загрузка...
 
Индукция антител к IFNy и IL-4 у мышей иммунизацией пептидами, воспроизводящими иммунодоминантные В-эпитопы
Повернутись до змісту

Индукция антител к IFNy и IL-4 у мышей иммунизацией пептидами, воспроизводящими иммунодоминантные В-эпитопы

С.В. Шевелев, А.Н. Митин, С.М. Андреев, А.А. Ярилин

Институт иммунологии ФМБА РФ, г. Москва

С помощью комплекса компьютерных программ рассчитаны иммунодоминантные В-эпитопы молекул IFNy и IL-4 мыши. Синтезированы пептиды, соответствующие по аминокислотной последовательности некоторым из этих эпитопов — 99-113 из IFNy, 21-40 и 60-70 из IL-4. Конъюгатами названных пептидов с гемоцианином иммунизировали мышей. Практически у всех мышей при этом индуцировались антитела, реагирующие, по данным иммуноферментного анализа, с пептидами 99-113 из IFNy и 21-40 из IL-4; использование для иммунизации пептида 21-40 оказалось менее эффективным. При иммунизации пептидом из IFNy антитела, реагирующие с целой молекулой ци- токина, индуцированы у 10 из 12 мышей, при иммунизации пептидом из IL-4 — у половины мышей. Активность антител по отношению к целой молекуле цитокина и его фрагменту, использованному для иммунизации, коррелировала. Антитела сохранялись в циркуляции мышей на достаточно высоком уровне активности в течение месяца и долее. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 23-27.)

Ключевые слова: интерферон у, интерлейкин-4, антитела, пептиды.

 

 

 

В настоящее время широко разрабатываются методы антицитокиновой терапии, направленные на лечение заболеваний, патогенетическим фактором которых является усиление выработки тех или иных цитокинов или их дисбаланс [1, 2]. Потенциальной областью применения подходов, основанных на связывании цитокинов или ингибировании их активности, являются заболевания, в развитии которых важная роль принадлежит дисбалансу ТЫ- и ТЬ2-клеток [5], в частности, аллергических заболеваний, при которых превалирует активность ТЬ2-клеток и продуцируемых ими цитокинов [3, 6]. Одним из возможных путей поисков в данном направлении является индукция эндогенных антител к ключевым цитокинам ТЬ1- и ТЬ2-клеток.

В данной работе представлены результаты экспериментов по индукции антител к цитокинам путем иммунизации их пептидными фрагментами. Использование пептидов вместо целых молекул цитокинов продиктовано стремлением не нарушать цитокиновый баланс организма в процессе иммунизации, а также избежать побочных токсических эффектов цитокинов.

Материалы и методы

Для предсказания четвертичной структуры белков и расчета иммунодоминантных В-эпитопов использованы компьютерные программы Peptide Companion v. 1.231, A3-D Viewer for National Center for Biotechnology Information Databases Version 3.0 и Swiss-Pdb Viewer v.3.7b2. При этом учитывались следующие параметры: гидрофобность, «доступность больших сфер», гидропатичность и локализация сгибов 0-слоев, отсутствие сайтов гликозилирования, наличие в структуре остатков ароматических аминокислот [4]. Основанием для определения локализации эпитопа являлось совпадение на определенном участке полипептидной цепи всех или большинства этих свойств.

В твердофазном синтезе пептида использовали стартовый Етос-А8п(Тг1)-полимер (смола Wang от NovaBiochem, 0,44 ммоль/г) и производные аминокислот, где гидроксильные и карбоксильные группы защищались трет-бутильной группой (t- Bu), амидные функции — Trt, е-аминогруппа лизина — Boc, гуанидиновая группа аргинина — Mtr. Стандартный цикл включал промывку смолы диметилформамидом (ДМФ), удаление Fmoc-защиты (20 % пиперидин в ДМФ), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (DCC/HOBt) и конденсацию в среде ДМФ/^метилпирролидон при 4-кратном избытке карбоксильного компонента (~1,5 часа). Контроль за полнотой реакции проводили нингидриновым методом и при необходимости реакцию конденсации повторяли. Промежуточные пептиды анализировали на аминокислотном анализаторе (Biotronik L5001). Отщепление пептида от смолы проводили трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этан- дитиол, фенол), пептид осаждали сухим серным эфиром, экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизировали.

Первичную очистку пептида проводили двукратной гель-хроматографией на смоле Toyopearl HW40 (колонка: 2,5 х 78 см, элюент — 0,1 % раствор NH3, 60 мл/час; детектор LKB Uvicord SII, 254 нм). Сырую фракцию, идентифицированную по данным аминокислотного анализа, очищали градиентной ВЭЖХ (система Gilson/Data system, детектор Spectroflow 57 при 254 нм, интегратор Shimadzu C-R3A) с использованием колонки с Zorbax ODS 0,94 х 25 см («DuPont Chromatography»). Дальнейший анализ проводили с помощью аналитической ВЭЖХ (Vydec C18, 0,4 х 25 см) в тех же условиях.

Для получения конъюгата пептидного фрагмента мышиного IFNy с гемоцианином улитки (KLH, «Calbiochem», USA) 5 мг пептида (м^-4 60-70) растворяли в 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 9,0) и раствор смешивали с 800 мкл раствора 12,5 мг KLH в ФБ. Смесь перемешивали 30 мин и охлаждали до 4 °С. Добавляли 1,5 мкл охлажденого до 4 °С раствора глутарового альдегида («Serva», Germany) в 250 мкл фосфатного буфера; реакционную смесь перемешивали 1 час и оставляли на 22 часа при 4 °С. Затем добавляли охлажденный раствор 10 мг NaBH4 («Sigma», USA) в 400 мкл дистиллированной воды и оставляли на 1 час при комнатной температуре. Все содержимое переносили в диализную трубку (Servapore, 16 мм) и проводили исчерпывающий диализ против дистиллированной воды. Полученный диализат замораживали и лиофилизовали. Выход составлял 15,5 мг белого порошка, содержание пептида около 250 мкг/мг конъюгата.

Для иммунизации использованы мыши линии BALB/c и гибриды ^BA х C57Bl/6)F1 массой

22 г, полученные из питомника РАМН «Столбовая» и содержавшиеся на обычном пищевом рационе. Для индукции антител к цитокинам мыши в качестве иммуногенов использовали их пептидные фрагменты (пептид 99-113 из IFNy мыши и пептиды 21-40 и 60-70 из IL-4 мыши) или их конъюгаты с гемоцианином в дозе 30 мкг на мышь (в пересчете на пептид). Иммуногены вводили внутримышечно трехкратно с интервалом в

мес.; первое введение антигена осуществляли в полном, два следующие — в неполном адъюванте Фрейнда. Мышам контрольной группы вводили соответствующий адъювант без иммуногена в те же сроки, в которые иммунизировали животных из группы опыта.

Антитела к пептидам или целой молекуле IL-4 определяли в сыворотке крови мышей с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для постановки реакции использовали 96-луночные планшеты Titertek (Finland). На поверхности лунок общепринятым методом фиксировали антиген (IL-4, IFNy или их пептидные фрагменты); для этого добавляли 100 мкг раствора соответствующих пептидов или белка в концентрации 10 мкг/мл на 40 мМ карбонат- бикарбонатном буфере, рН 8,3. Затем в лунки добавляли 100 мкл сыворотки крови в серийных разведениях (обычно двукратных, начиная с 1:100) на фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), рН 7,4. После инкубации и отмывания в лунки вносили 100 мкг конъюгата козьих антител к IgG мыши с пероксидазой на ФСБР. Ставили цветную реакцию на пероксидазу с о-фениленди- амином. Интенсивность окрашивания оценивали на ИФА-ридере (MultiskanEX «Labsystems», Finland) при длине волны 492 нм. Как правило, оценивали 3 показателя: оптическую плотность (ОП) в ИФА при разведении сывороток 1:100, титр антител (последнее разведение, при котором ОП превышала 0,25) и долю животных, сыворотка которых содержала антитела с этим уровнем связывания лигандов.

Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel; вычисляли критерий t Стьюден- та и коэффициент корреляции.

Результаты и обсуждение

С помощью подходов, описанных в разделе «Материалы и методы», определили локализацию имму- нодоминантных В-клеточных эпитопов в молекулах IFNy и IL-4 мыши. В качестве таковых были квалифицированы в молекуле IFNy участки 76-86, 99-113 и 142-150, в молекуле IL-4 — участки 21-40, 60-70 и 90-105 (указана последовательность для процесси- рованных молекул). Были синтезированы пептидный
фрагмент 1ЕМу99-113 (последовательность остатков- КЕЕУМ- NPQVQRQAFN), а также фрагменты 1Ъ-4 21-40 (TGEGT- PCTEMDVPNVL- ТАТК) и 60-70 (КК.Н- GKTPCLKK).

В таблице представлены результаты иммунизации двумя из трех использованных пептидов. Через

10 сут. после одного цикла трехкратной иммунизации мышей-гибридов (СВА х С57Б1/6^1 конъюгатом пептида 99-113 из №N7 с гемоцианином антитела, связывающие свободный пептид 99-113, обнаружены у 11 из 12 иммунизированных мышей. При разведении сыворотки 1:100 оптическая плотность (ОП) составляла в среднем 1,92 ± 0,09 условных единиц. У двух из пяти контрольных мышей, которым вводили адъювант Фрейнда, определялась слабая связывающая способность с ОП около 0,3. Сыворотки мышей, которым вводили физиологический раствор, не связывали пептид. При оценке связывающей способности сывороток по отношению к целой молекуле мышиного №N7 установлено, что она определяется у 10 из 12 иммунизированных мышей, но ОП при этом была в 2 раза ниже, чем при оценке связывания с пептидом (0,90 ± 0,08). Способность связывать целую молекулу №N7 выявляется при разведении сывороток в 100-400 раз (средний титр 1:380). Принципиально сходные результаты были получены при иммунизации пептидом 99-113 мышей BALB/c; в этом случае образование антител, реагирующих с целой молекулой №N7, наблюдалось у всех 12 мышей.

Иммунизация пептидом 60-70 не привела к желаемым результатам: из 8 иммунизированных мышей лишь у двух определялись антипептид- ные антитела, взаимодействующие с пептидом в ИФА с уровнем ОП выше 0,25. Слабо выраженная избирательность связывания целой молекулы ]Ъ-4 наблюдалась только в одном случае.

Иммунизация пептидом 21-40 была более успешной, однако для получения эффективного ответа потребовалась смена линии мышей на BALB/c и проведение двух циклов иммунизации, разделенных интервалом в 6 мес. В таблице и на рисунке представлены результаты тестирования сывороток после второго цикла иммунизации. После первого цикла иммунизации конъюгатом пептида с гемоцианином антитела с уровнем связывания пептида, превышающим заданный порог (ОП > 0,25), обнаружены у всех иммунизированных животных. Однако уровень связывания с пептидом был невысок (ОП при разведении 1:100 сывороток составлял в среднем 0,84). Способность связывать целую молекулу ]Ъ-4 после первого цикла иммунизации обнаружена у сывороток половины иммунизированных мышей. После второго цикла иммунизации конъюгатом пептида с гемоцианином была выявлена более высокая способность сывороток взаимодействовать как с пептидом, так и с целой молекулой ]Ъ-4 в ИФА: ОП при разведении 1:100 возрастала примерно двукратно по сравнению с сыворотками, полученными после первого курса. Антитела к целой молекуле ]Ъ-4 обнаружены в сыворотке 6 из 8 мышей. Однако и титры антител, и их связывающая способность оставались более низкими, чем в случае иммунизации пептидом из ^N7 Иммунизация свободным пептидом была менее эффективна, чем иммунизация конъюгатом пептида с гемоцианином. Выявлена высокая корреляция связывающей способности антител к пептиду 21-40, индуцированных после первой и второй иммунизаций (г = 0,94, р < 0,001). Корреляция связывающей способности антител в отношении пептида и целой молекулы ]Ъ-4 значима, но не столь высока (г = 0,82, р < 0,01).

Через 6 мес. после завершения курса иммунизации сыворотку 8 из 12 мышей, иммунизированных пептидом 99-113 из №N7, повторно тестировали на присутствие антител (без введения иммуногенов в этот период). Антитела, в том числе взаимодействующие с целой молекулой №N7, продолжали выявляться, причем их активность в иммуноферментном тесте практически не изменилась. Аналогичное тестирование сывороток мышей, получивших два курса иммунизации

 

 

 


пептидом 21-40 из 1Ъ-4, осуществляли через 1 мес. после окончания второго курса. Способность связывать пептид сохранилась в сыворотке 4 из 8 мышей, для которых был исходно характерен высокий уровень ответа.

Подпись: а)Подпись: 2Подпись: 1,5Подпись: 1Подпись: 0,5Подпись: 0Подпись: 100 200 400 800 1600 3200Подпись: 2,5Подпись: 
100 200 400 800 1600
Таким образом, образование антител к эндогенным молекулам цитокинов №N7 и 1Ъ-4 (фактически — аутоантител) было индуцировано путем иммунизации пептидами, воспроизводящими их иммунодоминантные эпитопы. Данный подход оказался успешным при иммунизации первым же синтезированным фрагментом молекулы №N7 (пептид

113). Иммунизация против 1Ъ-4 оказалась эффективной лишь при введении конъюгата, содержащего пептид 21-40 (но не 60-70) мышам БАЪБ/с. Очевидно, иммуногенные свойства пептидов, иммунодоминантных в составе молекул цитокинов, могут измениться в составе конъюгата с гемоцианином. Так, пептид 60-70 в составе конъюгата лишается им- муногенности, а пептиды 99-113 из №N7 и 21-40 из 1Ъ-4 в большей или меньшей степени сохраняют ее. Образующиеся антитела, специфичные к пептиду-иммуногену, могут перекрестно реагировать с участком молекулы цитокина, соответствующим по своему составу данному пептиду. Особый интерес представляет длительность сохранения в циркуляции индуцированных антител, особенно в случае иммунизации пептидом из №N7 Возможно, их синтез поддерживается эндогенными молекулами соответствующих цитокинов, образующихся при иммунных процессах, которые могут реализоваться у мышей, содержащихся в нестерильных условиях.

Выводы

Пептиды, соответствующие по аминокислотной последовательности иммунодоминантным эпитопам молекул №N7 и 1Ъ-4, в составе конъюгатов с белком-носителем способны индуцировать у мышей образование антител, реагирующих не только с пептидом-иммуногеном, но и с целой молекулой аутологичного цитокина.

 


Holgate S.T. Cytokine and anti-cytokine therapy for the treatment of asthma and allergic disease // Cytokine. — 2004. — Vol. 28, № 4-5. — P. 152-157.

Hopp T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein antigenic determinants // Mol. Immunol. — 1983. — Vol. 20, № 4. — P. 483-489.

Romagnani S. Human Th1 and Th2 subsets: regulation of differentiation and role in protection and immunopathology // Int. Arch. Allergy Immunol. — 1992. — Vol. 98, № 4. — P. 279-285.

Simon H.U. Cytokine and anti-cytokine therapy for asthma // Curr. Allergy Asthma Rep. — 2006. — Vol. 6, № 2. — P. 117-121.

 

 

 

Induction of antibodies to IFNy and IL-4 in mice by immunization with immunodominant B-epitopes rendering peptides

5.1/. Shevelev, A.N. Mitin, S.M. Andreev, A.A. Yarilin Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, Moscow

Using a complex of computer programs, immunodominant B-epitopes of mouse IFNy and IL-4 were calculated. According to calculation, corresponding peptides were synthesized: 99-113 of IFNy,

40 and 60-70 of IL-4. These peptides conjugated with hemocyanine were used to immunize the mice. Almost in all cases there was registered production of antibodies reacting, as it was shown with immune-enzyme analysis, with 99-113 of IFNy and 21-40 of IL-4. Immunization with 21-40 peptide was less effective. After IFNy-peptide immunization antibodies reacting with the whole cytokine molecule, were found in 10 mice of 12, and after IL-4-peptide immunization only in half of mice. There was a correlation in the activity of antibodies against whole cytokine molecule and against the fragment used for immunization. Relatively high level of antibodies persisted in mice blood for a month and even longer. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 2. P. 23-27.)

Key words: interferon y interleukin 4, antibodies, peptides.




загрузка...