ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА РФ, Санкт-Петербург
Изучали токсичность проспидина в отношении иммунокомпетентных клеток. Проспидин в концентрациях от 1 нг/мл до 10 мг/мл не оказывал токсического действия в первичных культурах тимоцитовмышей. В первичных культурах спленоцитов мышей и культурах ряда трансформированных клеточных линий проспидин в дозах 1 и 10 мг/мл подавлял спонтанную и индуцированную пролиферацию.
Наиболее чувствительными к действию проспидина были тимоциты. В высоких дозах проспидинподавлял, а в более низких дозах стимулировал И-2-зависимую пролиферацию клеток линииIL-2.Исследовали влияние проспидина на спонтанную и ЛПС-индуцированную продукциюIL-1а,IL-1Р иIL-8 в культурах периферической крови здоровых доноров. Таким образом, проспидин дозозависимо
подавляет пролиферацию различных типов клеток, не вызывая цитотоксического действия, и обладает иммуномодулирующим действием. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 1. С. 54-59.)
Ключевые слова: проспидин, цитокины.
Несмотря на существенные успехи, достигнутые в лечении ревматических заболеваний, фармакотерапия этих болезней продолжает оставаться одним из наиболее сложных разделов клинической медицины. Это является мощным стимулом для разработки новых лекарственных средств с противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью. Для расширения возможностей базисной терапии ревматоидного артрита (РА) в 1981 г. Е.В. Бененсоном и Б.Ф. Немцовым был предложен, апробирован и внедрен в клиническую практику противоопухолевый препарат проспидин [2].
Проспидин (дихлорид)-М",М"-у-хлор-Р-окси- пропил-М",М"-диспиротрипиперазин) является производным ди(в-хлорэтил)-амина, создан во Всесоюзном научно-исследовательском химико- фармацевтическом институте и применяется в качестве средства противоопухолевой химиотерапии, а также как иммуносупрессивный препарат. Отмечена высокая клиническая эффективность препарата при раке мочевого пузыря и яичников, ретикулезе кожи, раке и папилломатозе гортани, раке легких, ангиоретикулезе Капоши, раке желудка и молочной железы, опухолях головного мозга [9]. В настоящее время проспидин являетсяперспективным иммуносупрессивным препаратом для применения у больных с РА [3]. Есть данные об успешном применении проспидина в ревматологии при системной красной волчанке, анкилозирующем спондилоартрите, псориатическом артрите [5, 10-12]. Наличие в молекуле проспидина четвертичных атомов азота снижает способность препарата проникать через биологические мембраны. С другой стороны показано, что препарат проявляет мембранотропную активность, которая выражается в стабилизации клеточной поверхности, уменьшении ионной проницаемости плазматической мембраны и объемной концентрации клеток [14]. Всеми без исключения авторами отмечается хорошая переносимость препарата, отсутствие выраженной токсичности, значительная терапевтическая широта, превосходящая другие цитостатические средства в 2-5 раз, связанная с особенностями фармакокинетики препарата, и отсутствие угнетающего действия на систему кроветворения [5, 10-12]. Проспидин обладает иммунодепрессивным действием, которое установлено в эксперименте по задержке развития контактного аллергического дерматита и сывороточной анафилаксии, снижению титров преципитинов и уровня гаммаглобулинов, нормализации белковых фракций крови, а также подавлению активности ] ILМ-антителообразующих клетокмышей при иммунизации их эритроцитами барана [1]. Иммунодепрессивное действие проспидина на иммунные нарушения, свойственные РА, проявляется в нормализации соотношений Т-, В-лим- фоцитов, и Т-субпопуляций, снижении титров ревматоидного факора, сывороточных иммуноглобулинов и циркулирующих противосиновиальных антител, уменьшении цитопатической и иммуног- лобулинсинтезирующей активности лимфоцитов [3, 4, 6]. Наличие самостоятельного анальгетичес- кого, антиэкссудативного и жаропонижающего действия проспидина подтверждено экспериментальными работами на модели асептического воспаления [13]. Это противовоспалительное действие наступает у проспидина позже (8-10-12 сутки), но сохраняется длительное время после отмены, что отличает проспидин от нестероидных противовоспалительных препаратов и позволяет отнести этот препарат к группе базисных, способность которых сохранять лечебный эффект после отмены считается одним из основных свойств. Недавно в клинической офтальмологии была установлена способность проспидина подавлять неоангиогенез как при системном, так и при локальном применении [15].
Однако особенности иммуносупрессивного действия проспидина остаются не до конца изученными, в частности не исследовалось влияние проспидина на синтез провоспалительных цитокинов. В связи с этим целью настоящей работы стало изучение токсичности проспидина в отношении иммунокомпетентных клеток и исследование его влияния на некоторые показатели функциональной активности различных типов лейкоцитов.
Биологическую активность проспидина исследовали на первичных культурах клеток лимфоидных органов мышей линии СВА массой 18-20 г из питомника «Рапполово» РАМН либо на клетках периферической крови здоровых доноров. В работе использованы клетки крови двух доноров, имевших условное лабораторное обозначение № 628 и № 629, которое далее использовано на всех рисунках.
Для получения клеточных суспензий спленоцитов или тимоцитов кусочки органа помещали в среду Игла и измельчали в стеклянном гомогенизаторе. Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр, эритроциты лизировали 0,83%-ным раствором NH4Cl, клетки отмывали и ресуспендировали в среде Игла, содержащей 1 % эмбриональной телячьей сыворотки.
Для постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов свежую гепаринизировнную кровь в количестве 0,6 мл разводили в 5 раз средой Игла с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина и вносили по 100 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты для иммунологического исследования вместе с ми- тогеном фитогемагглютинином (ФГА, «Serva»), в концентрации 15 мкг/мл. Изолированные как описано выше лимфоциты тимуса или селезенки мышей вносили в лунки планшетов вконцентрации 1 млн и 0,2 млн, соответственно. Для индукции пролиферации тимоцитов и лимфоцитов селезенки мышей использовали конканавалин А (КонА) в двух концентрациях. В ряде опытов для стимуляции тимоцитов в сочетании с КонА использован препарат рекомбинантного интерлейкина-ip бета (IL-ip) человека (ГосНИИОЧБ) в концентрации 100 пг/мл.
Планшеты с исследуемыми образцами культивировали в течение 72 часов при 37 °С и 5 % СО2 в СО2-инкубаторе. За 16 часов до окончания инкубации вносили 3Н-тимидин в дозе 5 мкКи/мл. После завершения культивирования клетки снимали с помощью харвестера («Flow») на нитроцеллюлозные фильтры. Уровень бласттрансформации лимфоцитов в исследуемых образцах оценивали по интенсивности включения 3Н-тимидина с помощью бетасчетчика («Rackbeta») и жидкостного сцинтиллятора и выражали в импульсах в минуту (имп/мин). Бласттрансформацию в отсутствие митогена расценивали как спонтанную.
Для оценки продукции цитокинов лейкоцитами человека свежую венозную кровь с гепарином (20 МЕ/мл) тщательно перемешивали и разводили в 5 раз средой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, для чего к 0,6 мл крови добавляли 2,4 мл среды RPMI 1640. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали официнальный ЛПС-содержащий препарат «Продигиозан». Для приготовления рабочего раствора продигиозана смешивали 2,4 мл среды RPMI 1640 и 800 мкл 0,005%-ного раствора продигиозана, при этом в 100 мкл полученного раствора содержался 1,0 мкг продигиозана. В 96-луночный планшет для культивирования клеток («Costar») вносили индуктор по 100 мкл на лунку, в контрольные лунки (для оценки спонтанной продукции цитокинов) вносили по 100 мкл среды RPMI 1640, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенной крови. Культивирование проводили при 37 °С в 5 % СО2 в течение 24 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты. При необходимости супернатанты хранили при -20 °С. Уровни цитокинов в супернатантах клеточных культур определяли твердофазным иммуноферментным методом, используя тест-системы ООО «Цитокин» согласно рекомендациям производителя [8].
Клетки перевиваемых линий К-562, CHO-2 K1 и CTLL-2 получены из банка клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Уровень пролиферации клеток оценивали по включению 3Н-тимидина и выражали в имп/мин.
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. В таблицах приведены средние арифметические значения и ошибки средних.
Учитывая цитостатические свойства проспидина относительно опухолевых клеток, в настоящем исследовании в первую очередь проведена оценка его возможной токсичности в культурах нормальных лимфоцитов. Для этой цели использована первичная культура тимоцитов мыши. Тимоциты инкубировали 18 час в присутствии возрастающих концентраций проспидина, от 1 нг/мл до 10 мг/мл. После окончания инкубации в контроле живыеклетки, при оценке по исключению трипанового синего, составляли 97 %. При использовании всех указанных доз проспидина токсического действия препарата не наблюдалось, выживаемость тимоци- тов составила 96-98 %.
После этого была произведена оценка влияния проспидина на спонтанную пролиферацию клеток в первичных культурах лимфоцитов и культурах ряда трансформированных клеточных линий (табл. 1). Согласно полученным данным, проспидин подавлял пролиферацию всех использованных типов клеток в дозах 1 и 10 мг/мл. Наиболее чувствительными к действию проспидина оказались тимоциты.
На следующем этапе исследования проведена оценка влияния проспидина на индуцированную пролиферацию лимфоидных клеток, существенно возрастающую по сравнению со спонтанной пролиферацией в результате стимуляции цитокинами либо митогенными лектинами. На рис. 1 и 2 представлены результаты изучения влияния проспидина на пролиферацию культуры тимоцитов мышей, стимулированную различными дозами КонА, а также КонА в сочетании с рекомбинантным 1IL-1Р человека. Как следует из приведенных данных, проспидин вызывал дозозависимое снижение индуцированной пролиферации тимоцитов, причем подавление пролиферации наблюдалось в дозах 1 и 10 мг/мл, что совпадает с результатами, полученными при изучении его влияния на показатели спонтанной пролиферации клеток. Те же закономерности обнаружены при изучении влияния проспидина на индуцированную пролиферацию лимфоцитов селезенки мышей независимо от вида индукторов пролиферации, в качестве которых использовались КонА в разных дозах и ЛПС В. ртойідіовпт (продигиозан) в концентрации 10 мкг/мл (рис. 3).
С другой стороны, при анализе влияния про- спидина на пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека в реакции бласттрансформации, индуцированной ФГА, выяснилось, что у обоих доноров подавление пролиферации отмечено только при высоких дозах проспидина (рис. 4). По-видимому, это может быть связано с различной чувствительностью лимфоцитов к действию проспидина на разных этапах дифференци- ровки либо зависит от использованного индуктора пролиферации. Полученные ранее результаты [7, 8] свидетельствуют о том, что эффект проспидина зависит от времени его введения в культуру по отношению к митогену. Наибольшее угнетение бласттрансформации лимфоцитов наблюдалось при введении приспидина одновременно с ФГА или после ФГА, что позволило авторам предположить о преимущественном действии проспидина на стадии распознавания чужеродного антигена лимфоидными клетками.
Рис. 1. Изменения спонтанной и индуцированной конканавалиномпролиферации тимоцитов мышей в присутствии различныхконцентраций проспидина
Таблица 1Влияние проспидина на спонтанную пролиферацию клеток различного происхождения, М ± т
Примечание к табл. 1 и 2. ОП — оптическая плотность; * — р < 0,05 — по сравнению с контролем.
Рис. 2. Изменения индуцированной конканавалином и конканавалином в сочетании с 11_-1р пролиферации тимоцитов мышей в присутствии различных концентраций проспидина
Рис. 3. Изменения спонтанной и индуцированной конканавалиномили ЛПС пролиферации спленоцитов мышей в присутствииразличных концентраций проспидина
Рис. 4. Влияние проспидина на реакцию бласттрансформации лимфоцитов периферической крови доноров № 628 и № 629Пролиферацию оценивали в культурах цельной крови с 15 мкг/мл ФГА в качестве митогена
Данное предположение подтвердилось при оценке влияния проспидина на показатели спонтанной и индуцированной продукции провоспалительных цитокинов 1IL-1а, 1IL-1Р и 1IL-8 лейкоцитами периферической крови человека (рис. 5-7). В случае индуцированного синтеза обеих форм 1IL-1 наблюдалось подавление продукции проспидином в дозах 1 и 10 мг/мл, что соответствует дозам максимального подавления пролиферации клеток. Однако в максимальной дозе 10 мг/мл проспидин вызывал увеличение спонтанной продукции 1Ъ-1а и 1Ъ-1Р, а также спонтанной продукции 1Ъ-8. Более того, при дозе проспидина 1 мг/мл у одного из двух обследованных доноров отмечено возрастание и индуцированной продигиозаном продукции 1Ъ-8 (рис. 7). Этими ре-
Таблица 2Влияние проспидина на И-2-зависимую пролиферацию клеток С1 IL-2, M ± m
В табл. 2 суммированы результаты изучениявлияния проспидина наIL-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов на примере клеточной линии CTLL-2. Результаты свидетельствуют о том,что проспидин обладает способностью подавлятьIL-2-зависимую пролиферацию в тех же дозах, вкоторых ранее отмечалось ингибирующее действиена пролиферацию лимфоидных клеток при активации другими индукторами. Однако при болеенизких дозах отмечается стимулирующее влияниезультатами подтверждается иммуномодулирующая активность проспидина, для изучения которой требуются дополнительные исследования.
Рис. 5. Изменения спонтанной и индуцированной продигиозаном продукцииIL-1а клетками цельной крови доноров № 628 и № 629 в присутствии различных концентраций проспидина
Рис. 6. Изменения спонтанной (К) и индуцированной продигиозаном (Пр) продукцииIL-1р клетками цельной крови доноров № 628 и № 629 в присутствии различных концентраций проспидина
Рис. 7. Изменения спонтанной (К) и индуцированной продигиозаном (Пр) продукцииIL-8 клетками цельной крови доноров № 628 и № 629 в присутствии различных концентраций проспидина
Таким образом, проспидин дозозависимо подавляет пролиферацию различных типов клеток, не вызывая при этом цитотоксического действия, и обладает иммуномодулирующим действием. Полученные данные позволяют определить механизмы влияния проспидина на иммунную систему — вторую после кроветворной и не менее важную систему, которая играет важнейшую роль в защите от рака и которая так же, как и кроветворная, подавляется цитостатиками. В то же время полученные результаты важны с точки зрения изучения механизмов подавления проспидином иммунологической реактивности, в частности, у больных ревматоидным артритом. Полученные в работе данные о подавлении проспидином индуцированной продукции провоспалительных цитокинов раскрывают один из возможных механизмов его лечебного действия у больных ревматоидным артритом [3], т. к. блокирование синтеза эндогенных цитокинов является на сегодняшний день наиболее перспективным направлением терапии.
Адо В.А., Бородин Ю.П., Горячкина Л.А. и др. Изучение иммунодепрессивных свойств проспидна в эксперименте // Проспидин — новое противоопухолевое средство / Сб. научн. трудов ВНИХФИ, вып. II. — М., 1973. — С. 56-65.
Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф. Антиревматоидное средство проспидин. — Патент на изобретение № 1235502, 1986.
Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф., Краснова С.Л. Новое базисное средство проспидин в терапии ревматоидного артрита. К оценке клинической эффективности и механизма действия проспидина // Тер. арх. — 1986. — № 12. — С. 103-108.
Бененсон Е.В., Немцов Б.Ф., Сейсенбаев А.Ш. К оценке влияния проспидина и циклофосфана на показатели Т- и В-иммунного ответа in vitro // Фармакол. токсикол. — 1987. — № 2. — С. 54-56.
Бененсон Е.В., Миррахимова Э.М. Клиническая эффективность проспидина при системной красной волчанке // Тер. арх. — 1989. — № 5. — С. 21-26.
Бененсон Б.Ф., Немцов Б.Ф., Тимина О.В. Цитофлюориметрический анализ функциональной активности периферических В-лимфоцитов под влиянием пульс-терапии проспидином и метотрексатом при ревматоидном артрите // Междунар. конгр. по иммунореабилитации. Тез. докл. — Сочи — Дагомыс, 1994. — С. 57.
Богомолова Н.С., Сускова В.С., Муховатова Л.М. Влияние проспидина и спиробромина на бласттрансформацию лимфоцитов // Противоопухолевые препараты / Сб. научн. трудов ВНИХФИ. — М., 1984. — С. 138-141.
Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 20-35.
Евсеенко Л.С., Берсель В.А., Дисветова В.В. и др. О клиническом применении проспидина // Вопр. онкол. — 1970. — Т. 17, № 8. — С. 36-42.
Немцов Б.Ф., Тимина О.В. Сравнительная эффективность пульс-терапии проспидином и метотрексатом при ревматоидном артрите (12-месячное контролируемое исследование) // Клин. мед. — 1998. — № 8. — С. 25-28.
Симонова О.В., Немцов Б.Ф. Комбинированное лечение проспидином и метотрексатом больных псориатическим артритом // Тер. арх. — 2005. — № 7. — С. 60-64.
Сухих Е.Н., Немцов Б.Ф., Симонова О.В. Сравнительная оценка эффективности базисной терапии анкилозирующего спондилоартрита // Науч. труды V Междунар. науч.-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке». — М., 2004. — С. 269.
Тринус Ф.П., Чернов В.А., Рябуха Т.К. и др. Сравнительное изучение противовоспалительного, анальгезирующего и жаропонижающего действия противоопухолевых препаратов // Вопр. онкол. — 1980. — № 5. — С. 49-54.
Чернов В.А., Геодакян С.В. О роли плазматической мембраны в механизме противоопухолевого действия проспидина // Хим.-фарм. ж. — 1976. — № 12. — С. 7-13.
Чупров А.Д., Плотникова Ю.А., Немцов Б.Ф. и др. Подавление ангиогенеза как одно из проявлений иммунодепрессивного действия проспидина // Науч.- практ. ревматол. — 2001. — № 3.- С. 133.
State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, St.PetersburgProspidin toxicity upon immune competent cells was studied. Prospidin in the doses from 1 ng/ml to10 mg/ml had no toxicity in murine thymocyte primary cell cultures. In the doses of 1 and 10 mg/ml itsuppressed spontaneous and induced cell proliferation in thymocyte cultures and several transformedcell lines. In high doses prospidin reduced but in low doses elevated IL-2-dependent proliferation ofCTLL-2 cell line. It also changed spontaneous and LPS-induced IL-1a, IL-1 ? and IL-8 production by humanperipheral blood leukocytes ex vivo. According to obtained data prospidin decreases cell proliferation ina dose-dependent manner without cytotoxic activity and has immunomodulatory properties. (Cytokinesand Inflammation. 2007. Vol. 6, № 1. P. 54-59.)