный клеточный пролиферативный иммунный ответ был более выражен, чем в НАЛТ. Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что вакцинация живым вирусом штамма Р 2/6 (аналог вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины) и неосложненная форма гриппозной инфекции иммунологически безвредны с точки зрения возможной индукции апоптотического дисбаланса иммунной системы. (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 3. С. 34-39.)
Программированная гибель клеток (апоптоз) играет ключевую роль во многих физиологических и патологических иммунных процессах. Наименее изучена роль апоптоза в противовирусном иммунитете. В опытах in vitro показано, что вирусы гриппа А способны индуцировать апоптоз не только эпителиальных клеток, в которых они размножаются [15], но и клеток иммунной системы: макрофагов [9], нейтрофилов [6] и лимфоцитов [11]. Выдвинута гипотеза о существовании апоптоти- ческих дисбалансов иммунной системы, проявляющихся в форме приобретенных иммунодефицитов [1]. Поскольку вирус гриппа является индуктором апоптоза лимфоцитов, теоретически можно предположить, что этот возбудитель может быть причиной перевода физиологического апоп- тоза этих клеток в патологический, приводящий к дисфункции Т- и В-клеточного иммунитета. Поиск ответа на этот вопрос актуален с точки зрения оценки последствий как гриппозной инфекции, так и массовой вакцинации гриппозными вакцинами.
Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном экспериментальном исследовании in vivo апоптоза и пролиферативной активности лимфоцитов разных лимфоидных органов при гриппозной инфекции и вакцинации живым аттенуированным реассортантным вирусом гриппа — экспериментальным аналогом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины (ЖГВ).
Локальные иммунные реакции в месте первичного контакта возбудителя гриппа с организмом изучали на базе назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ) мышей. Эта ткань, открытая в начале 90-х годов прошлого века у грызунов, является аналогом лимфоглоточного кольца Пирого- ва-Вальдеера у людей. Японскими авторами обоснована высокая результативность исследования клеточного местного противогриппозного иммунитета на базе НАЛТ [5]. У людей прямое изучение локальных клеточных антигенстимулированных иммунных реакций крайне затруднительно. В этой связи знания об иммунном ответе в НАЛТ дают представление об иммунных процессах в эквивалентной человеческой лимфоидной ткани.
Модель гриппозной инфекции и вакцинации. Для заражения мышей использовали 8-10-недельных самцов линии BALB/ с. Животным вводили интраназально в нелетальной дозе два вируса гриппа A(H1N1): (i) патогенный для мышей A/PR/8/34 (4,0 1дЭИД50/0,1 мл); (ii) экспериментальный аналог вакцинного штамма для ЖГВ —холодоадаптированный реассортант 2/6 (6,0 1дЭИД50/0,1 мл), имеющий 2 гена поверхностных белков (гемагглютинина и нейраминидазы) от (i) и все 6 генов внутренних белков от донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2). Этот донор аттенуации долгие годы применялся в России для производства ЖГВ. Повторное заражение осуществляли через 21 день после первичной инокуляции вирусов. Каждая группа состояла из 5 животных.
Клетки. Выделение и приготовление суспензии спленоци- тов осуществляли традиционными методами [2]. Сепарацию НАЛТ проводили способом, разработанным H. Asanuma et al. [5]. Мышам под эфирным наркозом производили цервикальную дислокацию, после чего отрезали верхнюю челюсть по линии глазных яблок. После отделения кожи носовую часть освобождали от щечных мышц, верхнечелюстных костей, мягкого неба, кончика носа и резцов. Оставшаяся носовая часть состояла из носовых ходов (носовая перегородка, боковые стенки, твердое небо). После сепарации небной пластинки выделяли непосредственно НАЛТ— парные лимфоидные образования по бокам носовой перегородки со стороны задней части неба. Доли НАЛТ осторожно гомогенизировали с помощью замороженных предметных стекол с матовым краем (Biovitrum, Россия). Лимфоциты НАЛТ отмывали, ресуспендировали и стандартизировали аналогично лимфоцитам селезенки.
Пролиферативную активность лимфоцитов (ПАЛ) оценивали методом восстановления красителя МТТ с использованием МТТ [10]. После двукратной отмывки в 10 мМ фосфатном буфере (pH 7,4) лимфоциты ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия), содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров. Взвесь лимфоцитов (1 х 10 кл./мл) вносили по 50 мкл в 96-луночные планшеты (Sarsted Co., USA). В качестве специфического стимулятора культур лимфоцитов использовали инактивированный (56 °С, 60 мин) вирус A/PR/8/ 34 (H1N1). Его вносили в концентрации 20 АЕ/лунку в объеме 50 мкл. Планшеты инкубировали 72 ч во влажной атмосфере, содержащей 5 % СО2. Далее в культуры клеток вносили MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид; ICN Pharmaceutical, США) в финальной концентрации 5 мкг/мл и инкубировали 4 ч при 37 °С. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли по 100 мкл экстрагирующего раствора (0,04 N HCl в изопропаноле). Оптическую плотность (ОП) учитывали на спектрофотометре (Bio-Tec Instruments, Finland) при длине световой волны 570 нм. Индекс стимуляции лимфоцитов определяли по соотношению ОП лунок, стимулированных вирусом лимфоцитов к ОП контрольных лунок, в которые вместо стимулятора вносили среду RPMI-1640 в том же объеме.
Апоптоз лимфоцитов определяли с помощью стандартного набора ингредиентов (BD Pharmingen, USA). О числе (%) клеток с признаками апоптоза судили по интенсивности связывания мембранного фосфатидилсерина с конъюгатом ан- нексин V-ФИТЦ [19] при проточной цитофлуориметрии на приборе FACS CaLibur (Becton Dickinson, USA).
Антитела в назофарингеальных и бронхолегочных смывах выявляли в иммуноферментном анализе с помощью тест- системы для определения у мышей общего пула IgA-, IgG- и IgM-антител (ICN Pharmaceutical, USA).
В табл. 1 представлены наиболее важные биологические характеристики использовавшихся в работе вирусов, касающиеся их вирулентности (патогенности), репродуктивной и иммуногенной активности.
50 % летальная доза для мышей вируса A/PR/ 8/34 (H1N1) оказалась минимум в 1,8 раза ниже (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем для реассортанта 2/6, что свидетельствует об аттенуации последнего. При этом в легких патогенный штамм размножался в 2,6-3,2 раза активнее, чем аттенуированный реассортант (р < 0,01), тогда как в верхних дыхательных путях репродуктивная активность реассортанта в первые сутки была даже выше (р < 0,001). Однако интенсивность репродукции аттенуированного реассортанта в этом участке слизистой оболочки на 3-7-е сутки снижалась быстрее. Иммуногенная активность исследуемых вирусов (локальные антитела в верхних и нижних отделах респираторного тракта) отражала данные об интенсивности их репродукции.
Таким образом, реассортант 2/6, использовавшийся нами в качестве экспериментального аналога вакцинного штамма для ЖГВ, отвечал главным требованиям, предъявляемым к производству таких штаммов, а именно отличался достаточной аттенуацией и резким снижением способности к размножению в легких.
Далее в восьмикратно повторенных опытах были определены контрольные значения, характеризующие уровень апоптоза и пролиферативной активности лимфоцитов НАЛТ и спленоци- тов у незараженных мышей (табл. 2). Усредненные показатели физиологического апоптоза сплено- цитов в 3,1 раза превосходили такие же данные для лимфоцитов НАЛТ (р < 0,01). Стимуляция лимфоцитов обоих органов вирусом гриппа практически не приводила к заметному повышению индексов стимуляции этих клеток по отношению к нестимулированным культурам (значения индексов стимуляции в пределах 1,0—1,2). Доля клеток в НАЛТ и селезенке с признаками физиологического апоптоза колебалась незначительно (соответственно в пределах 6-9 % и 20-30 %).
На рис. 1 отражена динамика показателей апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки после первичного и повторного заражения мышей изучаемыми вирусами. Через 24 ч после первичного заражения как патогенным штаммом, так и аттенуированным реассортантом, доля клеток обоих органов с признаками апоптоза увеличилась в 3,2-8,8 раза (р < 0,01) в сравнении со средними значениями контрольных показателей, приведенными в табл. 2. Однако через 48 ч уровень апоп- тоза лимфоцитов снизился до исходных значений, т. е. до уровня физиологического апоптоза. Таковым он оставался и через неделю после заражения. Вторичный иммунный ответ на оба вируса вообще не сопровождался индукцией апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки.
Доказательством состоявшегося локального клеточного иммунного ответа на эти вирусы служат данные о динамике показателей ПАЛ в НАЛТ и селезенке тех же мышей в те же временные интервалы (рис. 2). Обращает на себя внимание то, что через 24 ч после первичного заражения, т. е. в то же время, когда наблюдался подъем уровня апоптоза лимфоцитов, отмечена супрессия клеточного иммунитета, проявлявшаяся в снижении показателей ПАЛ ниже контрольных значений (р < 0,05). Вторичный иммунный ответ, опосредованный ПАЛ, оказался более выраженным в селезенке, чем в НАЛТ.
% НАЛТ
% Селезенка
ф — патогенный вирус А/Ріу8/34 (НІМІ)
— аттенуированный реассортант 2/6
Рис. 1. Динамика апоптоза лимфоцитов в НАЛТ и селезенке при гриппозной инфекции и вакцинации
А - первичное заражение, Б - повторное заражение. По оси ординат - процент лимфоцитов с признаками апоптоза, по оси абсцисс - время после первичного и повторного введения вирусов.
Нами показано, что у незараженных мышей частота обнаружения лимфоцитов селезенки и НАЛТ, несущих мембранный маркер апоптоза (фосфатидилсерин), отличается (соответственно 20-30 % и 6-9 % — см. табл. 1). Скорее всего, эти
ИС НАЛТ
ИС Селезенка
ф — патогенный вирус A/PR/8/34 (H1N1)
—? аттенуированный реассортант 2/6
Рис. 2. Динамика пролиферативной активности лимфоцитов
НАЛТ и селезенки при гриппозной инфекции и вакцинации
А - первичное заражение, Б - повторное заражение. По оси ординат - индексы стимуляции (ИС) лимфоцитов вирусом A/PR/8/34 (H1N1), по оси абсцисс - время после первичного и повторного введения вирусов.
фоновые показатели отражают степень интенсивности физиологического апоптоза «отработавших» зрелых Т- и В-клеток в этих лимфоидных органах, если учитывать, что содержание обоих типов клеток в селезенке значительно выше, чем в НАЛТ [17]. Однако нельзя исключить, что приведенные данные о количестве клеток с признаками апоптоза связаны с разными темпами их фагоцитарной элиминации в этих органах, поскольку мембранный фосфатидилсерин является объектом распознавания макрофагами таких «ненужных» для организма лимфоцитов.
Нами установлено, что и первичная нелетальная гриппозная инфекция, и первичная вакцинация аттенуированным реассортантом сопровождается лишь очень кратковременным (24 ч) увеличением уровня апоптоза лимфоцитов как селезенки, так и
НАЛТ (см. рис. 1). Близкие по значению результаты получены американскими авторами в отношении спленоцитов мышей, зараженных сублеталь- ной дозой вируса A/PR/8/34 (Ш№) [20]. Однако при летальной гриппозной инфекции, вызванной тем же штаммом, мы наблюдали у мышей перед их гибелью (7-й день) резкое увеличение уровня апоптоза спленоцитов (48 ч) на фоне значительного падения показателей их пролиферативной активности [2]. В более ранней работе приведены данные, свидетельствующие о резком снижении числа лимфоцитов крови и наличии признаков фрагментации ДНК лимфоцитов селезенки (важнейший показатель апоптоза) именно через 24 ч после заражения цыплят высокопатогенным для них птичьим вирусом гриппа А (^N9) [18].
Таким образом, наши и литературные данные свидетельствуют о том, что при очень тяжелой форме гриппозной инфекции развивался глубокий апоптотический дисбаланс клеточного иммунитета, а в случае неосложненного гриппа и вакцинации аттенуированным штаммом наблюдался только очень непродолжительный транзитор- ный эффект запуска вирусом апоптоза лимфоцитов. Точно объяснить причину этого феномена пока затруднительно из-за низкого уровня знаний о молекулярных механизмах вирусинду- цированного апоптоза.
Обосновано доминирующее участие клеточного Fas-антигена в запуске вирусами гриппа А апоптоза лимфоцитов [11, 16]. В опытах по заражению культур лимфоцитов вирусом гриппа А доказано повышение экспрессии на этих клетках не только группы Fas-рецептор/Fas-лиганд, через которую транслируется сигнал к запуску программы их гибели, но и ингибитора апоптоза протоонкогена Bcl-2 [13]. Имеются сведения о блокирующем воздействии на апоптоз лимфоцитов IFNa, №N0, ^N7 и ^-6 [8, 16]. Совокупность этих данных позволяет высказать следующую гипотезу. При первичной встрече организма с вирусом гриппа А, в ответ на его апоптотическую экспансию, направленную на подавление клеточных иммунных реакций на ранних сроках репликации, включаются защитные механизмы, отменяющие апоптотическую гибель стимулированных лимфоцитов с помощью гиперэкспрессии Bcl-2 и/или продукции ингибирующих апоптоз интерферонов и интерлейкинов. При тяжелых генерализованных формах гриппа (у мышей — летальная форма) происходит срыв этих процессов. Во всяком случае, драматическое увеличение уровня апоптоза периферических моно- нуклеаров наблюдали у людей при тяжелых гнойно-септических инфекциях [4]. Кроме того, показано, что высоковирулентный штамм вируса гриппа А обладал значительно большей способностью индуцировать апоптоз клеток MDCK по сравнению с аттенуированным вариантом [14].
Нами продемонстрировано, что вторичный иммунный ответ как при гриппозной инфекции, так и при вакцинации вообще не сопровождался усилением апоптоза лимфоцитов НАЛТ и селезенки (см. рис. 1). С высокой долей достоверности можно предположить, что в значительной степени это связано со сменой репертуара Т- и В-клеток, пролиферирующих в ответ на повторную антигенную стимуляцию тем же штаммом. В этом случае среди популяции лимфоцитов преобладают клетки имму- нологичесой памяти. Считается, что В-клетки памяти (несущие антигенспецифичные IgG) и Т-клетки памяти практически защищены от апоптоза [7, 12].
Таким образом, приведенные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что проблема «вирус гриппа А — апоптоз лимфоцитов» относится лишь к первичному иммунному ответу. Применительно к гриппозной инфекции, обусловленной вирусом А, такая ситуация возникает только у детей раннего возраста при первичном контакте с возбудителем или у людей разных возрастных групп при встрече с совершенно новыми для них высоковирулентными шифтовыми пандемическими вариантами вируса. Именно в таких ситуациях отмечается повышенная смертность от гриппа. Конечно, в этих случаях рост смертельных исходов связан как с отсутствием у людей иммунологической памяти к шифтовым штаммам, так и высокой вирулентностью последних. Однако нельзя исключить, что в данных ситуациях играют роль и особые свойства вируса индуцировать апоптоз клеток иммунной системы. Возможно, что это относится и к птичьим вирусам гриппа А, которые способны вызывать у людей тяжелые формы инфекции.
С другой стороны, результаты исследования поствакцинального иммунного ответа с высокой долей вероятности дают основания утверждать, что как первичное, так и повторное введение аттенуированного варианта вируса гриппа А иммунологически безвредно с точки зрения возможности возникновения вирусиндуцированного апоптотического дисбаланса локального и системного иммунитета.
Считается, что апоптоз и пролиферация лимфоцитов являются альтернативными процессами [3]. По нашим данным, такая зависимость четко обозначилась только при первичном иммунном ответе через 24 ч после заражения животных (см. рис. 1 и 2). На других сроках первичного и вторичного иммунного ответа не была отмечена обратная зависимость между этими показателями, т. е. на фоне физиологического уровня апоптоза лимфоцитов наблюдался существенный рост их пролиферативной активности. В этой связи можно высказать весьма осторожное предположение, что не во всех случаях данные об интенсивности пролиферации общего пула Ти В-лимфоцитов отражают состояние апоптоза этих клеток.
И, наконец, более выраженный вторичный пролиферативный иммунный ответ в селезенке по сравнению с НАЛТ, как нам представляется, косвенно свидетельствует о большей насыщенности этого основного органа иммунной системы клетками иммунологической памяти. Скорее всего, это относится к IgG+-В-лимфоцитам, чем к CD4+CD45RO+- и CD8+CD45RO+-Т-клеткам.
Впервые проведено параллельное изучение апоптоза и пролиферации лимфоцитов НАЛТ и селезенки в процессе развития иммунного ответа при нелетальной гриппозной инфекции и вакцинации мышей аттенуированным реассортан- том с генетической формулой 2/6 — экспериментальным аналогом вакцинного штамма для ЖГВ.
Динамика показателей апоптоза и пролиферации лимфоцитов в НАЛТ и в селезенке при гриппозной инфекции и вакцинации существенно не различается.
Кратковременный подъем количественных показателей апоптоза лимфоцитов на ранних сроках репликации вирусов (24 ч) возникает только при первичном, но не при вторичном по- стинфекционном и поствакцинальном иммунных ответах.
В селезенке вторичный клеточный пролиферативный иммунный ответ более выражен, чем в НАЛТ.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу иммунологической безвредности ЖГВ в отношении возможности индукции апоптотических иммунодефицитных состояний. По-видимому, это относится и к неосложненным формам гриппозной инфекции.
Норкин М.Н., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Роль апоптоза и анергии Т-клеток в патогенезе гнойно-септических заболеваний // Мед. иммунология. — 2000. — № 1. — С. 35-42.
Asanuma H., Thompson A.H., Jawasaki T. et al. Isolation and characterization of mouse nasal-assotiated lymphoid tissue // J. Immunol. Meth. —
— Vol. 202. — P. 123-131.
English G., White M., Harshorn K.L. Role of the respiratory burst in co-operative reduction of neutrophil survival by influenza A virus and Esherischia coli // J. Med. Microbiol. — 2002. — Vol. 51. — P. 484-490.
Grayson J.M., Harrington L.E., Lannier J.G. Differential sensitivity of nanve and memory CD8+ T cells to apoptosis in vivo // J. Immunol. — 2002. — Vol. 169. — P. 3760-3770.
Lenardo M.J. Introduction: The molecular regulation of lymphocyte apoptosis // Semin. Immunol. — 1997. — Vol. 9. — P. 1-5.
Lowy R., Dimitrow D.S. Characterization of influenza virus-induced death of J774.1 macrophages // Exp. Cell Res. — 1997. — Vol. 234. — P. 249-258.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. — 1983. — Vol. 65. — P. 55-63.
Nichols J.E., Niles J.A., Roberts N.J. Human lymphocytes after exposure to influenza A virus // J. Virol. — 2001. — Vol. 75, № 13. — P. 5921-5929.
Nunez G., Hockenlery D., Mc Donnell T.J. et al. Bcl-2 maintains B cell memory // Nature. — 1991. — Vol. 353. — P. 71-73.
Prise G., Smith H., Sweet C. Differential induction of cytotoxicity and apoptosis by influenza virus strains of differing virulence // J. Gen. Virol. — 1997. — Vol. 78. — P. 2821-2829.
Schultz-Cherry S., Krug R.M., Hinshaw V.S. Induction of apoptosis by influenza virus // Semin. Virol. — 1998. — Vol. 8. — P. 491-495.
Takizawa T., Fucuda R., Miyawaki T. et al. Activation of apoptosis Fas antigenencoding gene upon influenza virus infection involving spontaneously produced beta-interferon // Virol. — 1995. — Vol. 209. — P. 288-296.
Tamura S., Kurata T. Defence mechanisms against influenza virus infection in the respiratory tract mucosa // Jpn. J. Infect. Dis. — 2004. — Vol. 57. — P. 236-247.
Van Campen H., Easterday B.C., Hinshaw V.S. Destruction of lymphocytes by virulent avian influenza A virus // J. Gen. Virol. — 1989. — Vol. 70. — P. 467-472.
Van Engeland M., Nieland L.J., Ramaekers F.C. et al. Annexin V — affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry. — 1998. — Vol. 31. — P. 1-9.
Zhang Y., Wang Y., Gilmore X. et al. Apoptosis and reduced influenza A virus specific DC8+ T cells in aging mice // Cell Death Differ. — 2002. — Vol. 9. — P. 651-660.
Apoptosis and proliferation of nasopharyngeal lymphoid tissue and spleen lymphocytes after the experimental influenza infection and vaccination
P. Grigorieva, L.G. Rudenko Institute of Experimental Medicine RAMS, St. Petersburg
The study of apoptosis and lymphoproliferative activity of mice spleen lymphocytes and nasopharyngeal lymphoid tissue (NALT) after influenza infection or intranasal vaccination with attenuated reassortant virus (R 2/6) was carried out. Significant differences in physiological apoptosis intensity were observed in splenocytes and NALT lymphocytes of intact non-infected mice (20-30 % and 6-9 % respectively). Non-lethal influenza infection and single vaccination with R 2/6 were accompanied by a short-term (24 h) increase in lymphocyte apoptosis levels in both NALT and spleen. Second contact with pathogenic virus or R 2/6 did not intensify lymphocyte apoptosis in these organs. Secondary cellular lymphoproliferative immune responses in the spleen were higher, than in NALT. Experimental data indicated that vaccination with R 2/6 (analogous to live influenza vaccine strain) and non-complicated forms of influenza infection did not influence apoptosis of immune cells. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 3. P. 34-39.)
