загрузка...
 
Изменение регуляторных функций дендритных клеток после трансфекции siRNA IL-12p35
Повернутись до змісту

Изменение регуляторных функций дендритных клеток после трансфекции siRNA IL-12p35

Т.Е. Иком, И.А. Попов, Е.К. Олейник

Отделение хирургии, Университет Вестерн Онтарио, Лондон, Онтарио, Канада;

Институт биологии Карельского научного центра РАН, Петрозаводск, Россия

Изучали последствия индукции РНК-интерференции (RNAi) в дендритных клетках (ДК) костного мозга мышей с использованием коротких интерферирующих двунитевых РНК (siRNA), специфичных к гену IL-12p35. Трансфекция siRNA IL-12p35 приводит к снижению продукции биоактивного IL-12p70 и значительным изменениям регуляторных функций ДК: усилению продукции IL-10 и снижению способности ДК стимулировать аллогенные Т-клетки в смешанной культуре лимфоцитов. При использовании ДК с выключенным геном IL-12 для стимуляции аллогенных Т-клеток наблюдается переключение иммунного ответа Th1 > Th2, что проявляется в снижении экспрессии гена IFNy и увеличении продукции IL-4. Таким образом, введение siRNA IL-12p35 в ДК является эффективным способом индукции иммунной модуляции, причем основной механизм заключается в изменении профиля секретируемых цитокинов, в частности, усилении продукции IL-10. Данный способ изменения функций ДК может быть использован в разработке генетических методов терапии широкого круга заболеваний. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 1. С. 29-34.)

Ключевые слова: дендритные клетки, выключение гена, РНК интерференция (RNAi), короткие интерферирующие РНК (siRNA), цитокины.

В последние годы становится ясным, что дендритные клетки (ДК) являются главными регуляторами иммунного ответа. ДК оказывают прямое или непрямое воздействие на стимуляцию или подавление функций Т-клеток, В-кле- ток, NK, NKT [10, 12]. Среди всех антиген-пре- зентирующих клеток ДК считаются наиболее мощными активаторами Т-клеток, и обладают уникальной способностью к поляризации иммунного ответа в сторону ^1 или ^2. №1 характеризуются высоким уровнем секреции INFy и ^-2, в то время как №2 отличаются высоким уровнем секреции ^-4 и ^-13. Известно, что при различных заболеваниях человека происходит подобная поляризация иммунного ответа. Поэтому интерес к изучению регуляторных свойств ДК возрастает.

ДК способны несколькими путями активировать Т-клетки: они передают сигнал об антигене с помощью молекул MHC, вырабатывают кости- муляторный сигнал, который ассоциируется с такими мембраносвязанными молекулами, как CD40, CD80/86 и OX40L [13], а также продуцируют растворимые цитокины, которые индуцируют Т-клеточную дифференцировку в Th1-фенотип (^-12) или №2-фенотип (^-10) [11]. Когда любой из этих трех сигналов ингибируется, Т-клетки могут подвергаться апоптозу, анергии, №2-сдви- гу или дифференцироваться в Т-регуляторные клетки (Treg). Показано, что ДК играют ключевую роль в поддержке аутотолерантности, а также, возможно, в формировании иммуносупрессии при опухолевом росте посредством генерирования Т-регуляторных супрессорных лимфоцитов CD4 + CD25 + [1, 3].

Между субпопуляциями ДК, которые стимулируют или супрессируют иммунный ответ, существуют различия в экспрессии цитокинов, а также костимуляторных молекул. Экспрессия IL-12, по-видимому, стимулирует активацию Th1, в то время как продукция IL-10 стимулирует активацию Th2, а также генерацию Treg [14]. Из этого следует, что ДК могут быть использованы в иммунотерапии для усиления Т-клеточного ответа (в случае развития опухолей) или для его снижения (при аутоиммунных расстройствах, при трансплантации органов). В связи с этим ДК представляют собой очень привлекательный объект для индукции иммунной модуляции с целью разработки целенаправленных методов иммунотерапии.

Одним из наиболее перспективных методов селективного выключения генов является индукция РНК-интерференции (RNA-interference — RNAi). Известно, что RNAi — это эндогенный клеточный механизм защиты против репликации вирусов [8]. При распознавании двунитевыми РНК (dsRNA) проникающих в клетку «опасностей» происходит деградация любых мРНК-транскриптов, гомологичных этим dsRNA. В ряде работ было показано, что даже очень короткие последовательности РНК длиной в 21-23 нуклеотида (small interfering RNA — siRNA) могут вызвать полную супрессию IFN-ответа и привести к деградации близких мРНК [2, 5]. Этот процесс оказался чрезвычайно специфичным, т. к. даже одна единственная замена в 21-нуклеотидной последовательности практически отменяла все эффекты siRNA. Также показано, что siRNA включаются в энзиматический комплекс, который проводит множество повторяющихся циклов деградации мРНК-ми- шени, что обеспечивает высокую эффективность RNAi [15]. Таким образом, RNAi представляет собой мощный способ ингибирования эндогенной экспрессии генов и, следовательно, может быть средством эффективной модуляции иммунного ответа.

Искусственная индукция RNAi может быть использована в терапевтических целях для выключения определенных, например, патологических генов. Поскольку RNAi — это природный механизм защиты, то можно предположить, что индукция генетических изменений манипулированием этого явления представляет собой биологически более подходящий способ интервенции в организм и воздействия на него, чем применение антисмысловых последовательностей или химических ингибиторов, которые имеют свойство неспецифически подавлять не только гены-мишени, но и другие гены.

Целью работы было изучение функциональных и фенотипических свойств генетически модифицированных ДК после трансфекции последовательностями siRNA, специфичными для p35 субъединицы IL-12 (siRNA IL-12p35).

Материалы и методы

Животные. Самки мышей C57BL/6 и BALB/c (The Jackson Laboratories, Bar Harbor, USA), 5-недельного возраста.

Выделение ДК из костного мозга. ДК были получены из костномозговых клеток-предшественников описанным ранее способом [5]. Клетки костного мозга вымывали из бедренных и большеберцовых костей мышей линии C57BL/6, отмывали и вносили для культивирования в 6-луночные платы в концентрации 4 х 106 клеток на лунку в 4 мл полной среды (RPMI-1640 дополняли 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 10 % фетальной телячьей сыворотки (FCS, «Life TechnoLogus»), с добавлением рекомбинантного GM-CSF (10 нг/мл; «PeproTech») и рекомбинантного мышиного IL-4 (10 нг/мл; «PeproTech»). Все культуры были инкубированы при 37 °С в 5% CO2. Неприлипающие клетки удаляли после 48 ч культивирования, и добавляли свежую среду. После 7 дней культивирования более 90% клеток экспрессировали характерный для ДК маркер CD11c, который определяли проточной цитометрией. ДК отмывали и помещали в 24-луночные платы в концентрации 2 х 105 клеток на лунку в 400 мкл свободной от сыворотки RPMI-1640.

Синтез siRNA и трансфекция. Последовательность siRNA была подобрана в соответствии с описанным нами ранее методом [5]. siRNA, специфическая для IL12p35 (AAC- CUGCUGAAGACCACAGAU), INFy (AACTGGCAAAAGGATGGTGAC), и смешанная контрольная (mismatched) последовательность (AACTGCCAGATGGATGGTGAC) были синтезированы и ренатури- рованы производителем («Dharmacon», USA). В концентрации 60 пкМ они добавлялись к культуре ДК. В качестве реагента трансфекции — носителя были использованы GenePorter («Gene Therapy Systems», San Diego, CA) или липиодол (ULtraFLuide, «Lab. Guerbet», France) Для проведения трансфекции

мкл 20 мкМ ренатурированной siRNA инкубировали с 3 мкл GenePorter или липиодолом в объеме 100 мкл RPMI-1640 (без сыворотки) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли к 400 мкл культуры ДК, приготовленной описанным выше способом. После 4 ч инкубации такие же объемы RPMI- 1640, только дополненные 20 % FCS, были добавлены к клеткам. Через 24 ч после трансфекции ДК были отмыты и использованы для последующих экспериментов. Активацию ДК выполняли стандартным образом: в 24-луночных платах стимуляцией LPS (10 нг/мл; «Sigma-ALdrich») и TNFa (10 нг/мл; «PeproTech») в течение 24 ч.

Проточная цитометрия. Фенотипирование ДК выполняли на проточном цитометре FACScan («Becton Dickinson») с использованием программы CeLL Quest soft ware («BD Biosciences»). Клетки окрашивали конъюгированными с ФИТЦ моноклональными антителами против поверхностных маркеров мыши, характеризующих созревание ДК: CD11c, CD40, CD80, CD86 («CedarLane Lab.»). Иммуноглобулины тех же изотипов
были использованы в качестве контроля. Результаты представлены в виде средней величины интенсивности флуоресценции (MFI), полученной для каждого варианта в трех независимых экспериментах.

Иммуноферментное определение цитокинов. Концентрацию цитокинов (IL-12p70, IL-10, IFNy, IL-4) в супернатантах клеточных культур определяли с помощью наборов реагентов («Endogen», USA) и фотометра Benchmark Microplate Reader («Bio-Rad», USA).

Смешанная культура лимфоцитов. ДК мышей C57BL/6 после трансфекции были облучены (3000 рад) и рассеяны триплетами в различных концентрациях в плоскодонные 96-луночные платы для использования в качестве клеток-стимуляторов. Т-клет- ки селезенки от мышей линии BALB/c выделяли градиентным центрифугированием на фиколл-паке («Amersham Pharmacia Biotech», Canada), очищали через колонки с нейлоновой ватой и добавляли как отвечающие клетки в концентрации 5 х 105 клеток на лунку. Смешанные лимфоциты культивировали при 37 °С в течение 72 ч в 200 мкл RPMI-1640 c добавлением 10% FCS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и за 16 ч до окончания культивирования добавляли 1 мкКи на лунку ^-тимидина («Amersham Pharmacia Biotech»). Клетки собирали на фильтры, и включение радиоактивности измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Wallac BetaPlate («Beckman», USA). Результаты представлены в виде среднего числа импульсов в минуту в триплетах ± m. В части экспериментов были добавлены анти-IL-W антитела (JES52 A5, «Pharmingen») или изотипические контрольные антитела в концентрации 5 мкг/мл.

Статистический анализ. Статистическую обработку выполняли с использованием t-критерия Стьюдента для непарных данных, полученных проточной цитометрией. Результаты по определению продукции цитокинов и данные микст-реакции лимфоцитов были обработаны с использованием однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA/Newman—Keuls). Результаты представлены в виде среднего значения ± m. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что трансфекция в ДК последовательностей 81ИМА, специфичных для р35 субъединицы ^-12, индуцирует селективное выключение гена на уровне мРНК-транс- криптов [5]. Дальнейшее изучение функционального состояния ДК после трансфекции показало, что выключение гена-^-12р35 ассоциируется с блокадой продукции биоактивного ^-12р70, увеличением продукции ^-10 и ослаблением способности к аллостимуляции в смешанной культуре лимфоцитов.

Продукцию ^-12р70 оценивали в супернатанте LPS/TNFa-активированных ДК с использованием иммуноферментного анализа. Для этого после трансфекции 81Е^А-^12р35 ДК были стимулированы LPS/TNFa (10 нг/мл LPS и 10 нг/мл TNFa) в течение 48 ч. Для подтверждения спе-

 

Рис. 1. Изменение продукции К-12 и ^-10 дендритными клетками при трансфекции siRNA IL-12p35

* — p < 0,01

цифичности выключения гена в качестве контроля была использована siRNA, специфичная для IFNy (siRNA-контроль), т. к. этот цитокин не экспрессируется в ДК из костного мозга. Кроме того, контролем служили ДК, трансфецированные только реагентом Gene Porter (ложный контроль), а также ДК, не подвергавшиеся каким-либо манипуляциям (контроль). Как показано на рис. 1а, трансфекция siRNA IL-12p35 снижает продукцию IL-12p70 на 85-90 % в сравнении с контролями. Причем очень важно отметить, что этот эффект был специфическим, т. к. не было значительных различий в продукции IL-12p70 во всех трех контролях, включая ДК, обработанные siRNA- IFNy. В супернатанте культуры активированных ДК определяли также уровень продукции IL-10 (рис. 16). Совершенно четко видно, что продукция IL-10 в ДК, обработанных siRNA-IL12p35, в значительной степени повышена по сравнению с контролями.


 Для оценки аллостимулирующей активности ДК с выключенным геном IL-12p35 была проведена микст-реакция, в которой были использованы ДК, трансфецирован- ные siRNA IL-12p35, siRNA-контроль (см. выше), Gene Porter (ложный контроль) и интактные ДК (контроль). Аллогенные (от мышей BALB/c) Т-клетки (2 х 10/на лунку) культивировали с ДК в течение 48 ч, затем уровень аллостимуляции оценивали по пролиферативной активности лимфоцитов (включению 3Н-тимидина). На рис. 2 показано, что ДК в трех контрольных вариантах имели примерно одинаковый уровень аллостимуляции, в то время как ДК с трансфекцией siRNA- IL-12p35 отличались значительным снижением этой активности. Таким образом, выключение гена IL-12p35 в ДК ассоциируется со снижением уровня пролиферации аллогенных Т-клеток, что может свидетельствовать о том, что происходит иммунная модуляция Th1 > Th2, связанная с увеличением продукции IL-10. Известно, что незрелые и толерогенные ДК продуцируют этот цитокин аутокринным образом, и выключение гена IL-10 в ДК стимулирует Thi-иммунитет и созревание ДК [9]. Недавно было показано, что IL-10 имеет отношение к генерации CD4 + CD25 + и CD8 + регуляторных субпопуляций Т-клеток [6], а также к дифференцировке Tri [7]. В связи с этим

а)

пкг/ мл

число ДК (хЮ4) б) IL-4

число ДК (х104)

Рис. 3. Влияние блокирующих анти-К-10 антител на продукцию Му и К-4 ^клетками мышей BALB/c при стимуляции в смешанной культуре разным количеством дендритных клеток, трансфецированных siRNA ^-^35+


мы попытались оценить, в какой степени иммунная модуляция с помощью siRNA ассоциируется с аутокринной продукцией IL-10 ДК. Для этого при стимуляции модифицированными siRNA ДК ал- логенных Т-клеток BALB/c в смешанную культуру добавляли блокирующие анти-IL-lO антитела. С добавлением анти-IL-lO антител наблюдалось дозозависимое подавление способности стимулировать Thl-ответ (т. е. микст-реакцию). Как показано на рис. 3, ДК с выключенным IL-12 вызывали снижение продукции Т-клетками IFNy (рис. 3а) и увеличение продукции IL-4 (рис. 36). Однако, полное подавление способности стимулировать Thl не было достигнуто анти-IL-lO антителами, что позволяет предполагать, что стимуляция секреции IFNy и ингибирование IL-4 зависят не только от IL-lO, но и от других факторов, таких, например, как супрессия IL-l2.

Известно, что IL-lO оказывает влияние на экспрессию костимуляторных молекул на мембране ДК. Ранее мы показали, что уровень экспрессии CD4O, CD8O и CD86 на ДК с выключенным геном IL-l2 не отличается от аналогичных показателей интактных клеток [5]. Поэтому представляло интерес изучить уровень экспрессии данных молекул на ДК после стимуляции в процессе микст-реакции. Можно предвидеть, что при активации Т-клетки начинают продуцировать разные мембраносвязанные молекулы (CD4OL, CDl34L) и растворимые факторы (IFNy, TRANCE), которые стимулируют ДК. Извлечение ДК с помощью магнитного сортинга активированных клеток (MACS) после микст-реакции показало значительное усиление интенсивности флуоресценции CD4O, CD8O и CD86 как на ДК с выключенным геном IL-l2p35, так и на ДК в контрольном (mixed siRNA) варианте (таблица). Добавление анти-IL-lO антител в смешанную культуру значительно увеличивает

Таблица

Изменение уровня экспрессии молекул Сй80, Сйвб, Сй40 на дендритных клетках в процессе активации в микст-реакции при добавлении анти-И-10 антител (интенсивность флуоресценции, М ± т)

 

CD80

CD86

CD40

До микст-реакции

Контроль (среда)

571,7 ± 23

1194 ± 125

29,5 ± 1,5

siRNA контроль*

572,5 ± 10

1365±157

29,7 ± 1,3

siRNA IL-12p35

559,6 ± 33

1201 ± 193

30,1 ± 0,9

После микст-реакции

siRNA контроль*

1933,2 ± 324

3031,6 ± 489

170,3 ± 26,9

siRNA IL-12p35

1905,7 ± 351

2759,9 ± 392

167,2 ± 46,9

После микст-реакции в присутствии анти-IL-lO антител

siRNA контроль*

3442 ± 247

4777±773

242,8 ± 58,9

siRNA IL-12p35

3723±453

4863±669

237,4 ± 43,5

 

экспрессию всех трех костимуляторных молекул, что согласуется с данными о высоком уровне экспрессии СБ40, СБ80 и СБ86 в 1Ъ-10-нокаути- рованных ДК в процессе стимуляции в микст- реакции по сравнению с исходными клетками [4]. При этом важно отметить, что различий по уровню экспрессии этих мембранных молекул между ДК с выключенным и не выключенным геном 1Ъ-12 не наблюдается. Следовательно, сдвиг ТЫ > ТЬ2, индуцированный выключением 1Ъ-12, не связан непосредственно с изменением экспрессии молекул СБ40, СБ80 и СБ86. Таким образом, трансфекция последовательности siRNA 1Ъ-12р35 в ДК, выделенные из костного мозга, индуцирует иммунологический сдвиг ТЬ1 > ТЬ2 и ассоциируется с усилением продукции 1Ъ-10, который может оказывать влияние на генерацию регуляторных субпопуляций лимфоцитов. Это открывает новые широкие возможности использования генетической иммунной модуляции в иммунотерапии.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

 

 

Levy D.E., Garcia-Sastre A. The virus battles: IFN induction of the antiviral state and mechanisms of viral evasion // Cytokine Growth Factor Rev. — 2001. — Vol. 12, № 2-3. — P. 143-156.

Liu G., Ng H., Akasaki Y. et al. Small interference RNA modulation of IL-10 in human monocyte-derived dendritic cells enhances the Th1 response // Eur. J. Immunol. — 2004. — Vol. 34, № 6. — P. 1680-1687.

MacLennan I., Vinuesa C. Dendritic cells, BAFF, and APRIL: innate players in adaptive antibody responses // Immunity. — 2002. — Vol. 17, № 3. — P. 235-238.

Mazzoni A., Segal D.M. Controlling the Toll road to dendritic cell polarization // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 75, № 5. — P. 721-730.

Platsoucas C.D., Fincke J.E., Pappas J. et al. Immune responses to human tumors: development of tumor vaccines // Anticancer Res. — 2003. — Vol. 23, № 3A. — P. 1969-1996.

Redecke V., Hacker H., Datta S.K. et al. Cutting edge: activation of Toll-like receptor 2 induces a Th2 immune response and promotes experimental asthma // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172, № 5. — P. 2739-2743.

Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs // Trends Biochem. Sci. —

— Vol. 30, № 2. — P. 106-114.

Tuschl T. Expanding small RNA interference // Nat. Biotechnol. — 2002. — Vol. 20, № 5. — P. 446-448.

 

 

 


The changes in regulatory function of dendritic cells after administration of short interference RNA for IL-12p35 gene

T.E. Ichim1,I.A. Popov1, E.K. Oleinik2

Departament of Surgery, University of Western Ontario, London, Ontario, Canada;

Immunology Department, Institute of Biology, Karelian Research Center, Russian Academy of Sciences,

Petrozavodsk, Russia

Dendritic cells (DC) play a key role in immune regulation since possesses the ability both to stimulate and inhibit various types of immune responses, depending on activation stimuli. We describe here the induction of RNA interference in bone marrow-derived DC by specific gene silencing with short strands of duplex RNA (small interfering RNA or siRNA) that target the cognate mRNA sequence for degradation. We demonstrate that transfection of DC with siRNA specific for the IL-12p35 gene resulted in suppression of gene expression and blockade of IL-12p70 production. Inhibition of IL-12 was associated with increased IL-10 production and with suppressed DC allostimulatory function. The Th2 polarization was observed when IL-12p35-treated DC were cultured with allogenic T cells since T cell expression of was reduced while IL-4 was increased. These data show that the switching immune response from Th1 to Th2 releases through an IL-10 dependent mechanism by administration of siRNA. The modulating of DC function possesses therapeutic potential and can be used effectively to treat a variety of immune diseases. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 1. P. 29-34.)

Key words: dendritic cells, gene silencing, RNA interference, siRNA, cytokines.

 



загрузка...