1 ГОУ ДПО Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования МЗ РФ;
2 Челябинская государственная медицинская академия, г. Челябинск
Цель работы — определение содержания провоспалительных и антивоспалительных цитокинов на системном и топическом уровне у больных увеитом, ассоциированным с ревматическими заболеваниями (РЗ). У 46 больных острым увеитом определяли содержание TNFa, IFNy, IL-4, растворимого рецептора I к TNFa (р55) в сыворотке крови (СК) и слезной жидкости (СЖ) и TNFa в супернатанте ультивируемых моноцитов крови иммуноферментным методом в сравнении с 30 здоровыми добровольцами соответствующего пола и возраста. В СК больных увеитом в 5 раз повышены концентрации TNFa и IFNy, в 2 раза — уровень р55 и IL-4, при увеличении соотношения IFNy к IL-4 в 2,6 раза по сравнению с контролем. Анализ продукции TNFa моноцитами больных при культивировании in vitro выявил увеличение спонтанной продукции цитокина, коррелирующее с содержанием TNFa в СК и с тяжестью увеита. Исследование СЖ определило сходные изменения уровней IFNy и IL-4. Содержание TNFa в СЖ больного глаза в 10 раз превышало контрольный уровень и в 30 раз его концентрацию в СК, при отсутствии достоверного роста количества р55. Таким образом, нарушение цитокиновой регуляции иммунитета на системном и локальном уровнях является важным компонентом иммунопатогенеза увеитов при РЗ и проявляется преимущественной активацией Thl-лимфоцитов. В инициации и регулировании внутриглазного воспаления особое значение имеет локальная продукция факторов воспаления. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 1. С. 15-19.)
Увеит, или воспаление сосудистой оболочки глаза, может быть одним из висцеральных проявлений различных ревматических заболеваний (РЗ). В патогенезе развития внутриглазного воспаления большое значение придается нарушению регуляции иммунных механизмов, которая осуществляется большим числом гуморальных медиаторов. Среди них особое место занимают цитокины — низкомолекулярные белки, обеспечивающие процесс межклеточных взаимодействий [4, 5]. Характер иммунного ответа зависит от соотношения цитокинов, приводящего к преимущественной активации субпопуляций Т-лимфоцитов, главным образом CD4+, что позволяет классифицировать некоторые заболевания и патологические состояния с учетом преобладающего профиля синтеза цитокинов [7]. Принято считать, что при ревматоидном и реактивном артритах преобладает Th1-клеточный ответ, что обусловлено подъемом концентрации IL-2 и IFNy, а при диффузных болезнях соединительной ткани — №2-клеточный ответ, протекающий с увеличением уровня IL-4 и IL-12 [5].
Кроме того, среди цитокинов принято выделять провоспалительные цитокины, участвующие в инициации иммунного воспаления, — IL-1, TNFa, IFNy, IL-6, IL-8 и противовоспалительные цитокины, к которым относятся IL-4, IL-10, TGF? [4]. Физиологическую роль в регулировании функции многих цитокинов играют растворимые рецепторы, в частности к TNFa. Существует два типа рецепторов TNF — р55 и р75, которые являются частью большой семьи структурных, связанных с клеточной поверхностью рецепторов [11]. Рецептор р75 предположительно выполняет главную роль в стимуляции пролиферации Т-клеток и в супрессии воспаления, вызванного TNFa, рецептор р55 участвует в защите организма хозяина — в инициации противовоспалительного ответа. Оба типа рецепторов присутствуют в сыворотке и других жидкостях организма, обеспечивая модуляцию провоспалительных действий TNFa.
В последние несколько лет активно изучается роль цитокинов в патогенезе увеитов. По мнению ряда российских и зарубежных исследователей, в развитии глазного воспаления ведущая роль придается TNFa. Повышение концентрации этого цитокина в сыворотке крови (СК), слезной (СЖ) и внутриглазных жидкостях выявлено при увеитах различной этиологии [2, 10]. Получены экспериментальные данные об определяющей роли TNFa в развитии ACAID-феномена, обеспечивающего иммунную привилегию глаза [8].
Данные о концентрации других цитокинов при разных глазных заболеваниях противоречивы и часто не взаимосвязаны с этиологией воспаления [3, 9].
В связи с представленными данными целью нашего исследования было определение содержания некоторых провоспалительных и антивоспалительных цитокинов на системном и топическом уровне у больных увеитом, ассоциированным с РЗ.
Иммунологические исследования выполнены у 46 больных увеитом, ассоциированным с системными РЗ, в острую стадию заболевания глаза. Среди больных было 29 (63 %) мужчин и 17 (37 %) женщин, средний возраст — 36,86 ± 9,24 лет. С учетом локализации внутриглазного воспаления обследовано 26 пациентов с передним увеитом, 13 — с панувеитом и 7 — с изолированным задним увеитом. При этом увеит легкой степени отмечался у 5, средней степени тяжести — у 14, тяжелой степени — у 27 пациентов, преимущественно с задним и генерализованным увеитом. Спектр РЗ был представлен различными видами спондилоартритов, ревматоидным артритом, ювенильным ревматоидным артритом и реактивными артритами, при этом общее заболевание находилось в стадии ремиссии или слабой активности, тяжесть течения увеита не зависела от клинической формы РЗ.
Иммунологические исследования включали определение содержания Т ILа и растворимого рецептора р55 к нему, цитокинов, избирательно продуцируемых ТИ1 (ИМу) и ТИ2 (И_-4) лимфоцитами, в СК и СЖ, а также содержание ТМРа в супернатанте культивируемых моноцитов крови. В качестве контроля использовалась периферическая венозная кровь, СК 30 здоровых доноров и слеза 15 добровольцев соответствующего пола и возраста.
Для определения продукции TNFa моноцитами выделяли мононуклеары из венозной крови, стабилизированной гепарином, путем центрифугирования на градиенте плотности фиколла-ве- рографина (1,077 г/мл). Культивация клеток производилась в среде RPMI 1640 (Sigma, США). В качестве стимулятора продукции использовали липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi.
Содержание IL-4, IFNy в СК и СЖ, а также TNFa в этих биологических средах и супернатанте культивируемых моноцитов периферической крови определяли твердофазным иммуно- ферментным методом с использованием тест-систем фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Чувствительность тест-систем для TNFa составляла 2 пг/мл (0-25 пг/мл), для IFNy — 5 пг/мл (0-2000 пг/мл), для IL-4 — 2 пг/мл (0-400 пг/мл).
Содержание растворимого рецептора I к TNFa (р55) (sTNFRI) в СК и СЖ определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы Biosource (Belgium) с чувствительностью 0,25 нг/мл (0-50 нг/мл).
Расчет результатов анализа производили инструментально на анализаторе Multiscan plus (Финляндия) при длине волны 492 нм.
Статистическая обработка результатов выполнена с помощью компьютерной программы SPSS 12.0. Рассчитывали среднее значение (М), доверительный интервал I95, в рамках которого находится 95 % значений. Межгрупповое сравнение изучаемых показателей проводилось по непараметрическим критериям Манна — Уитни и Крускалла — Уоллиса; корреляционная зависимость между иммунными показателями и клиническими признаками рассчитана с помощью корреляционного анализа Спирмена; достоверность различий определялась при p<0,05.
Многократное увеличение концентрации TNFa в СК и в супернатанте моноцитов может свидетельствовать о его ключевой роли в развитии иммуноопосредованной компоненты воспаления у больных увеитом при РЗ. Исходя из того, что некоторые авторы рассматривают рост растворимого рецептора р55 в качестве антивоспалительного механизма, можно предполагать, что подъем уровня этого растворимого рецептора не обеспечивает эффективного связывания и элиминации TNFa. Нельзя исключить также данные о вероятности продления срока циркуляции комплекса цито- кин-рецептор, что может оказывать провоспалительный эффект и быть одним из механизмов аутоиммунного воспаления [1, 11].
Далее были определено содержание в сыворотке крови больных увеитом №N7 и IL-4, продуцируемых №1- и №2-лимфоцитами, результаты представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 2, у больных увеитом уровень IL-4 в СК повышен по сравнению с условно здоровыми людьми в 1,6 раза, а количество №N7 даже в 5 раз, при этом соотношение №N7 к IL-4 увеличено в 2,6 раза по сравнению с донорским контролем. Подъем количества №N7 в циркуляции может быть связан с активацией основных продуцентов данного цитокина — №1-клеток. Менее выраженное увеличение концентрации IL-4 в СК у больных увеитами, вероятно, отражает несколько меньшую степень активации №2-лимфоцитов, что позволяет
Как видно из табл. 1, у больных увеитом в 5 раз повышена концентрация провоспалительного цитокина TNFa в СК и вдвое — уровень растворимого рецептора р55 к TNFa.
Анализ продукции TNFa моноцитами в условиях культивирования in vitro с определением спонтанной и индуцированной ЛПС секреции выявил, что у больных спонтанная продукция повышена в 4,5 раза в сравнении с лицами контрольной группы. Под влиянием ЛПС отмечалось незначительное увеличение секреции цитокина (в 3 раза), в то время как в контрольной группе уровень секреции увеличился в 21 раз. Данные об отсутствии значительного роста индуцированной продукции TNFa моноцитами крови позволяют предполагать почти максимальную активацию этих клеток уже в организме больного, что может отражать «истощение резерва продукции цитокина TNFa».
Таблица 1 Системное содержание Т ILа и его растворимого рецептора р55 у больных увеитами при ревматических заболеваниях
Примечание к табл. 1-3. I — доверительный интервал в рамках которого находится 95 % значений; М — среднее значение.
Таблица 2 Содержание IFN? и IL-4 в сыворотке крови у больных увеитами при ревматических заболеваниях
С целью выявления взаимосвязи между содержанием цитокинов на системном и топическом уровне у больных увеитом при РЗ выполнен корреляционныи анализ, который позволил установить тесную связь между уровнем IL-4 в обеих биологических жидкостях (г = 0,319, p = 0,0001), между уровнями TNFa (г = 0,285, p = 0,0001), а также sTNFRI (г = 0,301, p = 0,0001). Не выявлено взаимосвязи между уровнями IFNy в СК и в слезе, что позволяет согласиться с мнением A.M. el-Asrar [6] o локальной продукции IFNy в области МАЛТ глаза. Уровень TNFa в супернатанте моноцитов коррелировал с его содержанием в СК (г = 0,459, p = 0,0001) и с тяжестью клинических проявлений заболевания (г = 0,534, p = 0,0001), что отражает участие моноцитов в изменении цитокиновой регуляции при увеитах. Непосредственное влияние иммунологических механизмов на течение и силу воспалительного процесса в глазу у больных увеитом доказывается наличием корреляционных связей между тяжестью течения увеита и уровнем TNFa в СК (г = 0,311; p = 0,0001) и в слезе (г = 0,205; p = 0,002), а также sTNFRI (г = 0,320; p = 0,0001) и IFNy (г = -0,205; p = 0,003) в СЖ.
Полученные нами результаты в отношении IFNy и IL-4 согласуются с данными проведенных ранее экспериментальных и клинических исследований, которые позволили предположить, что у больных увеитами иммунный ответ развивается по TM-типу, на что указывает повышение уровней IFNy и IL-2 во влаге передней камере и в СК при низкой концентрация IL-4 в обеих биологических жидкостях [3, 9]. Наиболее разноречивые данные получены в отношении концентрации IFNy у больных увеитами. Так, M.S. Lacomda et al. [9] выявили повышение данного цитокина в СК и внутриглазной влаге при значительном превышении IFNy в СК, в сравнении с внутриглазной жидкостью, а О.С. Слепова и др. [3] определили его дефицит в этих средах у большинства больных с хроническими, рецидивирующими увеитами различной этиологии. Однако в нашем исследовании содержание IFNy в СК и слезе больных острым и обострением хронического увеита приблизительно равны, при этом тяжесть течения заболевания глаза коррелировала именно с содержанием этого цитокина в слезе. Участие IFNy в развитии иммунного воспаления сосудистой оболочки глаза может быть обусловлено выявленной аберрантной экспрессией молекул HLA-II класса на клетках увеальной ткани глаза, что в норме характерно только для антигенпрезентирующих клеток [8]. Увеит при ревматическиз заболеваниях предполагатьIL-1-поляризацию иммунного ответа у больных увеиами ревматической природы.
Для выявления роли топической продукции цитокинов мукозоассоциированной лимфоидной тканью (МАЛТ) глаза мы изучили содержание цитокинов в СЖ у 32 больных увеитом. Результаты представлены в табл. 3.
Анализ табл. 3 свидетельствует, что общие тенденции в изменении уровня цитокинов, продуцируемыхIL- иIL2-лимфоцитами, у больных увеитом в СЖ аналогичны тем, что были установлены для показателей крови: превалирующим в слезе был IFN?, соотношение IFN?/IL-4 в среднем составило 3,6. Это позволяет сделать вывод о сходных типах поляризации иммунного ответа, зависимого от Т- хелперов, на системном уровне и уровне лимфоидной ткани глаза.
Из табл. 3 следует также, что при увеите в СЖ значительно (в 10 раз) повышается содержание ТМЕа по сравнению с контрольной группой. При этом содержание рецептора к ТМЕа увеличивается всего в 1,2 раза. Кроме того, концентрация IFN?в слезе при активном увеите в 30 раз превышала его концентрацию в СК, что, возможно, свидетельствует о местной продукции этого цитокина при активном увеите, даже на фоне слабо выраженного системного заболевания или его ремиссии.
В слезе парного здорового глаза также выявлены значительные изменения уровней изучаемых цитокинов: ТМЕа был повышен в 6 раз по сравнению с контролем,ILв 4 раза, при нормальных значенияхIL-4. Это может отражать содружественное изменение иммунологической реактивности на уровне лимфоидной ткани парного органа. В то же время, у больных увеитом соотношение ТМЕа в СК к его содержанию в слезе воспаленного глаза составило — 31,3; а к содержанию ТМЕа в слезе здорового глаза 16,5, что было сопоставимо с соотношением концентраций этого цитокина на системном и топическом уровне у здоровых доноров (16,9).
Таблица 3 Содержание цитокинов в слезной жидкости у больных увеитом при ревматических заболеваниях
Примечание. * — p < 0,02 относительно контроля; ** — p < 0,02 относительно здорового глаза.
Таким образом, нарушение цитокиновой регуляции на системном и локальном уровнях является важным компонентом иммунопатогенеза увеитов при РЗ. Изменение баланса в системе иммунитета проявляется типичной для аутоиммунных заболеваний активацией №1-лимфоцитов. Уровень TNFa в супернатанте моноцитов коррелирует с изменением их содержания в сыворотке крови и с тяжестью клинических проявлений заболевания, что отражает участие моноцитов в изменении цитокиновой регуляции при увеитах. Содержание цитокинов в СЖ коррелирует с их уровнем в СК, но отличается тридцатикратным увеличением концентрации TNFa в сравнении с содержанием в крови, что подтверждает локальную продукциию факторов воспаления при увеите.
Симбирцев А.С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлейкина- 2 в регуляции иммунитета // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 3-8.
Слепова О.С., Герасименко В.А., Макаров П.В. и др. Сравнительное исследование роли цитокинов при разных формах глазных заболеваний. Сообщение 1. Фактор некроза опухоли альфа // Вестн. Офтальмол. — 1998. — Т. 114, № 3. — С. 28-32.
Слепова О.С., Быковская Г.Н., Катаргина Л.А. и др. Нарушение продукции и баланса цитокинов при воспалительных заболеваниях глаз // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 2. — С. 59-61.
Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы её функционирования в норме и при патологии // Иммунология. — 1997. — № 5. — С. 7-13.
Cope A.P. Regulation of autoimmunity by proinflammatory cytokines // Curr. Opin. Immunol. — 1998. — Vol. 10, № 6. — P. 669-676.
el-Asrar A.M., Maimone D., Morse P.H. et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce expression of major histocompatibility complex antigenon rat retinal astrocytes // Br. J. Ophthalmol. — 1991. — Vol. 75, № 8. — P. 473-475.
Feldmann M., Brennan F.M., Maini R. Cytokines in autoimmune disorders // Int. Rev. Immunol. — 1998. — Vol. 17, № 1-4. — P. 217-228.
Ferguson T.A., Herndon J.M., Dube P. The immune response and the eye: a role for TNFa in anterior chamber-assoriated immune deviation // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. — 1994. — Vol. 35, N 5. — P. 2643-2651.
Lacomba M.S., Martin C.M., Chamond R.R. et al. Aqueous and serum interferon gamma, interleukin (IL) 2, IL-4, and IL-10 in patients with uveitis // Arch. Ophthalmol. — 2000. — Vol. 118, № 6. — P. 768-782.
Lacomba M.S., Martin C.M., Galera G. et al. Aqueous humor and serum tumor necrosis factor-alfa in clinical uveitis // Ophthalmic Res. — 2001. — Vol. 33, № 5. — P. 251-255.
Peschon J.J., Torrance D.S., Stocking K.L. et al. TNF receptor-deficient mice reveal divergent roles for p55 and p75 in several models of inflammation // J. Immunol. — 1998. — Vol. 160, № 2. — P. 943-952.
1 Ural State Medical Academy for Additional Education,
2 Chelyabinsk State Medical Academy, Chelyabinsk
Purpose: To determine the systemic and topical levels of some proinflammatory and antiinflammatorycytokines in patients with uveitis associated with rheumatic diseases (RD). Methods: We investigatedcontents of TNFa, IFNy, IL-4, soluble receptor I to TNFa (p55) in serum and tears and production of TNFaby monocytes of peripheral blood in 46 patients with acute uveitis and 30 healthy donors. Results: levelsof TNFa, IFNy in serum were 5 times greater than in control but concentrations of IL-4 and p55 were only2 times higher in patients in comparison with healthy donors. Ratio of IFNy to IL-4 in serum and tears was2,6 times higher in patients with uveitis. We revealed increased spontaneous production of TNFa by bloodmonocytes that correlated with TNFa serum level and severity of uveitis. Contents of TNFa in tears fromuveitis eye was increased 10 times in comparison with control and 30 times in comparison with its levelin serum, but concentration of p55 was unchanged. Conclusion: Disturbance of the cytokine regulationof the immune homeostasis is a typical sign of uveitis associated with RD that is characterised by Th1deviation of immune response. The main role in intraocular inflammation belongs to local production ofproinflammatory cytokines. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 1. P. 15-19 .)Key words: uveitis, cytokine, tumor necrosis factor alpha, interferon gamma, interleukin-4.