1 Орловская областная клиническая больница, 2 Орловский государственный университет, г. Орел
Результаты проведенного исследования показали, что у больных с острым ишемическим инсультом на фоне иммунодефицита наблюдается реактивация латентной герпетической инфекции (появление в крови больных ДНК вируса простого герпеса), которая определяется на 1-е сутки заболевания у 27,7 % больных, на 3-и сутки — у 31,2 %, а к 10-м и 28-м суткам снижается до 14,1 % и 5,9 % соответственно. Применение Церебролизина® («EBEWE Pharma», Австрия) у больных с инсультиндуцированной герпетической инфекцией приводит к ускоренному восстановлению нарушенных неврологических функций, нормализации показателей иммунной системы и санации периферической крови уже к 10-м суткам заболевания. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 1. С. 47-53.)
При остром нарушении мозгового заболевания (ОНМК) причинами смерти являются внутричерепные и соматические осложнения, сопровождающиеся гибелью 70-83 % больных [4]. В структуре соматических осложнений одно из ведущих мест занимает инфекционная патология: пневмонии, трахеобронхиты, инфекции мочевыводящих путей, гнойные поражения конъюнктивы и роговицы, а также другие заболевания, существенно повышающие степень тяжести первичного и повторного инсультов [3]. Развитию инфекционных осложнений способствуют нарушение метаболизма, поражение центральной регуляции функции органов и систем, а также нарушения в системном и региональном иммунном ответе [3]. В связи с тем, что ОНМК сопровождается развитием стресса, снижением функциональной активности Т-лимфоцитов и подавлением механизмов противоинфекционной защиты, резко усиливается восприимчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям [1].
Это позволило предположить и подтвердить в эксперименте возможность участия активированной бактериальной и, особенно, ДНК-содержащей вирусной инфекции в развитии воспалительных заболеваний не только в ткани легких, мочевыделительных путей и глаз, но и в центральной нервной системе при снижении иммунологической реактивности организма [1]. В экспериментальных условиях нами впервые показано, что у животных, предварительно зараженных вирусом простого герпеса (ВПГ), при моделировании ОНМК в 10 % случаев возникает реактивация латентной герпетической инфекции в форме герпетического энцефалита [2, 13]. При этом пусковое значение в механизме реактивации возбудителя приобретает переохлаждение, нарушение питания и другие стрессовые ситуации, а также нарушения регионарного (церебрального) иммунитета в условиях системной иммунопатологии и снижения антивирусной иммунорезистентности [9, 11].
Степень иммунных нарушений, во многом определяющая характер и исход ОНМК, может быть частично откорректирована при назначении ряда базисных препаратов для лечения инсульта. Однако, более выраженный эффект может быть достигнут в результате использования различных цитокинов, нейротрофинов и ростовых факторов (NGF), а также индукторов их синтеза, характеризующихся иммунотропным действием [8]. К числу их относится пептидергический ноотроп с нейроиммунотрофическим и у-интерферониндуцирующим действием Церебролизин® (Ц) («EBEWE Pharma»,Австрия) [8]. Церебролизин (Ц) обладает нейроим- мунокорригирующей и противовирусной активностью при вирусных нейроинфекциях, а также при инфекционных осложнениях ОНМК [12].
Целью данного исследования являлось изучение возможности реактивации латентной герпетической инфекции у пациентов с острым ишемическим инсультом и ее коррекции Ц.
В исследовании принимали участие три исследовательских центра Российской Федерации, оно продолжалось два года и выполнялось в два этапа.
На первом этапе изучали возможность реактивации латентной герпетической инфекции у больных при остром ишемичес- ком инсульте (ОИИ). В исследовании принимали участие 353 пациента (возраст 55-85 лет) с первым в жизни ишемическим инсультом в системе внутренней сонной артерии, которые поступили в стационар в первые сутки от момента развития заболевания и которые, по данным анамнеза, перенесли Herpes labialis. Группой сравнения для больных с острым ишемическим инсультом служили 353 здоровых человека без ОИИ (возраст 55-85 лет), которые также перенесли Herpes labialis. Критериями исключения как для первого, так и для второго этапа исследований явились полный регресс неврологической симптоматики в течение б ч от начала заболевания, геморрагический инсульт или инсульт в вертебробазилярной системе, плохая контролируемость артериального давления, превышающего 200/100 мм рт. ст., расстройства сознания до состояния сопора или комы, острый инфаркт миокарда, сердечная и почечнопеченочная недостаточность, априорно выраженная деменция, наличие эпилептического синдрома в анамнезе, а также участие больного в других исследованиях. У пациентов с ОИИ выполняли анализ периферической крови на выявление ДНК ВПГ типов 1 и 2 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) при поступлении, на 3-и, 10-е и 28-е сутки заболевания. Данное исследование выполняли и в контрольной группе здоровых людей.
На втором этапе изучали неврологические, вирусологические и иммунологические аспекты больных с инсультиндуцирован- ной герпетической инфекцией, а также фармакокоррекцию данного осложнения с помощью Ц. В исследование включены 98 больных (возраст 55-85 лет) с первым в жизни ишемическим инсультом в системе внутренней сонной артерии, которые поступили в стационар в первые сутки от момента развития заболевания и у которых при поступлении в периферической крови обнаружена ДНК ВПГ типов 1 и 2; из них 49 получали Ц (основная группа) и 49 составили контрольную группу. Каждый пациент получал полную информацию о препарате, его свойствах, цели и принципах исследования. Перед началом исследования каждый больной или его родственник давал письменное согласие на участие в нем. Ц в дозе 10 мл назначали в течение первых суток от начала заболевания в течение 10 дней. Препарат разводили в 100 мл физиологического раствора и вводили внутривенно капельно в течение 30 мин на фоне применения ацикловира и максимально унифицированной базисной терапии, включавшей применение ацетилсалициловой кислоты, пентоксифиллина, а при необходимости — гепарина в низких дозах. Блокаторы кальциевых каналов и препараты с нейротрофическими и иммуномодулирующими свойствами не использовались.
Оценку степени неврологического дефицита у пациентов, включенных в исследование, проводили с помощью шкалы степени тяжести американского института неврологических расстройств и инсульта (NIH-NINDS), функциональный статус больного оценивали с помощью модифицированной шкалы Рэнкина и индекса Бартел. Оценку системной воспалительной реакции проводили с помощью шкалы синдрома системного воспалительного ответа Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS). ВПГ типов 1 и 2 в крови выявляли с помощью ПЦР и иммуноферментного анализа, индекс авидности антител определяли методом дифференциации высоко- и низкоавидных антител путем обработки комплексов антиген-антитело раствором мочевины, вызывающей денатурацию белка. Содержание Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), Т-супрессоров (CD8) и B-лимфоцитов (CD20) оценивали методом проточной цито- метрии. Иммуноглобулины IgA, IgM и IgG определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Фагоцитарное звено иммунитета оценивали с помощью прямого визуального метода. Определяли С-реактивный протеин, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и содержание лейкоцитов в крови. Данные показатели определяли при поступлении в первые сутки (визит 1), на 3-и, 10-е и 28-е сутки заболевания (визиты 2, 3 и 4). КТ/МРТ головного мозга проводили в течение первых суток от начала заболевания. На полученных томограммах определяли наличие и локализацию инфаркта мозга. Исследование ЭКГ выполняли при поступлении пациента для исключения острой сердечной патологии (инфаркт миокарда и т. д.). В статистический анализ были включены все пациенты, получавшие хотя бы одну дозу исследуемого препарата (анализ intention-to-treat).
Данные представлены в виде средних арифметических и стандартных отклонений (M ± SD). Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программ Biostat и Statistica 6.0. Достоверность различий средних значений устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента. При оценке летальности использован точный критерий Фишера.
Результаты первого этапа исследований подтверждают выдвинутую гипотезу о возможности реактивации латентной герпетической инфекции при ОИИ. Данные о динамике исследования представлены в табл. 1. Из 353 пациентов с ОИИ при поступлении в стационар (первые сутки от момента развития заболевания) в крови 98 из них (27,7 %) методом ПЦР выявлена ДНК ВПГ типов 1 и 2. На 3-е сутки ОИИ количество больных с положительной ДНК ВПГ типов 1 и 2 в крови увеличивается до 110 (31,2 %). К 10-м суткам ОИИ наблюдается тенденция к снижению количества больных с положительной ДНК ВПГ типов 1 и 2 в крови до 50 (14,1 %). На 28-е сутки число больных ОИИ с положительной ДНК ВПГ типов 1 и 2 в крови сни жается до 21 (5,9 %). В группе здоровых людей той же возрастной группы, что и больные с ОИИ, у всех обследованных (353 человека) ДНК ВПГ типов 1 и 2 в крови выявлено не было.
Таблица 1 Динамика показателей ПЦР на ВПГ в периферической крови больных ОИИ, % положительных случаев
Примечание. ** — р < 0,01 по сравнению со здоровыми.
С целью изучения динамики заболевания и разработки адекватных путей нейроиммунокоррекции (на модели Ц) у больных с инсультиндуцированной герпетической инфекцией был проведен второй этап исследований. Исследование подтвердило безопасность Ц, нежелательных явлений выявлено не было. В основной группе по сравнению с контрольной отмечалась тенденция к более высокой летальности: 3 случая (6,1 %) против 1 (2,0 %) (р > 0,5). Во всех случаях смерть имела место у больных с исходно тяжелым инсультом (балл по NIH-NINDS).
Оценку неврологического дефицита, функционального состояния больных и эффективности терапии проводили по шкале NIH-NINDS, модифицированной шкале Рэнкина и индексу Бартел. До начала терапии обе группы были сопоставимы по тяжести клинической симптоматики по шкалам NIH-NINDS (14,3 ± 4,5 в основной, 14,0 ± 5,2 в контрольной) и модифицированной шкале Рэнкина (3,9 ± 0,6 в основной, 4,0 ± 0,2 в контрольной). К 3-м суткам заболевания наблюдался регресс клинического балла у всех больных ОИИ без достоверных различий между группами как по шкале NIH-NINDS (10,3 ± 4,6 в основной группе, 10,9 ± 5,1 в контрольной), так и по модифицированной шкале Рэнкина (3,3 ± 0,2 в основной, 3,7 ± 0,3 в контрольной). К 10-м суткам ОИИ (завершение проводимой терапии Ц) в группе, получавшей Ц, наблюдалось ускоренное восстановление нарушенных неврологических функций и функционального состояния больных, согласно шкале NIH-NINDS (6,5 ± 4,0 в основной, 8,2 ± 4,1 в контрольной), модифицированной шкале Рэнкина (2,5 ± 1,1 в основной, 3,4 ± 1,2 в контрольной) и индексу Бартел (72,5 ± 19,2 в основной, 58,3 ± 20,1 в контрольной; р < 0,01). Данные различия сохранялись к 28-м суткам заболевания по шкале NIH-NINDS (3,8 ± 3,5 в основной, 6,1 ± 3,6 в контрольной), по модифицированной шкале Рэн- кина (1,4 ± 0,9 в основной, 2,6 ± 0,8 в контрольной) и индексу Бартел (83,6 ± 13,2 в основной, 65,2 ± 14,5 в контрольной) (р < 0,01).
Динамику системного воспалительного ответа у больных оценивали с помощью шкалы SIRS. В момент включения пациентов в исследование обе группы были сопоставимы по степени синдрома системного воспалительного ответа, по шкале SIRS (1,9 ± 0,7 — основная, 1,8 ± 0,5 — контрольная). К 3-м суткам заболевания в контрольной группе наблюдалось повышение клинического балла (3,5 ± 0,6), а в группе, получавшей Ц — регресс клинического балла (1,3 ± 0,4) (p < 0,01). К 10-м суткам ОИИ в основной группе наблюдалась ускоренная санация согласно шкале SIRS (1,1 ± 0,3 — основная, 2,3 ± 0,5 — контрольная; р < 0,01). Данные различия сохранялись к 28-м суткам заболевания: 0,4 ± 0,2 в основной, 1,1 ± 0,4 в контрольной (p < 0,01).
Для диагностики реактивации латентной герпетической инфекции при ОИИ и оценки эффективности терапии определяли антитела классов IgM и IgG к ВПГ типов 1 и 2 в периферической крови больных. Данные о динамике этих показателей представлены на рисунке.Все положительные сыворотки с антителами класса IgG тестировали на индекс авидности антител. Во всех случаях индекс авидности был более 50 %, следовательно, сыворотки содержали высокоавидные антитела, что указывало на давнюю инфекцию. До начала терапии у всех больных основной и контрольной групп наблюдалось наличие антител класса IgG и IgM к ВПГ. К 3-м суткам заболевания в группе, получающей Ц, наблюдалось снижение количества пациентов с антителами класса IgM к ВПГ до 76,8 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной, где число таких больных оставалось высоким (91,8 %); при этом антитела класса IgG к ВПГ наблюдались у всех больных основной и контрольной групп (100 %). К 10-м суткам ОИИ в обеих группах наблюдалось снижение количества пациентов с антителами классов IgM (30,6 % в основной группе, 79,6 % в контрольной) и IgG (18,4 % в основной, 59,2 % в контрольной) к ВПГ с достоверным отличием основной группы (p < 0,01). Данные различия сохранялись к 28-м суткам заболевания: количество пациентов с антителами класса IgM к ВПГ в основной группе составляло 0 %, в контрольной 38,8 %, с IgG-антителами — 10,2 % в основной, 40,8 % в контрольной (p < 0,01).
С целью включения пациентов в исследование и оценки эффективности терапии Ц использовали метод ПЦР для выявления ДНК ВПГ типов 1 и 2 в периферической крови. Данный метод дополняет и уточняет ИФА, являясь «золотым стандартом» в диагностике герпетической инфекции. Данные о динамике показателей ПЦР в периферической крови представлены в табл. 2.
Из приведенных данных следует, что при поступлении (первые сутки) как в основной, так и в контрольной группах ПЦР положительна у всех также на 10-е (р < 0,01) и 28-е сутки заболевания (р < 0,01).
Данные о динамике иммунологических показателей представлены на рисунке. При поступлении у больных обеих групп наблюдали нарушения во всех звеньях иммунитета. Нарушения в клеточном звене иммунитета проявлялись снижением содержания в крови СБ3-клеток по сравнению со здоровыми лицами того же возраста (до 12,1 ± 2,4 % в основной группе, до 13,1 ± 1,9 % в контрольной), СБ4-клеток (до 19,2 ± 2,7 % в основной, до 20,3 ± 2,9 % в контрольной) и повышением числа СБ8-клеток (до 12,1 ± 2,4 % в основной, до 13,1 ± 1,9 % в контрольной). В гуморальном звене иммунитета наблюдалось повышение СБ20-клеток (48,2 ± 3,7 % в основной, 47,4 ± 4,3 % в контрольной) и концентрации сывороточных иммуноглобулинов класса (831,5 ± 67,1 мг/дл в основной, 783,1 ± 45,7 мг/дл в контрольной), ]?М (277,1 ± 25,8 мг/дл в основной, 264,2 ± 38,2 мг/дл в контрольной), (1798,2 ± 98,4 мг/дл в основной, 1806,3 ± 100,2 мг/дл в контрольной). Нарушения неспецифического иммунитета проявлялись снижением количества активных фагоцитов (до 1,1 ± 0,3 х 109/л в основной, до 1,3 ± 0,2 х 109/л в контрольной), фагоцитарного числа (до 1,8 ± 0,1 у. е. в основной, до 1,9 ± 0,7 у. е. в контрольной), абсолютного фагоцитарного показателя (до 3,1 ± 1,2 х 109/л в основной, до 3,3 ± 1,1х 109/л в контрольной) и индекса завершенности фагоцитоза (до 0,7 ± 0,1 у. е. в основной, до 0,5 ± 0,2 у. е. в контрольной). К 3-м суткам заболевания в группе, получавшей Ц, происходила нормализация содержания СБ4 (19,3 ± 1,9 % против 14,2 ± 2,6 % в контрольной группе), СБ20 (40,1 ± 2,9 % в основной, 45,3 ± 3,6 % в контрольной), количества активных фагоцитов (2,5 ± 0,9 х 109/л в основной, 1,5 ± 1,1 х 109/л в контрольной) и индекса завершенности фагоцитоза (1,1 ± 0,3 у. е. в основной, 0,7 ± 0,1 у. е. в контрольной); все различия достоверны (р < 0,01).
К 10-м суткам заболевания в основной группе отмечалась нормализация содержания СБ3 (47,5 ± 3,1 % против 20,3 ± 4,2 % в контрольной), СБ8 (25,2 ± 3,5 % против 46,5 ± 4,3 %), ILА (318,4 ± 29,1 мг/дл против 430,9 ± 54,1 мг/дл), ILМ (156,2 ± 31,1 мг/дл против 238,1 ± 14,9 мг/дл), IL (1439,3 ± 86,1 мг/дл против 1686,5 ± 76,2 мг/дл), фаЦеребролизин в лечении герпетической инфекции при инсульте больных, включенных в исследование (100 %). К 3-м суткам заболевания в группе, получавшей Ц, наблюдалась достоверно ускоренная санация периферической крови (т. е. в основной группе число больных с наличием ДНК ВПГ типов 1 и 2 в периферической крови было достоверно меньшим по сравнению с контрольной группой, р < 0,05). Достоверные различия по этому признаку между основной и контрольной группами наблюдались гоцитарного числа (4,6 ± 1,1 у. е. против 2,7 ± 0,4 у. е.) и абсолютного фагоцитарного показателя (14,9 ± 1,7 х 109/л против 7,4 ± 0,7 х 109/л) с достоверными различиями (p < 0,01) по всем показателям.
Рисунок. Динамика антител к ВПГ, субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и фагоцитарной активности клеток крови у больных острым ишемическим инсультом
11 — р < 0,01 по сравнению с контрольной группой.
Таблица 2 Динамика выявления ДНК ВПГ в периферической крови больных ОИИ, % положительных случаев
Примечание. * — р < 0,05, ** — р < 0,01 по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, к 10-м суткам ОИИ в основной группе наблюдалась нормализация всех нарушенных показателей иммунной системы, различия между основной и контрольной группами сохранялись к 28-м суткам острого ишемического инсульта (p < 0,01). В контрольной группе нарушенный иммунитет восстанавливался медленно, и к 28-м суткам после ОИИ сохранялись нарушения во всех звеньях иммунитета (хотя и не такой степени выраженности, как в 1-е сутки). Так, клеточное звено характеризовалось снижением CD3 (32,1 ± 3,9 %), CD4 (27,3 ± 3,2 %) и повышением CD8 (37,4 ± 3,5 %); в гуморальном звене были повышены содержание CD20+ клеток (42,1 ± 2,7 %), концентрации IgA (416,3 ± 32,1 мг/дл), IgM (218,0 ± 13,1 мг/дл) и IgG (1609,5 ± 110,4 мг/дл); нарушения неспецифического иммунитета проявлялись снижением количества активных фагоцитов (2,3 ± 1,3 х 109/л), фагоцитарного числа (3,4 ± 1,5 у. е.), абсолютного фагоцитарного показателя (9,3 ± 1,4 х 109/л) и индекса завершенности фагоцитоза (0,9 ± 0,7 у. е.).
До начала терапии обе группы были сопоставимы по степени воспалительных изменений со стороны крови, т. е. по уровню лейкоцитоза (11,3 ± 3,5 х 109/л в основной и 12,4 ± 3,2 х 109/л в контрольной), увеличению СОЭ (17,5 ± 4,2 мм/ч в основной и 18,5 ± 3,5 мм/ч в контрольной) и появлением в периферической крови С-реактивного протеина (15,7 ± 3,4 мг/л в основной и 16,6 ± 1,9 мг/л в контрольной). К 3-м суткам заболевания в группе, получавшей Ц, наблюдалась нормализация количества лейкоцитов (основная — 8,8 ± 2,1 х 109/л, контрольная — 14,2 ± 4,1 х 109/л), СОЭ (основная — 7,6 ± 1,2 мм/ч, контрольная — 17,5 ± 3,3 мм/ч) и уровня С-реактивного протеина (в основной он не выявлялся, в контрольной составлял 14,9 ± 3,5 мг/л) с достоверными различиями (p < 0,01). Т. е. на 3-и сутки ОИИ в группе, получавшей Ц, происходила нормализация всех нарушенных показателей. Тенденция к нормализации в основной группе наблюдалась на 10-е и 28-е сутки заболевания (р < 0,01).
Электрокардиографию проводили в течение первых суток от момента развития заболевания. Во всех случаях острой коронарной патологии выявлено не было.
КТ или МРТ исследование головного мозга проводили при поступлении пациента в стационар и повторно всем больным, включенным в исследование. В контрольной группе 20 пациентов исследовали на 7-й день, 9 пациентов — на 10-й день и 10 пациентов — на 14 день от момента развития заболевания. В группе, получавшей Ц, эти исследования выполнялись у 14 пациентов на 8-й день, у
15 пациентов — на 10-й день и у 20 пациентов — на 12-й день от момента развития заболевания. При этом не было выявлено случаев геморрагической трансформации, гематомы, кровоизлияния, повторного инсульта и субарахноидального кровоизлияния.
Проведенное клиническое исследование показало, что в первые сутки ОИИ в условиях иммунодефицита возникает реактивация латентной герпетической инфекции у 27,7 % больных. К 3-м суткам ОИИ количество больных с данным осложнением увеличивается до 31,2 %, к 10-м суткам уменьшается до 14,1 %, к 28-м суткам — до 5,8 %. При ОИИ отмечается нарушение во всех звеньях иммунной системы. Со стороны клеточного иммунитета это проявляется снижением СD3+ лимфоцитов (Т-лимфоцитов) и CD4+ клеток (Т-хелперов), а также повышением CD8+ лимфоцитов (Т-супрес- соров). Гуморальный иммунитет характеризуется увеличением содержания В-лимфоцитов (СD20+) и иммуноглобулинов ILА, ILМ и ILО. Нарушение неспецифической резистентности проявляется снижением количества активных фагоцитов, фагоцитарного числа, абсолютного фагоцитарного показателя и индекса завершенности фагоцитоза. Эти сдвиги можно объяснить развитием на фоне ОНМК стрессобусловленного вторичного иммунодефицита, который способствует снижению противоинфекционного иммунитета и, как следствие, вызывает развитие инсультиндуцированной герпетической инфекции.
Для вируса герпеса общепризнанным является факт его паразитирования или пожизненного персистирования в латентном состоянии в ядрах (встраивание в геном) и соме нервных клеток сенсорных ганглиев тройничного нерва, в нейронах вегетативных ганглиев и лимфоцитах. Это сопровождается развитием клеточного энергодефицита и, возможно, активацией процессов свободнорадикального окисления [5]. При этом вирусы индуцируют синтез внутриклеточного холестерина, что сопровождается нарушением деятельности клеток и развитием атеросклероза даже без вовлечения в реакцию холестеринового метаболизма организма [14].
В нервной ткани может быть обнаружено сразу несколько типов вируса герпеса, находящихся в конкурентно-антагонистических взаимоотношениях за ресурсы клеток, блокирующих встраивание друг друга в геном нервных клеток и непрерывно циркулирующих по нейронам. При этом исчезновение герпеса одного типа сопровождается активацией в ЦНС другого [15].
Одним из доказательств важности механизмов специфической антивирусной резистентности является значительное количество пострадиационных энцефалопатий в результате аварии на Чернобыльской АЭС (настоящее клиническое
