загрузка...
 
5. Кінетика ферментативних процесів
Повернутись до змісту

5. Кінетика ферментативних процесів

Кінетика ферментів – це розділ ензимології, який вивчає залежність швидкості ферментативної реакції від  хімічної природи та умов взаємодії субстрату з ферментом, а також від факторів навколишнього середовища. Ферментативна кінетика надає інформацію про всі чинники, які впливають на швидкість реакції в живих організмах.

Основи ферментативної кінетики були закладені у працях Л. Міхаеліса та М. Ментена, які знайшли закономірності впливу різних факторів на швидкість біологічного каталізу.

Взагалі швидкість ферментативної реакції (V) – дуже важлива величина, яка є мірою активності ферменту, тобто між поняттями «швидкість реакції» та «активність ферменту» можна поставити знак дорівнює (кажемо «швидкість реакції» - розуміємо «активність ферменту»).

Активність ферменту залежить від рН, температури, концентрації субстрату [S] та ферменту [E] тощо. Розглянемо деякі вказані залежності.

Залежність V реакції від [S].

Ця залежність може бути описана рівнянням Міхаеліса-Ментен, виведення якого не є предметом цього курсу лекцій.

Рівняння Міхаелиса-Ментен

 

де V – швидкість реакції;

    Vmax – максимальна швидкість реакії;

    Km – константа Міхаеліса;

    [S] – концентрація субстрату.

Графічно залежність, яку описує рівняння, має вигляд гіперболи (рис. 7).

 

 

Рисунок 7 - Залежність швидкості реакції (V) від концентрації субстрату ([S]) (крива Міхаеліса)

Форма кривої ілюструє той факт, що поступово з підвищенням концентрації субстрату відбувається насичення активних центрів ферменту молекулами субстрату. Наближення до максимальної швидкості реакції (Vmax) без подальшої зміни цієї швидкості означає, що усі активні центри молекул ферменту зайняті, і подальше підвищення швидкості неможливе – вона досягла максимально можливого значення (ефект насичення). Нижче на рис. 8 ілюстрований процес поступового насичення ферменту субстратом.

В

 

С

 

S

Enz

 

А

 

 

 

Рисунок 8 - Поступове насичення ферменту субстратом

На рис. 8 стан А – при низьких концентраціях S, коли залежність швидкості реакції від концентрації субстрату ще має прямо порційну залежність (лінійна частина графіка на рис.7). Стан В – при [S] = Km.  Стан С – при «ефекті насичення», коли швидкість реакції наближається до максимальних значень і у зв’язку з обмеженою кількістю активних центрів більше не може змінюватись.

  Використати цей графік (рис. 7) для встановлення чіткого значення максимальної швидкості реакції неможливо. Для цього використовують графік Лайнуївера-Берка в подвійних зворотних координатах (рис. 9).

З графіка на рис. 7 видно, що Km – це така концентрація субстрату ([S]), при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної швидкості (V = 1/2V max) та може служити мірою спорідненості ферменту до субстрату.

Чим менше Km, тим більша спорідненість ферменту до конкретного субстрату. В цьому випадку умови для перебігу реакції є дуже вигідними, тому що рівновага зміщена у бік утворення фермент-субстратного комплексу, і саме тому для перетворення необхідна невелика концентрація субстрату. Крім того, Vmax може бути досягнута саме при незначних концентраціях субстрату.

У разі коли Km має велике значення, спорідненість ферменту до субстрату низька і ферментативну реакцію не можна вважати високоефективною, тому що вона потребує значних концентрацій субстрату.

Vmax та Km – це дві кінетичні константи, за допомогою яких можна характеризувати ефективність будь-якої реакції, у тому числі й in vitro.

Значення Km вимірюють за допомогою графіка в подвійних зворотних координатах (графіка Лайнуївера-Берка) (рис.9).

 

 

Рисунок 9 - Графік Лайнуївера-Берка

Залежність V ферментативної реакії від рН

 Для кожного ферменту існує своє оптимальне значення рН (рНопт) – це таке рН, при якому швидкість ферментативної реакції оптимальна. При відхиленні від оптимального рН активність ферменту знижується, навіть до мінімуму при значних змінах реакції середовища.

Зміна активності ферменту при різних рН пояснюється:

1) впливом рН на ступінь іонізації функціональних груп в активному центрі ферменту. Саме це індукує конформаційні зміни в активному центрі і відповідно впливає на спорідненість ферменту до субстрату. Окремі групи амінокислотних залишків при різних значеннях рН можуть змінювати заряд і при рНопт знаходитися в максимально вигідному стані іонізації для каталітичного перетворення субстрату в продукт.

Наприклад:

 -NH2 + H+ ? -NH4+   або           -COOH ? -COO- + H+ ;

2) впливом рН на функціональні групи в молекулі субстрату і, таким чином, на просторову організацію S та спорідненість його до ферменту.

 Кожен фермент має своє рНопт. Для більшості ферментів організму людини ці значення знаходяться в межах фізіоло-гічних значень - рН 6-7 (рис. 9), але є й суттєві відхилення від них. Приклади оптимальних значень рН деяких ферментів наведені в таблиці 2.

Таблиця 3 - Оптимальні значення рН для деяких ферментів

Фермент

Оптимальне значення рН

Пепсин

1,5-2

Піруват-карбоксилаза

4,8

Каталаза

6,8-7

Фумараза

6,5

Уреаза

6,8-7,2

Кабоксипептидаза

7,5

Трипсин

6,5-7,5

Аргіназа

9,5-9,9

 

 Зміни швидкості ферментативної реакції залежно від значень рН для більшості ферментів організму людини мають загальні закономірності, які проілюстровані на графіку (рис. 10).

У ферментативному каталізі так, як і у звичайному хімічному, температура суттєво впливає на перебіг реакції. При підвищенні температури зростає швидкість руху молекул субстрату і, таким чином, імовірність каталітичного перетворення. Але для ферментативного каталізу дуже важливим є вплив температури на конформаційні зміни в молекулі білка-ферменту і, у свою чергу, на структуру активного центру ферменту.

Кожен фермент має оптимальні значення tоС, при яких швидкість реакції максимальна, - це температурний оптимум (tоСопт). На рис. 11 наведений графік залежності активності ферменту від tоС. Для більшості ферментів організму людини від лежить у межах 37-38оС. При зростанні температури  вище вказаного температурного оптимуму відбуваються структурні зміни в молекулі ферменту і в його активному центрі, які призводять до зниження активності. Більшість ферментів інактивуються при 40-50оС. Значне підвищення температури викликає навіть денатурацію молекул білка-ферменту з повною втратою каталітичної активності. Для деяких ферментів значне зниження температури може також призвести до повної інактивації.

 

tоСопт

 
Подпись: Активність ферменту

 

Рисунок 11 - Залежність активності ферменту від температури

 Ферменти бактерій, які живуть у гарячих джерелах, не інактивуються навіть при підвищенні температури до 95оС, на-приклад, Taq-полімераза, яка на цей час активно використову-ється в медико-біологічних дослідженнях при проведенні полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

 Знання про кінетичні зміни ферментів при різних температурах є корисними в різних галузях нашого життя та безпосередньо медицини. Відомо, що при захворюваннях підвищення температури тіла людини до 40оС небезпечно, тому що викликає зниження активності більшості ферментів і не дозволяє організму активно протистояти патогенним мікроорганізмам.  Штучне охолодження організму (гібернація), яке призводить до значної економії енергетичних субстратів, використовується в хірургії при проведенні деяких операцій.

Залежність V ферментативної реакції від концентрації ферменту

 В умовах надлишку субстрату в реакційному середовищі залежність швидкості реакції від концентрації ферменту має прямо пропорційний характер (рис.12). Тобто в живих клітинах чим більше молекул ферменту, тим швидше відбувається реакція. Цей принцип закладений в основу одного із шляхів регуляції ферментативних процесів, який має назву «зміна кількості ферментів у клітині». Основними механізмами цього шляху є індукція і репресія синтезу ферментів, які будуть розглянуті нижче у відповідному розділі.

Концентрація ферменту

 



загрузка...