Ранозаживляющее и местное иммуностимулирующее действие рекомбинантного IL-1 ? человека при применении у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами Е.А. Варюшина, В.В. Москаленко, А.С. Симбирцев, Т.П. Лебедева, А.Н. Бубнов
1 ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА РФ, Санкт-Петербург;2 Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования
Целью исследования было изучение лечебного эффекта И-1Р при хронических ранах различнойэтиологии у человека. Рекомбинантный человеческий И-1Р (ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) применяли в составе мазей на гидрофобной основе в концентрациях 0,05-5000 нг/мл у больных строфическими язвами и длительно незаживающими ранами нижних конечностей на фоне венознойнедостаточности или диабета I или II типов. Лечение мазью с И-1Р показало высокую клиническуюэффективность во всех группах больных. При клинических исследованиях была выбрана наиболееэффективная концентрация И-1Р в мази — 50 нг/мл. Цитологический анализ мазков-отпечатков изран при применении И-1Р показал увеличение числа жизнеспособных лейкоцитов и клеток эпителия,а также процента макрофагов и фибробластов. Возрастала спонтанная продукция супероксидныхрадикалов и фагоцитарная функция нейтрофилов. Механизм действия препарата был аналогичен вгруппах с разным происхождением хронических ран. Таким образом, IL-1? повышал как репаративные процессы в ранах, так и функции фагоцитов, что способствовало успешному заживлению рани их быстрому очищению и предохраняло от развития вторичных инфекций. Использование IL-1?является перспективным направлением для лечения хронических ран различного генеза у человека.(Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 2. С. 54-62.)
Заживление кожной раны — динамичный процесс, в который вовлечены клетки крови, внеклеточный матрикс, клетки соединительной ткани и растворимые медиаторы — цитокины и ростовые факторы. Одним из важнейших цитокинов, регулирующих местный воспалительный процесс и заживление ран, является IL-1?. Значительная экспрессия этого медиатора в тканях раны происходит уже через 30-90 минут после нанесения раны, а в раневой жидкости определяются высокие уровни IL-1? и IL-1? в, что указывает на активную рольIL-1 в регуляции раневого процесса у человека [3, 11].
Заживление раны проходит три основных фазы — воспаления, регенерации и реорганизации рубца и эпителизации. В любой фазе заживления возможно затяжное течение раневого процесса с вялым ростом грануляций и замедленной эпителизацией. Предпосылкой развития хронического раневого процесса является невозможность завершения острого воспаления полноценной регенерацией по той или иной причине. Основными причинами осложнений заживления ран при хронической венозной недостаточности и при диабете являются ишемия, нейропатия и инфекции. В хронических ранах наблюдаются недостаточность функций макрофагов, снижение продукции ростовых факторов, а также нарушение образования новых сосудов и внеклеточного матрикса [5, 14]. При диабете часто происходит инфицирование ран, так как снижены функции нейтрофилов, играющих основную роль в очищении ран [6]. Широкий спектр биологических активностей IL-1P, вовлеченных в процесс заживления ран, хорошо изучен к настоящему времени в системе in vitro. Обе формы IL-1 — IL-1a и IL-ір обладают ранозаживляющей способностью в экспериментах in vivo [9, 12, 13]. Однако данные, касающиеся использования IL-1 при хронических ранах у человека, до сих пор отсутствуют. Целью данного исследования было углубленное изучение эффектов и возможных механизмов действия мази,содержащей IL-1?, у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами.
Исследование проведено в рамках клинических испытаний мазевой формы IL-1? (ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) на основании разрешения для клинических испытаний Бюро Фармакологического государственного комитета от 16 июля 1998 г. Мазь содержит рекомбинантный человеческий интерлейкин 1? в концентрации 50 нг/мл. Мазевая основа представляет собой смесь ланолина, вазелинового масла, коэмульгатора и воды. Для сравнительной оценки эффективности были исследованы мази с пятью другими концентрациями IL-1? (0,05-5000 нг/мл). В качестве плацебо у пяти больных использовали мазевую основу без интерлейкина.
Определение эффективности мазей, содержащих IL-1 ?, проводили у 88 больных с гнойно-некротическими осложнениями нижних конечностей в возрасте от 24 до 86 лет, среди них 27 мужчин и 61 женщина. Лечение проводили стационарно на базах 1-го и 4-го хирургических отделений Центра по лечению хирургических инфекций (городская больница № 5 Санкт-Петербурга) и 1-го и 2-го хирургических отделений Балтийской клинической центральной бассейновой больницы Санкт-Петербурга. Длительность существования ран до начала лечения была свыше 2 недель, а трофических язв — от 1 месяца до 4 лет. Площадь раневой поверхности — от 35 мм2 до 5780 мм2. Контрольную группу составил 21 больной в возрасте от 36 до 64 лет; мужчин — 4, женщин — 17, длительность существования и размеры трофических язв и длительно незаживающих ран были аналогичны таковым в исследованной группе. Изучение применения ИЛ-IL на фоне сахарного диабета 1 и 2 типов проведено у 20 больных с трофическими язвами (длительность существования язв была от 2 до 10 месяцев, площадь ран составляла от 177 мм2 до 4329 мм2) и у 17 пациентов с незаживающими ранами нижних конечностей (длительность раневого процесса была от 2 до 6 недель, а площадь ран — от 177 мм2 до 2827 мм2). Контрольная группа состояла из 7 больных с трофическими язвами и 7 — с длительно незаживающими ранами. В контрольных группах использовали мази на гидрофобной основе «Солкосерил» и «Вульнузан» (СОФАРМА, Фармахим, Болгария).
Мазь, содержащую IL-1?, начинали использовать после очищения раны и перехода воспаления в фазу регенерации. Мазь наносили на марлевую салфетку и накладывали на поверхность раны. Смену повязок производили ежедневно.
Ежедневно во время перевязок проводили оценку состояния раны и раневой области, при этом учитывали интенсивность образования грануляционной ткани, эпителизации и раневой контракции. Измерение площадей ран производили с помощью планиметрического метода Л.Н. Поповой [2]. Измерение выполняли до начала лечения и повторяли несколько ран в динамике лечения. Вычисляли процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки.
До начала исследования и на нескольких сроках в процессе лечения мазью делали мазки-отпечатки из разных участков ран по методу Т.М. Покровской [2]. Препараты окрашивали по методу Романовского — Гимза и проводили микроскопическую
оценку результатов. При этом учитывали среднее количество клеток и процент сохранных лейкоцитов в поле зрения на не менее чем пяти полях зрения в разных участках препарата (ок. х 16, об. х 40); относительное количество разных типов лейкоцитов и клеток соединительной ткани подсчитывали с использованием масляной иммерсии (ок. х 16, об. х 100). Также учитывали наличие эпителиальных клеток: 0 — эпителий отсутствовал, <+> — единичные клетки в некоторых частях препарата, <++> — отдельные скопления клеток в различных частях препарата, <+++> — пласты эпителиальных клеток в различных частях препарата. Отмечали наличие или отсутствие микробов и их расположение (внеклеточное или внутриклеточное).
Для получения нейтрофилов после предварительного очищения раны производили соскоб ложкой Фолькмана с поверхности раны, полученный клеточный материал ресуспендировали, фильтровали и отмывали центрифугированием. Жизнеспособность полученных нейтрофилов составила 74,30 ± 1,35 %.
Бактерицидную функцию нейтрофилов определяли по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) на стеклах [7]. Определяли спонтанные и индуцированные фоболмиристатацетатом (ФМА, «Sigma», USA; 10 нг/мл) значения. Под микроскопом подсчитывали процент положительных клеток с синими гранулами в цитоплазме, индекс стимуляции высчитывали как отношение значений индуцированного теста к значению спонтанного.
Фагоцитарную функцию нейтрофилов оценивали с использованием опсонизированных дрожжей в качестве объекта фагоцитоза. Нейтрофилы ресуспендировали в концентрации 2,5 х 106 в среде RPMI 1640 («Sigma», USA), содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки («Sigma», USA), и вносили объект фагоцитоза так, чтобы соотношение нейтрофил/дрожжи равнялось 1:10. Пробы инкубировали в течение 40 мин при 37 °С, а затем осаждали клетки центрифугированием. Из осадка готовили мазки, фиксировали и окрашивали по методу Романовского — Гимза. Результаты реакции оценивали микроскопически, подсчитывали фагоцитарную активность (относительное количество фагоцитировавших дрожжи нейтрофилов) и фагоцитарное число (среднее количество дрожжевых клеток, поглощенное одним фагоцитом).
При статистической обработке полученных результатов производили расчет средней арифметической и ошибки средней (Mean ± SEM). Различия между группами оценивали с использованием непараметрического критерия Манна — Уитни.
1. Сравнительное изучение действия мазей с различными концентрациями IL-1?
Для выбора оптимальной концентрации изучали действие мазей с концентрациями IL-1? в диапазоне 0,05-5000 нг/мл. При использовании IL-1? в малых концентрациях (0,05 нг/мл) ни один из показателей регенераторных процессов не достигал значений контрольной группы. Начиная с концентрации 0,5 нг/мл IL-1?, отмечены более ранние сроки появления грануляций и краевой эпителизации, чем в контрольной группе, а при концентрации 5 нг/мл скорость заживления начинала превышатьконтрольные значения за счет процессов раневой контракции. Однако при этом рост грануляций становился чрезвычайно интенсивным и при использовании мази с самой высокой концентрацией 1Ь-1Р (5000 нг/мл) гипергрануляции отмечены уже у 30 % больных. При использовании плацебо отмечено лишь увеличение количества раневого отделяемого, а состояние раны, окружающих тканей и размеры ран оставались без изменений.
Результаты использования мази с концентрацией 1Ъ-1Р 50 нг/мл свидетельствуют о том, что средние сроки появления грануляций и эпителизации были более ранними, чем в контроле (грануляции появлялись на 3,21 и 3,90 сутки и эпителизация — на 3,71 и 4,59 соответственно). Средняя скорость заживления раны была в среднем в 1,4 раза выше, чем в контрольной группе. Рост гипергрануляций (18,6 % случаев) зафиксирован на уровне контрольной группы. Появление эпителизации отмечено у всех больных на 3-4-е сутки, и кроме краевой эпителизации появлялись зоны эпителизации в центральных участках раневой поверхности. Уменьшение размеров раны в 2 раза отмечено у 12 (27,9 %), а полное заживление ран достигнуто у 6 больных (14 %). В контрольной группе полной эпителизации в сроки до 14 суток не достигли, а уменьшение размеров раны в 2 раза наблюдали только у 2 больных (9,5 %).
На основании полученных клинических результатов для углубленного изучения была выбрана мазь, содержащая 50 нг/млIL-1Р, при использовании которой синхронно протекали процессы образования грануляционной ткани и эпителизации, и отмечалось появление островковой эпителизации.
Данные, полученные при исследовании мазков-отпечатков с поверхности ран, представлены в табл. 1. До начала примененияIL-1Р отмечали признаки вялотекущего воспалительного процесса, что проявлялось небольшой клеточностью и преобладанием в ране нейтрофильных лейкоцитов в разной степени деструкции. Количество макрофагов и лимфоцитов было снижено, а фибробласты и эпителиальные клетки почти полностью отсутствовали. Отмечено значительное количество микроорганизмов в ране, которые располагались внеклеточно вокруг разрушенных нейтрофилов. Позитивные изменения цитограмм были отмечены при применении мазей, содержащих 0,5-5000 нг/млIL-1Р, при этом изменения были более выраженными по мере увеличения концентрацииIL-1р.
При применении мази, содержащей 50 нг/мл -1Р, морфологическая картина отражала положительную динамику процесса заживления раны.
Таблица 1Влияние применения мазей, содержащих различные концентрации IL-1?, на цитологический состав в ранах
Примечание. Количество больных в группах: п = 4-38. Различия с контрольной группой достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, ++ — р < 0,01, +++ — р < 0,005.
На 3-4-е сутки наблюдения достоверноувеличилось количество и сохранность лейкоцитов на поверхности ран. Начиная с 3-4-х суток, количество нейтрофилов последовательно снижалось за счет значительного увеличения доли макрофагов и клеток соединительной ткани. Относительное количество лимфоцитов повысилось по сравнению с исходными данными, но не превышало контрольных значений. Появление эпителиальных клеток отмечено на 3-4-е сутки (0—<++>). Микрофлора наблюдалась вне- и внутриклеточно. Цитограмма свидетельствовала о стихании воспалительного процесса. На 7—8-е сутки количество лейкоцитов вернулось к исходным показателям, при этом еще больше возросла степень их сохранности. В этот период показатели количества макрофагов достигли максимальных значений, и увеличилось относительное количество клеток соединительной ткани. Количество лимфоцитов оставалось на прежнем уровне. Наблюдали пласты эпителиальных клеток (0—<+ ++>) и картины фагоцитоза микробов нейтрофилами. Данные говорили об активации репаративных процессов. На 10-14-е сутки наблюдения сохранялись вышеописанные изменения, а количество клеток соединительной ткани продолжало возрастать по сравнению с исходными значениями. На мазках наблюдали пласты эпителиоцитов (0—<+ ++>), микрофлора в этот период не наблюдалась. Позитивные изменения в цитологической картине также отмечали на более поздних сроках лечения препаратом (18-е сутки): общее количество свободно лежащих клеток в ране значительно уменьшилось (9,95 ± 2,73 клеток на поле зрения), так как клетки более прочно удерживались в составе грануляционной ткани, а количество сохранных лейкоцитов вернулось к исходным значениям (77,0 ± 2,9 %). Процент нейтрофи- лов в ране к 18-м суткам лечения был близок к исходному уровню (86,1 ± 3,4 %), а доля клеточных элементов в ране постепенно сократилась (6,75 ± 2,26 % — лимфоциты; 4,83 ± 1,49 % — макрофаги; 2,50 ± 0,5 % — фибробласты).
При использовании мази с концентрацией IL-1P 0,05 нг/мл при цитологическом исследовании не было выявлено положительной динамики, показатели оставались на исходном уровне. При использовании плацебо цитологическая картина на 3-4-е и 7-8-е сутки не отличалась от таковой до начала лечения (данные не представлены).
2. Оценка эффективности мази, содержащей 50 нг/мл IL-lfi, у больных с различной этиологией ран и трофических язв
2.1. Изучение действия IL-1 в при трофических язвах и длительно незаживающих ранах
Клиническая оценка применения мази с IL-1? показала высокую эффективность препарата при лечении больных с трофическими язвами на фоне хронической венозной недостаточности и больных с длительно незаживающими ранами после гнойно-некротических процессов. Ускорялись сроки появления грануляций и эпителизации, а скорость заживления составила 5,66 ± 1,0 %/суток при трофических язвах и 4,71 ± 0,1 %/суток при длительно незаживающих ранах.
Картина, полученная при морфологическом исследовании мазков-отпечатков из трофических язв после применения IL-1?, аналогична таковой, полученной для смешанной группы (табл. 2). При первом исследовании на мазках-отпечатках наблюдали низкое количество клеток, сохранность лейкоцитов была невысокой. В поле зрения преобладали нейтрофильные лейкоциты, доли лимфоцитов, макрофагов и особенно клеток соединительной ткани были малы. Эпителиальные клетки практически отсутствовали. Микрофлора располагалась внеклеточно вокруг разрушенных лейкоцитов. После применения IL-1? на 3-4-е сутки количество клеток значительно возрастало и к 7-8-м суткам вновь снижалось, а сохранность лейкоцитов достоверно увеличилась на 7-8-е сутки. Начиная с 3-4-х суток, и на всех сроках наблюдения доля нейтрофилов достоверно снижалась. Повышалось количество лимфоцитов на 3-4-е и, главным образом, на 7-8-е сутки. Доля макрофагов была повышена с 3-4-х суток и на всех сроках исследования. Начиная с 3-4-х суток, доля фибробластов начинала постепенно возрастать и с 7-8-х суток значительно увеличивалась. На мазках наблюдали эпителиальные клетки: на 3-4-е сутки — единичные (0—<++>), на 7-8-е сутки — единичные, скопления и в виде пластов (0—<+ ++>), 10-14-е сутки — пласты эпителиальных клеток на мазках-отпечатках (0—<+++>). Микрофлора на 3-4-е сутки располагалась вне- и внутриклеточно, наблюдали картины фагоцитоза. На 7-8-е сутки микрофлора в большинстве случаев не отмечалась или находилась внутрик- леточно, а на 10-14-й день микрофлора в ране не обнаруживалась.
При цитологическом исследовании мазков-отпечатков из длительно незаживающих ран на 3-4-е и 7-8-е сутки применения IL-1? были отмечены результаты, сходные с предыдущей группой, но изменения в данной группе были менее выраженными (табл. 2). К 10-14-м суткам количество лейкоцитов составило 27,00 ± 16,8 клеток в поле зрения, а их сохранность была равна 77,00 ± 4,93 %. Доли нейтрофилов и лимфоцитов значительно не изменились (86,8 ± 3,44 и 3,67 ± 0,17 %, соответственно), а доли макрофагов и фибробластов постепенно уменьшились (4,33 ± 1,45 и 5,17 ± 3,77 %, соответственно).
Беталейкин при ранах и трофических язвах
2.2. Изучение ранозаживляющего действия мази с 50 нг/мл 1Ь-1$ у больных с сахарным диабетом I и II типов
На фоне применения 1Ъ-1Р у больных диабетом с длительно незаживающими ранами грануляционная ткань начала развиваться в среднем на сутки раньше, чем в контрольной группе, а эпителизация появилась в среднем на 3,67 сутки лечения (в контроле, в среднем, на 4,5 сутки). Скорость заживления раны была при этом в полтора раза выше, чем в контрольной группе. При лечении трофических язв также отмечалась активация вялотекущих процессов. В среднем на четвертые сутки (в контрольной группе, в среднем, на 4,5 сутки) от начала
применения препарата отмечалась активизация роста грануляционной ткани, а эпителизация появилась в среднем на 4,2 сутки (в контрольной группе, в среднем, на 4,7 сутки). Скорость заживления ран у этих пациентов в 1,8 раза превышала контрольные значения.
Цитологическая картина на мазках-отпечатках у больных диабетом до лечения характеризовалась небольшим количеством клеток на поверхности раны и низким показателем их жизнеспособности (табл. 3). В ране преобладали нейтрофилы, в то время как число лимфоцитов и макрофагов было невелико. На мазках-отпечатках располагались единичные фибробласты и, реже, клетки эпителия.
Таблица 2Цитологическое исследование мазков-отпечатков из трофических язв на фоне венозной недостаточности и длительно незаживающих ран после гнойно-некротических процессов
Примечание. Группа I — трофические язвы на фоне венозной недостаточности, группа II — вялогранулирующие раны после гнойно-некротических процессов. Различия с контрольной группой достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, ++ — р < 0,01, +++ — р < 0,005.
Таблица 3Цитологическое исследование мазков-отпечатков хронических ран на фоне диабета I и II типов
Примечание. Различия с контрольной группой достоверны: ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, +++ — р < 0,005. Количество исследований: !1_-1р — п = 12, контроль — п = 6.
На 3-4-е сутки общее количество клеток и их жизнеспособность значительно увеличились по сравнению с исходными значениями. Число нейтрофилов уменьшилось, тогда как количество макрофагов и фибробластов возросло по сравнению с данными до начала лечения и контрольной группой. На 7-8-е сутки количество клеток на отпечатках вновь снизилось. Сохранность клеток, а также клеточный состав на поверхности ран остался примерно на том же уровне. На 10-14-е сутки количество клеток составило 15,30 ± 5,57 клеток в поле зрения, а их сохранность (75,10 ± 6,20 %) превышала исходные значения (p<0,05). Количество нейтрофилов в ране вновь немного увеличилось (86,10 ± 3,96 %), а процент лимфоцитов (3,00 ± 1,02 %) вернулся к данным, полученным до лечения. Относительное количество макрофагов и фибробластов оставалось высоким (6,25 ± 2,36 и 6,33 ± 2,50 %, соответственно), при этом доля фибробластов достоверно превышала исходные значения (p<0,05). На мазках- отпечатках наблюдали эпителиальные клетки и их скопления (0—<++>). В целом, при применении мази с IL-1 ? в группе больных диабетом цитологические показатели также демонстрировали общую положительную динамику, которая, однако, была не столь выраженной, как в смешанной группе.
3. Изучение влияния применения мази с IL-1? на функции нейтрофилов
До начала лечения был проведен сравнительный анализ функциональной активности нейтрофилов, полученных от больных с ранами разной этиологии. Так, показатели спонтанного НСТ-теста были значительно выше у тех больных, которые не страдали диабетом (29,50 ± 4,0 %) по сравнению с больными диабетом (12,40 ± 2,30 %, p<0,05); это было верно и для значений индуцированного НСТ-теста (61,20 ± 5,18 % и 42,60 ± 6,49 %, соответственно, p<0,005). Таким же образом различались индексы стимуляции у данных категорий больных (2,71 ± 0,40 и 5,02 ± 1,48, соответственно, р=0,05). Показатели фагоцитоза, тем не менее, существенно не различались у больных без диабета и у пациентов, страдавших диабетом. Фагоцитарная активность составила 48,70 ± 3,60 и 49,10 ± 4,08 %, а фагоцитарное число равнялось 2,31 ± 0,11 и 2,24 ± 0,23, соответственно (p>0,05).
На 3-4-е и на 7-8-е сутки применения мази с IL-1? в смешанной группе отмечали увеличение показателей спонтанной продукции супероксидных радикалов по сравнению с исходными значениями и контрольной группой (рис. 1а), б). Эти значения были также высокими на 10-14-е сутки по сравнению с исходными значениями, когда началось увеличение показателей в группе контроля. Наблюдалась также тенденция к повышению индуцированного НСТ-теста, но различия не достигали статистической достоверности. Соответственно изменялись индексы стимуляции, которые снижались на 7-8-е сутки применения IL-1P. Особенно выраженным являлось усиление фагоцитарной функции нейтрофилов. Начиная с 3-4-х суток, значительно возрастали как показатели фагоцитарной активности, так и фагоцитарное число по сравнению с исходными значениями и контрольной группой (рис. 2а), б). К 10-14-м суткам фагоцитарное число немного снижалось, при этом все показатели по- прежнему превышали исходные значения.
Клинические исследования показали, что применение мазей, содержащих IL-1P в различных концентрациях, вызывает улучшение заживления хронических ран, выраженное в той или иной степени в зависимости от концентрации цитокина [1]. При использовании оптимальной концентрации IL-1 в 50 нг/мл, с одной стороны, получены высокие показатели заживления раны, а с другой, отмечен невысокий процент случаев роста гипергрануляций. Данная мазь оказывала наиболее благоприятный эффект на эпителизацию ран. Полученные клинические результаты подтверждаются экспериментальными данными о том, что применение мази, содержавшей IL-1P именно в концентрации 50 нг/мл, оказывало выраженное ранозаживляю- щее действие in vivo, повышая плотность грануляционной ткани и усиливая эпителизацию кожных ран [12].
При оценке течения раневого процесса большое значение придают цитологическому анализу. Наблюдаемая нами до начала применения мази с IL-1P цитологическая картина типична для длительно незаживающих ран и свидетельствует об угнетении регенеративных и репаративных процессов в ранах. Согласно полученным данным, применение мазевой формы IL-1P приводит к увеличению количества функционально активных лейкоцитов на раневой поверхности, что свидетельствует о появлении защитной неспецифической клеточной активности. Рост числа лимфоцитов и макрофагов в раневом отделяемом на фоне местных аппликаций IL-1P указывает на позитивные сдвиги в репара- тивном процессе. Макрофаги играют важную роль при заживлении ран за счет высокой фагоцитарной активности и продукции цитокинов. У экспериментальных животных, лишенных макрофагов, скорость заживления ран значительно снижена [4]. Лимфоциты продуцируют IL-2 и IFNy, которые регулируют продукцию макрофагами ростовых факторов для фибробластов, а также продуцируют TGFP, который стимулирует синтез коллагена. При трофических язвах на фоне венозной недостаточности и при диабете у человека снижено количество Т-лимфоцитов в раневом очаге и наблюдаются дефекты функциональной активации раневых макрофагов [5].
Рис. 1. Продукция супероксидных радикалов нейтрофилами (НСТ-тест) при применении 11_-1р
Примечание к рис. 1 и 2. Сроки исследований: 1 — до лечения, 2 — 3-4-е сутки, 3 — 7-8-е сутки, 4 — 10-14-е сутки лечения. Группыбольных: 11_-1р — п = 20, контроль — п = 17. Различия достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01 с контролем,+ — р < 0,05, ++ — р < 0,01 с исходными значениями.
Рис. 2. Изменения показателей фагоцитарной функции нейтрофилов при применении 11_-1р
До начала лечения клетки соединительной ткани и эпителия на мазках-отпечатках из ран практически отсутствовали или наблюдались в незначительных количествах. Эти цитологические показатели отражают клиническую картину замедленного роста грануляционной ткани и резкого снижения эпителизации ран. По литературным данным, в трофических язвах наблюдают нарушения функций фибробластов [5]. При экспериментально индуцированном диабете наблюдается тяжелый дефицит эпителизации, связанный с нарушениями продукции фактора роста кера- тиноцитов [14]. На фоне применения 1Ъ-1Р было выявлено увеличение количества фибробластов и клеток эпителия, ускорение сроков начала роста грануляционной ткани и эпителизации. 1Ь-1Р, по- видимому, также активизировал формирование миофибрилл, что ускоряло уменьшение размеровраны за счет контракции. Известно, что обе формы IL-1 — IL-ip и IL-1a — повышают рост фибробластов и синтез ими компонентов внеклеточного матрикса [10]. IL-1a может стимулировать эпителизацию ран in vivo [9]. В экспериментах in vivo применение человеческого рекомбинантного IL-1P повышало прочность раневого рубца у облученных мышей [13].Особую важность, с нашей точки зрения, представляют данные, подтверждающие эффективность применения мази с IL-1P у больных сахарным диабетом I и II типов. Известно, что адекватная воспалительно-регенеративная реакция при сахарном диабете, даже компенсированном, из-за выраженных нейротрофических и сосудистых расстройств нарушается. Результаты исследования свидетельствуют о том, что механизмы действия IL-1P у больных сахарным диабетом аналогичнытем, что были описаны для смешанной группы. Однако переход к регенеративной фазе происходил более медленно, чем в смешанной группе, что подтверждалось результатами цитологического исследования.
При сравнительном изучении эффектов применения IL-1? оказалось, что наибольшие изменения в раневом процессе происходили при трофических язвах на фоне венозной недостаточности. Данные цитограмм подтверждали клинические результаты, что наибольшей была скорость заживления язв, обусловленных венозной недостаточностью. Это свидетельствует о том, что именно наличие нейропатии в сочетании с ангиопатией значительно ухудшает течение регенераторных процессов.
Для углубленного изучения возможных механизмов местного действия IL-1? было проведено исследование функциональной активности раневых нейтрофилов. Нейтрофилы обеспечивают очищение раны от микробов и продуктов клеточного распада. При хронических незаживающих ранах у человека преобладают деструктивные формы лейкоцитов, фагоцитарная активность нейтрофилов резко понижена, фагоцитоз приобретает характер незавершенного и заканчивается гибелью лейкоцита. Литературные данные свидетельствуют об ослаблении бактерицидной функции, фагоцитоза и хемотаксиса нейтрофи- лов при диабете [6]. По нашим данным, у больных диабетом наблюдалось снижение бактерицидности нейтрофилов, которое было более выраженным, чем ослабление поглотительной способности этих клеток. Усиление процессов фагоцитоза после применения IL-1? приводило к ускорению очищения раны от некротических тканей и микроорганизмов, и в дальнейшем предохраняло рану от развития вторичной инфекции. Известно, что IL-1 способен стимулировать функции нейтрофилов. Показано,
что инкубация нейтрофилов человека с IL-1 усиливает способность лейкоцитов отвечать на другие стимулы, повышая продукцию супероксидных радикалов [15]. Предобработка нейтрофилов с помощью рекомбинантных человеческих IL-1? или IL-1a вызывает усиление фагоцитоза [8].
При длительно незаживающих ранах различного генеза у человека наблюдают присутствие провоспалительных цитокинов — IL-1 a и ?, TNFa, IL-6 и хемокинов в раневой жидкости [11]. В то же время, в хронических ранах присутствуют в значительных концентрациях их антагонисты, такие как IL-1Ra и IL-10, и, в конечном итоге, не происходит заживления ран. Очевидно, для успешного заживления хронических ран важен именно баланс между позитивными и негативными стимулами в раневом очаге. По-видимому, именно внесение экзогенного IL-1? в физиологической концентрации, который действует как иммуномодулятор, дает толчок к заживлению хронической раны.
Доклинические и клинические испытания ряда ростовых факторов и цитокинов для лечения ран, вызванных ишемией и на фоне диабета, продемонстрировали их эффективность. Однако, эффекты отдельных факторов, применяемых индивидуально, могут быть недостаточными для полноценного заживления ран, поскольку они оказывают действие только на определенные типы клеток: нейтрофилы, клетки соединительной ткани или эпителия. Как следует из полученных данных, IL-1? повышал как репаративные процессы в ранах, так и функции фагоцитов, что способствовало успешному заживлению ран. Поэтому использование IL-1?, цитокина с широким спектром биологического действия, с нашей точки зрения, является перспективным направлением для лечения хронических ран различного генеза у человека.
Бубнов А.Н., Симбирцев А.С., Лебедева Т.П. и др. Первый опыт примененияинтерлейкиновой мази // Сб. трудов науч. конф. СПб МАПО «Хирургическая анатомия, техника и патофизиология». — СПб.: МАПО, 1995. —С. 109-111.
Методические рекомендации по экспериментальному изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран. — М., 1989.
GreLLner W. Time-dependent immunohistochemical detection of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-б, TNF-alpha) in human skin wounds // Forensic Sci. Int. — 2002. — Vol. 130, № 2-3. — P. 90-96.
Leibovich S.J., Ross R. The role of macrophage in wound repair. A study with hydrocortisone and antimacrophage serum // Am. J. Pathol. — 1975. — Vol. 78, № 1. — P. 71-100.
Loots M.A., Lamme E.N., Zeegelaar J. et al. Difference in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds // J. Invest. Dermatol. - 1998. - Vol. 111, № 5. - P. 850-857.
Nolan C.M., Beaty H.N., Bagdade J.D. Further characterization of the impaired bactericidal function of granulocytes in patients with poorly controlled diabetes // Diabetes. - 1978. - Vol. 27, № 9. - 889-894.
Ochs H.D., Igo R.P. The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic granulomatous disease and female carriers // J. Pediatr. — 1973. — Vol. 83, № 1. — P. 77-82.
Ogle J.D., Noel J.G., Balasurbramaniam A. et al. Comparison of abilities of recombinant IL-1a and P and noninflammatory IL-1P fragment 163-171 to upregulate
C3b receptor (CRI) on human neutrophils to enhance their phagocytic capacity // Inflammation. — 1990. — Vol. 14, № 2. — P. 182-194.
Sauder D.N., Kilian P.L., McLane J.A. et al. Interleukin-1 enhances epidermal wound healing // Lymphokine Res. — 1990. — Vol. 9, № 4. — P. 465-473.
Thornton S.C., Por S.B., Walsh B.J. et al. Interaction of immune and connective tissue cells: the effects of lymphokines and monokines on fibroblast growth // J. Leukoc. Biol. — 1990. — Vol. 47, № 4. — P. 312-320.
Trengove N.J., Bielefeldt-Ohmann H., Stacey M.C. Mitogenic activity and cytokine levels in non-healing and healing chronic ulcers // Wound Rep. Regen. — 2000. — Vol. 8, № 1. — P. 13-25.
Variouchina E.A., Antsiferova M.A., Aleksandrov G.V. et al. Topical application of interleukin-1p accelerates wound healing in hydrocortisone-treated mice // Russ. J. Immunol. — 2003. — Vol. 8. — P. 155-164.
Vegesna V., McBride W.H., Taylor J.M. at al. The effect of interleukin-1p or transforming growth factor-p on radiation-impaired murine skin wound healing // J. Surg. Res. — 1995. — Vol. 59, № 6. — P. 699-704.
Werner S., Breeden M., Hubner G. et al. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse // J. Invest. Dermatol. — 1994. — Vol. 103, № 4. — P. 469-473.
Yagisawa M., Yuo A., Kitagawa S. et al. Stimulation and priming of human neutrophils by interleukin-1a and interleukin-1p: complete inhibition by IL-1 receptor antagonist and no interaction with others cytokines // Exp. Hema- tol. — 1995. — Vol. 23, № 7. — P. 603-608.
Wound healing and local immunostimulatory activity of recombinant human IL-ip in patients with non-healing wounds and trophic leg ulcers
2 Medical Academy of Postgraduate Education, St. Petersburg
The aim of the study was to investigate the therapeutic effects of recombinant human IL-ip local application in patients with chronic wounds. IL-ip was used in the doses of 0.05 — 5000 ng/ml to treat non-healing wounds and trophic ulcers in patients with venous diseases or diabetes. Clinical assessment, wound areas measurements, cytological analysis and wound neutrophil functions (NBT-test and phagocytosis) study were performed before and several times during the treatment period. Treatment with IL-ip resulted in clinical improvement of wound healing in all groups of patients. Based on clinical results, the optimal concentration of IL-ip — 50 ng/ml - was chosen. IL-ip application caused a significant increase in number of wound leukocytes and epithelial cells as well as percent of macrophages and fibroblasts. IL-ip treatment stimulated spontaneous superoxide production and phagocytosis of wound neutrophils. Mechanisms of action of the preparation were the same in different groups of patients. Thus, IL-ip caused significant stimulation of wound reparation processes as well as activation of wound phagocyte functions which provides acceleration of wound healing, quicker clearance of wound areas and protects them from secondary infections. Local application of IL-ip can be a perspective way for treatment of chronic wounds in patients. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 2. P. 54-62.)