1 ГОУ ВПО «Российский Университет дружбы народов»,
Институт биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова,
Центральная клиническая больница РАН, Москва
Белки ЕвРК, с-егЬВ-2, БТАТ1 могут участвовать в процессах онкогенеза уротелия. Цель: изучить влияние ЕСРК, с-егЬВ-2 и БТАТ1 на пролиферацию клеток при раке мочевого пузыря. Фиксированные в формалине тканевые фрагменты опухолей мочевого пузыря 42 пациентов исследовали иммуногистохимически с антителами к ЕСРК, с-егЬВ-2, Ю-67, БТАТ1. Средний индекс пролиферации (ИП) Ю-67 в РМП, не содержащем ЕСРР, составил 6 %, при наличии ЕСРК — 15 % (р = 0,001). Экспрессия с-егЬВ-2 сопровождалась увеличением ИП Ю-67 с 3 до 13 % (р = 0,008). При положительной реакции на БТАТ1 пролиферация возрастала с 7,4 до 17 % (р = 0,024). Таким образом, рецепторы эпидермального фактора роста играют ключевую роль в пролиферации не только мышечно-инвазивного РМП, но и Та-Т1 уротелиальных опухолей мочевого пузыря. Белки ЭТАТ влияют на рост и пролиферацию уротелиальных опухолей. В карциномах низкой степени злокачественности (ТЮ1-2) наблюдается прямая зависимость между пролиферацией опухолевых клеток и коэкспрессией ЭТАТ1, с-егЬВ-2. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 4. С. 37-40.)
Рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) относятся к системе трансмембранных циклинзависимых тирозинкиназ, которые при связывании с лигандами усиливают рост, пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток. В дополнение к важной физиологической роли, рецепторы имеют ключевое значение в опухолевой трансформации и прогрессии. Гиперэкспрессия EGFR связана с прогрессией поверхностного рака мочевого пузыря (РМП) и безрецидивной выживаемостью больных [8]. В свою очередь, совместная гиперэкспрессия EGFR и онкопротеина c-erbB-2 характеризует агрессивный фенотип уротели- альных новообразований и связана с высокой летальностью [4].
Известно, что коэкспрессия рецепторов EGFR и c-erbB-3 обладает чрезвычайной онкогенной активностью, главным образом, за счет вовлечения Р13К/РКВ — сигнального пути [6]. Аналогичного влияния содружественной экспрессии EGFR и с-егЬВ-2 можно было бы ожидать и в отношении пролиферативной активности. Однако доступные кинетические модели рассматривают пролиферативную активность только как функцию экспрессии с-егЬВ-2 [3].
Белки БТАТ играют существенную роль во внутриклеточных процессах передачи сигнала рецепторов эпидермального фактора роста и интерферонов. Имеются данные о вовлечении БТАТ-протеинов, наряду сМАРК и Akt/mTOR, в EGFR-опосредованные механизмы опухолевого роста [5, 9]. Тем не менее, отдельные исследования свидетельствуют об отсутствии воздействия БТАТ1 на пролиферативную активность клеток [2]. Целью настоящего исследования было изучение роли рецепторов эпидермального фактора роста и белка БТАТ1 в процессах пролиферации уротели- альных опухолей мочевого пузыря.
В исследование включено 42 пациента (средний возраст — 68 лет; 16 женщин, 26 мужчин). Патоморфологические заключения сформулированы согласно классификации уротелиальных опухолей ВОЗ 2004 г. [1]. Обнаружение тканевых антигенов осуществляли с помощью поликлональных антител к EGFR и моноклональных антител к c-erbB-2 (Dako), Ki-67 и STAT1 (Diagnostic Biosystems). Визуализацию иммунных комплексов осуществляли иммунопероксидазным методом с помощью системы детекции LSAB + (Dako).
Оценка интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и c-erbB-2 выполнена согласно порядковой шкале: 0 — мембранного окрашивания нет; 1 + — слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более, чем в 10 % клеток; 2 + — окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру выявляется более, чем в 10 %о клеток; 3 + — интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более, чем в 10 °% клеток. При статистических расчетах отрицательной считали реакцию при отсутствии мембранного окрашивания и положительной при окрашивании мембран слабой, средней и высокой интенсивности. Реакцию на белок STAT1 оценивали с помощью подсчета количества клеток с окрашенной цитоплазмой при учете 800 клеток. Критерием положительной реакции на STAT1 было окрашивание цитоплазмы более 40 °% клеток. В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации Ki-67, который определяется долей окрашенных ядер при учете 500 клеток, выраженной в процентах.
Статистическая обработка результатов выполнена с помощью программного пакета SPSS 16.0. Оценка различий экспрессии Ki-67 и STAT1 в группах отрицательной и положительной реакции на EGFR и c-erbB-2 осуществлена с использованием критерия Манна — Уитни и двустороннего критерия Фишера.
маркеров оценивали также в нормальном уротелии мочеточников, полученных от 5 пациентов в ходе нефроуретерэктомии в связи с почечно-клеточной карциномой.
При изучении контрольной группы реакции с EGFR, с-егЪВ-2, БТАТ1 оценены отрицательными во всех 5 случаях. Средний индекс пролиферации Кь67 составил 0,4 %. В группе новообразований положительная реакция с EGFR и с-егЪВ-2 отмечалась соответственно у 31 и 57 % больных. Индекс пролиферации Кь67 варьировал от 1 % в ОНЗП до 27 % в ТЮЗ карциноме. Экспрессия БТАТ1 встретилась у 19/42 (45,2 %) больных (табл. 1).
Сравнение индекса пролиферации К1-67 и рецепторного статуса уротелиальных новообразований показало влияние экспрессии EGFR и с-егЪВ-2 на пролиферативную активность (табл. 2). В связи с тем, что границы 95 % доверительных интервалов не пересекаются, можно сделать заключение о значимом отличии (р < 0,05) пролиферации в группах, экспрессирующих EGFR и с-егЪВ-2 с различной интенсивностью.
Средний индекс пролиферации в группе опухолей, не содержащих ЕGFR, составил 6,01 %, тогда как в присутствии EGFR — 14,7 % (р = 0,001). Подобным образом при экспрессии с-егЪВ-2 пролиферация возрастала с 3,22 до 13,45 % (р = 0,008,
инвертированная папиллома) и 30 инвазивных уротелиаль- ных карцином. У 18 пациентов обнаружен инвазивный рак низкой степени злокачественности ТЮ1-2, у 9 — высокой степени ТЮЗ. Еще 3 наблюдения составили мышечно-инвазивные карциномы низкой (Т2G1-2, 1) и высокой степени злокачественности (T2G3, 2). Экспрессию
рис. 1). Содружественная экспрессия обоих рецепторов приводила к двукратному повышению показателя пролиферативной активности — с 8,1 до 16,9 % (р = 0,02).
Экспрессия БТАТ1 сопровождалась значимым увеличением пролиферативной активности с 2,9 % в группе с низким содержанием БТАТ1 до 25 % при окрашивании более 60 % клеток (р < 0,05, табл. 2). Индекс пролиферации Ю-67 в группе опухолей с отрицательной реакцией на БТАТ1 составил
%, в то же время при положительной реакции этот показатель составил 17 % (р = 0,021, рис. 3). Коэкспрессия БТАТ1 и с-егЪВ-2 была связана с увеличением пролиферации ТЮ1-2 опухолей (г, = 0,382, р = 0,024).
Известно, что содружественная экспрессия EGFR и с-егЪВ-2 сопровождается задержкой EGFR на плазматической мембране и замедлением распада рецептора [10]. Высокие концентрации ге- теродимерных комплексов EGFR/с-eгbB-2 через адаптерные протеины активируют нисходящие сигнальные пути пролиферации (МАРК) и биосинтеза белка (AKT/mTOR). Учитывая индуцирующее влияние МАР-киназы на дифференцировку клеток в условиях длительного воздействия EGFR и с-егЪВ-2 становятся понятными вторичный опухолевый рост и прогрессия Т1-карцином мочевого пузыря, содержащих EGFR и с-егЪВ-2. Представленные данные подтверждают более чем 2-кратное увеличение пролиферативной активности в случае коэкспрессии EGFR и с-егЪВ-2.
При связывании лигандов с рецепторами эпидермального фактора роста, интерфероновыми рецепторами может быть задействован JAK/STAT-путь передачи сигнала. Димеризованные белки STAT1 проникают в ядро, где индуцируют транскрипцию генов клеточного цикла, пролиферации, ангиогенеза и уклонения от иммунного ответа.
В исследованиях in vitro показана прямая связь экспрессии STAT и BCL-x [7]. Блокирование белков STAT приводит к уменьшению содержания BCL- x, остановке клеточного цикла и апоптозу. В свою очередь, применение специфического ингибитора STAT в клеточных линиях мочевого пузыря сопровождалось снижением пролиферативной активности и замедлением перехода из G0/G1- в S-фазу клеточного цикла [11]. В соответствии с этими данными, в настоящих исследованиях опухолей мочевого пузыря человека показано, что показатель их пролиферативной активности положительно коррелировал с количеством STATl-экспресси- рующих клеток. При этом в карциномах низкой степени злокачественности (T1G1-2) наблюдалась прямая зависимость между коэкспрессией STAT1, c-erbB-2 и увеличением пролиферации опухолевых клеток.
Рецепторы эпидермального фактора роста играют ключевую роль в пролиферации не только мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря, но и Та-Т1 уротелиальных опухолей мочевого пузыря.
Коэкспрессия EGFR и с-егЪВ-2 и последующее двукратное повышение пролиферативной активности может лежать в основе рецидивирования и
реакция реакция
EGFR
прогрессии Та-Т1 опухолей и должна учитываться наряду с другими неблагоприятными прогностическими факторами.
В уротелиальных опухолях мочевого пузыря показатель пролиферативной активности положительно коррелирует с количеством БТАТ1- экспрессирующих клеток. В карциномах низкой степени злокачественности наблюдается прямая зависимость между пролиферацией опухолевых клеток и коэкспрессией БТАТ1, с-егЬВ-2.
Berclaz G., Altermatt H.J., Rohrbach V. et al. EGFR dependent expression of STAT3 (but not STAT1) in breast cancer // Int. J. Oncol. — 2001. — Vol. 19, № 6. — P. 1155-1160.
Eladdadi A., Isaacson D.A mathematical model for the effects of HER2 overexpression on cell proliferation in breast cancer // Bull. Mathem.Biol. — 2008. — Vol. 70, № 6. — P. 1707-1729.
Gorgoulis V.G., Barbatis C., Poulias I., Karameris A.M. Molecular and immunohis- tochemical evaluation of epidermal growth factor receptor and c-erb-B-2 gene product in transitional cell carcinomas of the urinary bladder: a study in Greek patients // Mod. Pathol. — 1995. — Vol. 8, № 7. — P. 758-764.
Jacobs M.A., Wotkowicz C., Baumgart E.D. et al. Epidermal growth factor receptor status and the response of bladder carcinoma cells to erlotinib // J. Urol. — 2007. — Vol. 178, № 4, pt. 1. — P. 1510-1514.
Kim H.H., Sierke S.L., Koland J.G. Epidermal growth factor-dependent association of phosphatidylinositol 3-kinase with the ErbB3 gene product // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, № 40. — P. 24747-24755.
Lassmann S., Schuster I., Walch A. et al. STAT3 mRNA and protein expression in colorectal cancer: effects on STAT3-inducible targets linked to cell survival and proliferation // J. Clin. Pathol. — 2007. — Vol. 60, № 2. — P. 173-179.
Lipponen P., Eskelinen M. Expression of epidermal growth factor receptor in bladder cancer as related to established prognostic factors, oncoprotein (c-erbB-2, p53) expression and long-term prognosis // Br. J. Cancer. — 1994. — Vol. 69, № 6. — P. 1120-1125.
Mo L., Zheng X., Huang H. Y. et al. Hyperactivation of Ha-ras oncogene, but not Ink4a/Arf deficiency, triggers bladder tumorigenesis // J. Clin. Invest. — 2007. — Vol. 117, № 2. — P. 314-325.
Shankaran H., Wiley H., Resat H. Modeling the effects of HER/ErbB1-3 coexpression on receptor dimerization and biological response // Biophys. J. — 2006. — Vol. 90, № 11. — P. 3993-4009.
Wu F., Chen Y., Li Y. et al. RNA-interference-mediated Cdc42 silencing down- regulates phosphorylation of STAT3 and suppresses growth in human blad- der-cancer cells // Biotechnol. Appl. Biochem. — 2008. — Vol. 49, pt. 2. — P. 121-128.
I.A. Shalavin1,I.I. Babichenko1,1.A. Kostanyan2, S.A. Osipov3, M.V. Samoylov3 1 Peoples' Friendship University, 2 M.M. Shemyakin and Y.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3 Central Clinical Hospital, Russian Academy of Sciences, Moscow
The aim of the study: to explore the effect of EGF receptors and STAT proteins on proliferation activity in bladder cancer. Formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples were stained with antibodies against EGFR, c-erbB-2, Ki-67, and STAT1. The results showed that Ki-67 labeling index (LI) made up 6 % and 15 % in the absence and presence of EGFR respectively (p = 0,001). C-erbB-2 expression was accompanied by elevated Ki-67 LI (p = 0,003). STAT1 expression and proliferative activity were associated (p = 0,024). Thus, EGF receptors play major role in proliferation of the Ta-T1 urothelial neoplasms. STAT proteins influence proliferation and tumor growth of the urothelial neoplasms. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 4. P. 37-40.)
Оценка интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и c-erbB-2 выполнена согласно порядковой шкале: 0 — мембранного окрашивания нет; 1 + — слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более