Ранозаживляющее и местное иммуностимулирующее действие рекомбинантного IL-1 ? человека при применении у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами Е.А. Варюшина, В.В. Москаленко, А.С. Симбирцев, Т.П. Лебедева, А.Н. Бубнов

Ранозаживляющее и местное иммуностимулирующее действие рекомбинантного IL-1 ? человека при применении у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами Е.А. Варюшина, В.В. Москаленко, А.С. Симбирцев, Т.П. Лебедева, А.Н. Бубнов

1 ФГУП «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА РФ, Санкт-Петербург;2 Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Целью исследования было изучение лечебного эффекта И-1Р при хронических ранах различной этиологии у человека. Рекомбинантный человеческий И-1Р (ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) применяли в составе мазей на гидрофобной основе в концентрациях 0,05-5000 нг/мл у больных с трофическими язвами и длительно незаживающими ранами нижних конечностей на фоне венозной недостаточности или диабета I или II типов. Лечение мазью с И-1Р показало высокую клиническую эффективность во всех группах больных. При клинических исследованиях была выбрана наиболее эффективная концентрация И-1Р в мази — 50 нг/мл. Цитологический анализ мазков-отпечатков из ран при применении И-1Р показал увеличение числа жизнеспособных лейкоцитов и клеток эпителия, а также процента макрофагов и фибробластов. Возрастала спонтанная продукция супероксидных радикалов и фагоцитарная функция нейтрофилов. Механизм действия препарата был аналогичен в группах с разным происхождением хронических ран. Таким образом, IL-1? повышал как репаративные процессы в ранах, так и функции фагоцитов, что способствовало успешному заживлению ран и их быстрому очищению и предохраняло от развития вторичных инфекций. Использование IL-1? является перспективным направлением для лечения хронических ран различного генеза у человека. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 2. С. 54-62.)

Ключевые слова: интерлейкин-1, хронические раны, нейтрофилы.

Заживление кожной раны — динамичный про­цесс, в который вовлечены клетки крови, внекле­точный матрикс, клетки соединительной ткани и растворимые медиаторы — цитокины и ростовые факторы. Одним из важнейших цитокинов, регу­лирующих местный воспалительный процесс и заживление ран, является IL-1?. Значительная экс­прессия этого медиатора в тканях раны происходит уже через 30-90 минут после нанесения раны, а в раневой жидкости определяются высокие уровни IL-1? и IL-1? в, что указывает на активную роль IL-1 в регуляции раневого процесса у человека [3, 11].

Заживление раны проходит три основных фазы — воспаления, регенерации и реорганизации рубца и эпителизации. В любой фазе заживления возможно затяжное течение раневого процесса с вялым ростом грануляций и замедленной эпителизацией. Предпосылкой развития хронического ра­невого процесса является невозможность завершения острого воспаления полноценной регенерацией по той или иной причине. Основными причинами осложнений заживления ран при хронической венозной недостаточности и при диабете являются ишемия, нейропатия и инфекции. В хронических ранах наблюдаются недостаточность функций мак­рофагов, снижение продукции ростовых факторов, а также нарушение образования новых сосудов и внеклеточного матрикса [5, 14]. При диабете часто происходит инфицирование ран, так как снижены функции нейтрофилов, играющих основную роль в очищении ран [6]. Широкий спектр биологичес­ких активностей IL-1P, вовлеченных в процесс за­живления ран, хорошо изучен к настоящему вре­мени в системе in vitro. Обе формы IL-1 — IL-1a и IL-ір обладают ранозаживляющей способностью в экспериментах in vivo [9, 12, 13]. Однако данные, касающиеся использования IL-1 при хронических ранах у человека, до сих пор отсутствуют. Целью данного исследования было углубленное изучение эффектов и возможных механизмов действия мази,содержащей IL-1?, у больных с длительно незажи­вающими ранами и трофическими язвами.

Исследование проведено в рамках клинических испытаний мазевой формы IL-1? (ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург) на осно­вании разрешения для клинических испытаний Бюро Фарма­кологического государственного комитета от 16 июля 1998 г. Мазь содержит рекомбинантный человеческий интерлейкин 1? в концентрации 50 нг/мл. Мазевая основа представляет собой смесь ланолина, вазелинового масла, коэмульгатора и воды. Для сравнительной оценки эффективности были исследованы мази с пятью другими концентрациями IL-1? (0,05-5000 нг/мл). В качестве плацебо у пяти больных использовали мазевую основу без интерлейкина.

Определение эффективности мазей, содержащих IL-1 ?, про­водили у 88 больных с гнойно-некротическими осложнениями нижних конечностей в возрасте от 24 до 86 лет, среди них 27 мужчин и 61 женщина. Лечение проводили стационарно на базах 1-го и 4-го хирургических отделений Центра по лечению хирур­гических инфекций (городская больница № 5 Санкт-Петербурга) и 1-го и 2-го хирургических отделений Балтийской клинической центральной бассейновой больницы Санкт-Петербурга. Длитель­ность существования ран до начала лечения была свыше 2 недель, а трофических язв — от 1 месяца до 4 лет. Площадь раневой по­верхности — от 35 мм2 до 5780 мм2. Контрольную группу составил 21 больной в возрасте от 36 до 64 лет; мужчин — 4, женщин — 17, длительность существования и размеры трофических язв и дли­тельно незаживающих ран были аналогичны таковым в исследо­ванной группе. Изучение применения ИЛ-IL на фоне сахарного диабета 1 и 2 типов проведено у 20 больных с трофическими язвами (длительность существования язв была от 2 до 10 месяцев, площадь ран составляла от 177 мм2 до 4329 мм2) и у 17 пациентов с незаживающими ранами нижних конечностей (длительность раневого процесса была от 2 до 6 недель, а площадь ран — от 177 мм2 до 2827 мм2). Контрольная группа состояла из 7 больных с трофическими язвами и 7 — с длительно незаживающими ранами. В контрольных группах использовали мази на гидрофобной основе «Солкосерил» и «Вульнузан» (СОФАРМА, Фармахим, Болгария).

Мазь, содержащую IL-1?, начинали использовать после очи­щения раны и перехода воспаления в фазу регенерации. Мазь наносили на марлевую салфетку и накладывали на поверхность раны. Смену повязок производили ежедневно.

Ежедневно во время перевязок проводили оценку состояния раны и раневой области, при этом учитывали интенсивность образования грануляционной ткани, эпителизации и раневой контракции. Измерение площадей ран производили с помощью планиметрического метода Л.Н. Поповой [2]. Измерение выпол­няли до начала лечения и повторяли несколько ран в динамике лечения. Вычисляли процент уменьшения площади раневой поверхности за сутки.

До начала исследования и на нескольких сроках в процессе лечения мазью делали мазки-отпечатки из разных участков ран по методу Т.М. Покровской [2]. Препараты окрашивали по методу Романовского — Гимза и проводили микроскопическую

оценку результатов. При этом учитывали среднее количество клеток и процент сохранных лейкоцитов в поле зрения на не менее чем пяти полях зрения в разных участках препарата (ок. х 16, об. х 40); относительное количество разных типов лейкоцитов и клеток соединительной ткани подсчитывали с использованием масляной иммерсии (ок. х 16, об. х 100). Также учитывали наличие эпителиальных клеток: 0 — эпителий отсутствовал, <+> — единичные клетки в некоторых частях пре­парата, <++> — отдельные скопления клеток в различных частях препарата, <+++> — пласты эпителиальных клеток в различных частях препарата. Отмечали наличие или отсутствие микробов и их расположение (внеклеточное или внутриклеточное).

Для получения нейтрофилов после предварительного очище­ния раны производили соскоб ложкой Фолькмана с поверхности раны, полученный клеточный материал ресуспендировали, филь­тровали и отмывали центрифугированием. Жизнеспособность полученных нейтрофилов составила 74,30 ± 1,35 %.

Бактерицидную функцию нейтрофилов определяли по вос­становлению нитросинего тетразолия (НСТ) на стеклах [7]. Опре­деляли спонтанные и индуцированные фоболмиристатацетатом (ФМА, «Sigma», USA; 10 нг/мл) значения. Под микроскопом под­считывали процент положительных клеток с синими гранулами в цитоплазме, индекс стимуляции высчитывали как отношение значений индуцированного теста к значению спонтанного.

Фагоцитарную функцию нейтрофилов оценивали с использова­нием опсонизированных дрожжей в качестве объекта фагоцитоза. Нейтрофилы ресуспендировали в концентрации 2,5 х 106 в среде RPMI 1640 («Sigma», USA), содержащей 10 % телячьей эмбриональ­ной сыворотки («Sigma», USA), и вносили объект фагоцитоза так, чтобы соотношение нейтрофил/дрожжи равнялось 1:10. Пробы инкубировали в течение 40 мин при 37 °С, а затем осаждали клетки центрифугированием. Из осадка готовили мазки, фиксировали и окрашивали по методу Романовского — Гимза. Результаты реакции оценивали микроскопически, подсчитывали фагоцитар­ную активность (относительное количество фагоцитировавших дрожжи нейтрофилов) и фагоцитарное число (среднее количество дрожжевых клеток, поглощенное одним фагоцитом).

При статистической обработке полученных результатов про­изводили расчет средней арифметической и ошибки средней (Mean ± SEM). Различия между группами оценивали с исполь­зованием непараметрического критерия Манна — Уитни.

Результаты и обсуждение

1. Сравнительное изучение действия мазей с различными концентрациями IL-1?

Для выбора оптимальной концентрации изучали действие мазей с концентрациями IL-1? в диапа­зоне 0,05-5000 нг/мл. При использовании IL-1? в малых концентрациях (0,05 нг/мл) ни один из по­казателей регенераторных процессов не достигал значений контрольной группы. Начиная с концент­рации 0,5 нг/мл IL-1?, отмечены более ранние сро­ки появления грануляций и краевой эпителизации, чем в контрольной группе, а при концентрации 5 нг/мл скорость заживления начинала превышать контрольные значения за счет процессов раневой контракции. Однако при этом рост грануляций становился чрезвычайно интенсивным и при ис­пользовании мази с самой высокой концентрацией 1Ь-1Р (5000 нг/мл) гипергрануляции отмечены уже у 30 % больных. При использовании плацебо отме­чено лишь увеличение количества раневого отде­ляемого, а состояние раны, окружающих тканей и размеры ран оставались без изменений.

Результаты использования мази с концентраци­ей 1Ъ-1Р 50 нг/мл свидетельствуют о том, что сред­ние сроки появления грануляций и эпителизации были более ранними, чем в контроле (грануляции появлялись на 3,21 и 3,90 сутки и эпителизация — на 3,71 и 4,59 соответственно). Средняя скорость заживления раны была в среднем в 1,4 раза выше, чем в контрольной группе. Рост гипергрануляций (18,6 % случаев) зафиксирован на уровне контроль­ной группы. Появление эпителизации отмечено у всех больных на 3-4-е сутки, и кроме краевой эпителизации появлялись зоны эпителизации в центральных участках раневой поверхности. Уменьшение размеров раны в 2 раза отмечено у 12 (27,9 %), а полное заживление ран достигнуто у 6 больных (14 %). В контрольной группе полной эпителизации в сроки до 14 суток не достигли, а уменьшение размеров раны в 2 раза наблюдали только у 2 больных (9,5 %).

На основании полученных клинических ре­зультатов для углубленного изучения была выбрана мазь, содержащая 50 нг/мл IL-1Р, при использовании которой синхронно протекали процессы образования грануляционной ткани и эпителизации, и отмечалось появление островковой эпителизации.

Данные, полученные при исследовании маз­ков-отпечатков с поверхности ран, представлены в табл. 1. До начала применения IL-1Р отмечали признаки вялотекущего воспалительного про­цесса, что проявлялось небольшой клеточностью и преобладанием в ране нейтрофильных лейко­цитов в разной степени деструкции. Количест­во макрофагов и лимфоцитов было снижено, а фибробласты и эпителиальные клетки почти полностью отсутствовали. Отмечено значитель­ное количество микроорганизмов в ране, которые располагались внеклеточно вокруг разрушенных нейтрофилов. Позитивные изменения цитограмм были отмечены при применении мазей, содержа­щих 0,5-5000 нг/мл IL-1Р, при этом изменения были более выраженными по мере увеличения концентрации IL-1р.

При применении мази, содержащей 50 нг/мл -1Р, морфологическая картина отражала по­ложительную динамику процесса заживления раны.

Таблица 1 Влияние применения мазей, содержащих различные концентрации IL-1?, на цитологический состав в ранах

 

Примечание. Количество больных в группах: п = 4-38. Различия с контрольной группой достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, ++ — р < 0,01, +++ — р < 0,005.

На 3-4-е сутки наблюдения достоверно увеличилось количество и сохранность лейко­цитов на поверхности ран. Начиная с 3-4-х су­ток, количество нейтрофилов последовательно снижалось за счет значительного увеличения доли макрофагов и клеток соединительной ткани. Относительное количество лимфоцитов повысилось по сравнению с исходными данны­ми, но не превышало контрольных значений. Появление эпителиальных клеток отмечено на 3-4-е сутки (0—<++>). Микрофлора наблюда­лась вне- и внутриклеточно. Цитограмма сви­детельствовала о стихании воспалительного процесса. На 7—8-е сутки количество лейкоцитов вернулось к исходным показателям, при этом еще больше возросла степень их сохранности. В этот период показатели количества макро­фагов достигли максимальных значений, и увеличилось относительное количество клеток соединительной ткани. Количество лимфоцитов оставалось на прежнем уровне. Наблюдали плас­ты эпителиальных клеток (0—<+ ++>) и картины фагоцитоза микробов нейтрофилами. Данные говорили об активации репаративных процес­сов. На 10-14-е сутки наблюдения сохранялись вышеописанные изменения, а количество клеток соединительной ткани продолжало возрастать по сравнению с исходными значениями. На мазках наблюдали пласты эпителиоцитов (0—<+ ++>), микрофлора в этот период не наблюдалась. По­зитивные изменения в цитологической картине также отмечали на более поздних сроках лече­ния препаратом (18-е сутки): общее количество свободно лежащих клеток в ране значительно уменьшилось (9,95 ± 2,73 клеток на поле зрения), так как клетки более прочно удерживались в составе грануляционной ткани, а количество сохранных лейкоцитов вернулось к исходным значениям (77,0 ± 2,9 %). Процент нейтрофи- лов в ране к 18-м суткам лечения был близок к исходному уровню (86,1 ± 3,4 %), а доля клеточ­ных элементов в ране постепенно сократилась (6,75 ± 2,26 % — лимфоциты; 4,83 ± 1,49 % — мак­рофаги; 2,50 ± 0,5 % — фибробласты).

При использовании мази с концентрацией IL-1P 0,05 нг/мл при цитологическом исследовании не было выявлено положительной динамики, показа­тели оставались на исходном уровне. При исполь­зовании плацебо цитологическая картина на 3-4-е и 7-8-е сутки не отличалась от таковой до начала лечения (данные не представлены).

2. Оценка эффективности мази, содержащей 50 нг/мл IL-lfi, у больных с различной этиологией ран и трофических язв

2.1. Изучение действия IL-1 в при трофических язвах и длительно незаживающих ранах

Клиническая оценка применения мази с IL-1? показала высокую эффективность препарата при лечении больных с трофическими язвами на фоне хронической венозной недостаточности и больных с длительно незаживающими ранами после гной­но-некротических процессов. Ускорялись сроки появления грануляций и эпителизации, а скорость заживления составила 5,66 ± 1,0 %/суток при тро­фических язвах и 4,71 ± 0,1 %/суток при длительно незаживающих ранах.

Картина, полученная при морфологическом исследовании мазков-отпечатков из трофических язв после применения IL-1?, аналогична тако­вой, полученной для смешанной группы (табл. 2). При первом исследовании на мазках-отпечатках наблюдали низкое количество клеток, сохран­ность лейкоцитов была невысокой. В поле зрения преобладали нейтрофильные лейкоциты, доли лимфоцитов, макрофагов и особенно клеток со­единительной ткани были малы. Эпителиальные клетки практически отсутствовали. Микрофлора располагалась внеклеточно вокруг разрушенных лейкоцитов. После применения IL-1? на 3-4-е сутки количество клеток значительно возрастало и к 7-8-м суткам вновь снижалось, а сохранность лейкоцитов достоверно увеличилась на 7-8-е сутки. Начиная с 3-4-х суток, и на всех сроках наблюдения доля нейтрофилов достоверно сни­жалась. Повышалось количество лимфоцитов на 3-4-е и, главным образом, на 7-8-е сутки. Доля макрофагов была повышена с 3-4-х суток и на всех сроках исследования. Начиная с 3-4-х суток, доля фибробластов начинала постепенно возрас­тать и с 7-8-х суток значительно увеличивалась. На мазках наблюдали эпителиальные клетки: на 3-4-е сутки — единичные (0—<++>), на 7-8-е сутки — единичные, скопления и в виде пластов (0—<+ ++>), 10-14-е сутки — пласты эпители­альных клеток на мазках-отпечатках (0—<+++>). Микрофлора на 3-4-е сутки располагалась вне- и внутриклеточно, наблюдали картины фагоцито­за. На 7-8-е сутки микрофлора в большинстве случаев не отмечалась или находилась внутрик- леточно, а на 10-14-й день микрофлора в ране не обнаруживалась.

При цитологическом исследовании мазков-отпе­чатков из длительно незаживающих ран на 3-4-е и 7-8-е сутки применения IL-1? были отмечены результаты, сходные с предыдущей группой, но изменения в данной группе были менее выра­женными (табл. 2). К 10-14-м суткам количество лейкоцитов составило 27,00 ± 16,8 клеток в поле зрения, а их сохранность была равна 77,00 ± 4,93 %. Доли нейтрофилов и лимфоцитов значительно не изменились (86,8 ± 3,44 и 3,67 ± 0,17 %, соответ­ственно), а доли макрофагов и фибробластов по­степенно уменьшились (4,33 ± 1,45 и 5,17 ± 3,77 %, соответственно).

Беталейкин при ранах и трофических язвах

2.2. Изучение ранозаживляющего действия мази с 50 нг/мл 1Ь-1$ у больных с сахарным диа­бетом I и II типов

На фоне применения 1Ъ-1Р у больных диабетом с длительно незаживающими ранами грануляцион­ная ткань начала развиваться в среднем на сутки раньше, чем в контрольной группе, а эпителизация появилась в среднем на 3,67 сутки лечения (в конт­роле, в среднем, на 4,5 сутки). Скорость заживления раны была при этом в полтора раза выше, чем в контрольной группе. При лечении трофических язв также отмечалась активация вялотекущих процессов. В среднем на четвертые сутки (в конт­рольной группе, в среднем, на 4,5 сутки) от начала

применения препарата отмечалась активизация роста грануляционной ткани, а эпителизация появилась в среднем на 4,2 сутки (в контрольной группе, в среднем, на 4,7 сутки). Скорость зажив­ления ран у этих пациентов в 1,8 раза превышала контрольные значения.

Цитологическая картина на мазках-отпечатках у больных диабетом до лечения характеризовалась небольшим количеством клеток на поверхности раны и низким показателем их жизнеспособности (табл. 3). В ране преобладали нейтрофилы, в то время как число лимфоцитов и макрофагов было невелико. На мазках-отпечатках располагались единичные фибробласты и, реже, клетки эпителия.

Таблица 2 Цитологическое исследование мазков-отпечатков из трофических язв на фоне венозной недостаточности и длительно незаживающих ран после гнойно-некротических процессов

 

Примечание. Группа I — трофические язвы на фоне венозной недостаточности, группа II — вялогранулирующие раны после гнойно-некротических процессов. Различия с контрольной группой достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, ++ — р < 0,01, +++ — р < 0,005.

Таблица 3 Цитологическое исследование мазков-отпечатков хронических ран на фоне диабета I и II типов

 

Примечание. Различия с контрольной группой достоверны: ** — р < 0,01, *** — р < 0,005; различия с днем «0» достоверны: + — р < 0,05, +++ — р < 0,005. Количество исследований: !1_-1р — п = 12, контроль — п = 6.

На 3-4-е сутки общее количество клеток и их жиз­неспособность значительно увеличились по сравне­нию с исходными значениями. Число нейтрофилов уменьшилось, тогда как количество макрофагов и фибробластов возросло по сравнению с данными до начала лечения и контрольной группой. На 7-8-е сутки количество клеток на отпечатках вновь сни­зилось. Сохранность клеток, а также клеточный состав на поверхности ран остался примерно на том же уровне. На 10-14-е сутки количество клеток составило 15,30 ± 5,57 клеток в поле зрения, а их сохранность (75,10 ± 6,20 %) превышала исходные значения (p<0,05). Количество нейтрофилов в ране вновь немного увеличилось (86,10 ± 3,96 %), а процент лимфоцитов (3,00 ± 1,02 %) вернулся к данным, полученным до лечения. Относительное количество макрофагов и фибробластов оставалось высоким (6,25 ± 2,36 и 6,33 ± 2,50 %, соответствен­но), при этом доля фибробластов достоверно пре­вышала исходные значения (p<0,05). На мазках- отпечатках наблюдали эпителиальные клетки и их скопления (0—<++>). В целом, при применении мази с IL-1 ? в группе больных диабетом цитологи­ческие показатели также демонстрировали общую положительную динамику, которая, однако, была не столь выраженной, как в смешанной группе.

3. Изучение влияния применения мази с IL-1? на функции нейтрофилов

До начала лечения был проведен сравнительный анализ функциональной активности нейтрофилов, полученных от больных с ранами разной этио­логии. Так, показатели спонтанного НСТ-теста были значительно выше у тех больных, которые не страдали диабетом (29,50 ± 4,0 %) по сравне­нию с больными диабетом (12,40 ± 2,30 %, p<0,05); это было верно и для значений индуцированного НСТ-теста (61,20 ± 5,18 % и 42,60 ± 6,49 %, соответ­ственно, p<0,005). Таким же образом различались индексы стимуляции у данных категорий больных (2,71 ± 0,40 и 5,02 ± 1,48, соответственно, р=0,05). Показатели фагоцитоза, тем не менее, сущест­венно не различались у больных без диабета и у пациентов, страдавших диабетом. Фагоцитарная активность составила 48,70 ± 3,60 и 49,10 ± 4,08 %, а фагоцитарное число равнялось 2,31 ± 0,11 и 2,24 ± 0,23, соответственно (p>0,05).

На 3-4-е и на 7-8-е сутки применения мази с IL-1? в смешанной группе отмечали увеличение показателей спонтанной продукции супероксидных радикалов по сравнению с исходными значениями и контрольной группой (рис. 1а), б). Эти значения были также высокими на 10-14-е сутки по срав­нению с исходными значениями, когда началось увеличение показателей в группе контроля. На­блюдалась также тенденция к повышению индуцированного НСТ-теста, но различия не достигали статистической достоверности. Соответственно изменялись индексы стимуляции, которые снижа­лись на 7-8-е сутки применения IL-1P. Особенно выраженным являлось усиление фагоцитарной функции нейтрофилов. Начиная с 3-4-х суток, зна­чительно возрастали как показатели фагоцитарной активности, так и фагоцитарное число по сравнению с исходными значениями и контрольной группой (рис. 2а), б). К 10-14-м суткам фагоцитарное число немного снижалось, при этом все показатели по- прежнему превышали исходные значения.

Клинические исследования показали, что при­менение мазей, содержащих IL-1P в различных концентрациях, вызывает улучшение заживления хронических ран, выраженное в той или иной сте­пени в зависимости от концентрации цитокина [1]. При использовании оптимальной концентрации IL-1 в 50 нг/мл, с одной стороны, получены высокие показатели заживления раны, а с другой, отмечен невысокий процент случаев роста гипергрануля­ций. Данная мазь оказывала наиболее благопри­ятный эффект на эпителизацию ран. Полученные клинические результаты подтверждаются экспе­риментальными данными о том, что применение мази, содержавшей IL-1P именно в концентрации 50 нг/мл, оказывало выраженное ранозаживляю- щее действие in vivo, повышая плотность грануля­ционной ткани и усиливая эпителизацию кожных ран [12].

При оценке течения раневого процесса большое значение придают цитологическому анализу. На­блюдаемая нами до начала применения мази с IL-1P цитологическая картина типична для длительно незаживающих ран и свидетельствует об угнете­нии регенеративных и репаративных процессов в ранах. Согласно полученным данным, применение мазевой формы IL-1P приводит к увеличению ко­личества функционально активных лейкоцитов на раневой поверхности, что свидетельствует о появлении защитной неспецифической клеточной активности. Рост числа лимфоцитов и макрофагов в раневом отделяемом на фоне местных аппликаций IL-1P указывает на позитивные сдвиги в репара- тивном процессе. Макрофаги играют важную роль при заживлении ран за счет высокой фагоцитарной активности и продукции цитокинов. У экспери­ментальных животных, лишенных макрофагов, скорость заживления ран значительно снижена [4]. Лимфоциты продуцируют IL-2 и IFNy, которые регулируют продукцию макрофагами ростовых факторов для фибробластов, а также продуцируют TGFP, который стимулирует синтез коллагена. При трофических язвах на фоне венозной недостаточ­ности и при диабете у человека снижено количест­во Т-лимфоцитов в раневом очаге и наблюдаются дефекты функциональной активации раневых макрофагов [5].

 

Рис. 1. Продукция супероксидных радикалов нейтрофилами (НСТ-тест) при применении 11_-1р

Примечание к рис. 1 и 2. Сроки исследований: 1 — до лечения, 2 — 3-4-е сутки, 3 — 7-8-е сутки, 4 — 10-14-е сутки лечения. Группы больных: 11_-1р — п = 20, контроль — п = 17. Различия достоверны: * — р < 0,05, ** — р < 0,01 с контролем, + — р < 0,05, ++ — р < 0,01 с исходными значениями.

 

Рис. 2. Изменения показателей фагоцитарной функции нейтрофилов при применении 11_-1р

До начала лечения клетки соединительной ткани и эпителия на мазках-отпечатках из ран практически отсутствовали или наблюдались в незначительных количествах. Эти цитологические показатели отражают клиническую картину за­медленного роста грануляционной ткани и резкого снижения эпителизации ран. По литературным данным, в трофических язвах наблюдают нару­шения функций фибробластов [5]. При экспери­ментально индуцированном диабете наблюдается тяжелый дефицит эпителизации, связанный с нарушениями продукции фактора роста кера- тиноцитов [14]. На фоне применения 1Ъ-1Р было выявлено увеличение количества фибробластов и клеток эпителия, ускорение сроков начала роста грануляционной ткани и эпителизации. 1Ь-1Р, по- видимому, также активизировал формирование миофибрилл, что ускоряло уменьшение размеров раны за счет контракции. Известно, что обе формы IL-1 — IL-ip и IL-1a — повышают рост фибро­бластов и синтез ими компонентов внеклеточного матрикса [10]. IL-1a может стимулировать эпителизацию ран in vivo [9]. В экспериментах in vivo применение человеческого рекомбинантного IL-1P повышало прочность раневого рубца у облученных мышей [13].Особую важность, с нашей точки зрения, пред­ставляют данные, подтверждающие эффектив­ность применения мази с IL-1P у больных сахарным диабетом I и II типов. Известно, что адекватная воспалительно-регенеративная реакция при са­харном диабете, даже компенсированном, из-за выраженных нейротрофических и сосудистых рас­стройств нарушается. Результаты исследования свидетельствуют о том, что механизмы действия IL-1P у больных сахарным диабетом аналогичны тем, что были описаны для смешанной группы. Однако переход к регенеративной фазе происхо­дил более медленно, чем в смешанной группе, что подтверждалось результатами цитологического исследования.

При сравнительном изучении эффектов приме­нения IL-1? оказалось, что наибольшие изменения в раневом процессе происходили при трофических язвах на фоне венозной недостаточности. Данные цитограмм подтверждали клинические резуль­таты, что наибольшей была скорость заживления язв, обусловленных венозной недостаточностью. Это свидетельствует о том, что именно наличие нейропатии в сочетании с ангиопатией значитель­но ухудшает течение регенераторных процессов.

Для углубленного изучения возможных меха­низмов местного действия IL-1? было проведено исследование функциональной активности ра­невых нейтрофилов. Нейтрофилы обеспечивают очищение раны от микробов и продуктов клеточ­ного распада. При хронических незаживающих ранах у человека преобладают деструктивные формы лейкоцитов, фагоцитарная активность нейтрофилов резко понижена, фагоцитоз приоб­ретает характер незавершенного и заканчива­ется гибелью лейкоцита. Литературные данные свидетельствуют об ослаблении бактерицидной функции, фагоцитоза и хемотаксиса нейтрофи- лов при диабете [6]. По нашим данным, у больных диабетом наблюдалось снижение бактерицидности нейтрофилов, которое было более выраженным, чем ослабление поглотительной способности этих клеток. Усиление процессов фагоцитоза после при­менения IL-1? приводило к ускорению очищения раны от некротических тканей и микроорганизмов, и в дальнейшем предохраняло рану от развития вторичной инфекции. Известно, что IL-1 способен стимулировать функции нейтрофилов. Показано,

что инкубация нейтрофилов человека с IL-1 уси­ливает способность лейкоцитов отвечать на другие стимулы, повышая продукцию супероксидных радикалов [15]. Предобработка нейтрофилов с по­мощью рекомбинантных человеческих IL-1? или IL-1a вызывает усиление фагоцитоза [8].

При длительно незаживающих ранах различ­ного генеза у человека наблюдают присутствие провоспалительных цитокинов — IL-1 a и ?, TNFa, IL-6 и хемокинов в раневой жидкости [11]. В то же время, в хронических ранах присутствуют в значительных концентрациях их антагонисты, такие как IL-1Ra и IL-10, и, в конечном итоге, не происходит заживления ран. Очевидно, для успешного заживления хронических ран важен именно баланс между позитивными и негатив­ными стимулами в раневом очаге. По-видимому, именно внесение экзогенного IL-1? в физиоло­гической концентрации, который действует как иммуномодулятор, дает толчок к заживлению хронической раны.

Доклинические и клинические испытания ряда ростовых факторов и цитокинов для лечения ран, вызванных ишемией и на фоне диабета, продемонс­трировали их эффективность. Однако, эффекты от­дельных факторов, применяемых индивидуально, могут быть недостаточными для полноценного за­живления ран, поскольку они оказывают действие только на определенные типы клеток: нейтрофилы, клетки соединительной ткани или эпителия. Как следует из полученных данных, IL-1? повышал как репаративные процессы в ранах, так и функции фагоцитов, что способствовало успешному зажив­лению ран. Поэтому использование IL-1?, цитокина с широким спектром биологического действия, с нашей точки зрения, является перспективным направлением для лечения хронических ран раз­личного генеза у человека.

ЛИТЕРАТУРА

Бубнов А.Н., Симбирцев А.С., Лебедева Т.П. и др. Первый опыт применения интерлейкиновой мази // Сб. трудов науч. конф. СПб МАПО «Хирургическая анатомия, техника и патофизиология». — СПб.: МАПО, 1995. —С. 109-111.

Методические рекомендации по экспериментальному изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран. — М., 1989.

GreLLner W. Time-dependent immunohistochemical detection of proinflamma­tory cytokines (IL-1beta, IL-б, TNF-alpha) in human skin wounds // Forensic Sci. Int. — 2002. — Vol. 130, № 2-3. — P. 90-96.

Leibovich S.J., Ross R. The role of macrophage in wound repair. A study with hydrocortisone and antimacrophage serum // Am. J. Pathol. — 1975. — Vol. 78, № 1. — P. 71-100.

Loots M.A., Lamme E.N., Zeegelaar J. et al. Difference in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds // J. Invest. Dermatol. - 1998. - Vol. 111, № 5. - P. 850-857.

Nolan C.M., Beaty H.N., Bagdade J.D. Further characterization of the impaired bactericidal function of granulocytes in patients with poorly controlled diabetes // Diabetes. - 1978. - Vol. 27, № 9. - 889-894.

Ochs H.D., Igo R.P. The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic granulomatous disease and female carriers // J. Pediatr. — 1973. — Vol. 83, № 1. — P. 77-82.

Ogle J.D., Noel J.G., Balasurbramaniam A. et al. Comparison of abilities of recom­binant IL-1a and P and noninflammatory IL-1P fragment 163-171 to upregulate

C3b receptor (CRI) on human neutrophils to enhance their phagocytic capacity // Inflammation. — 1990. — Vol. 14, № 2. — P. 182-194.

Sauder D.N., Kilian P.L., McLane J.A. et al. Interleukin-1 enhances epidermal wound healing // Lymphokine Res. — 1990. — Vol. 9, № 4. — P. 465-473.

Thornton S.C., Por S.B., Walsh B.J. et al. Interaction of immune and connective tissue cells: the effects of lymphokines and monokines on fibroblast growth // J. Leukoc. Biol. — 1990. — Vol. 47, № 4. — P. 312-320.

Trengove N.J., Bielefeldt-Ohmann H., Stacey M.C. Mitogenic activity and cytokine levels in non-healing and healing chronic ulcers // Wound Rep. Re­gen. — 2000. — Vol. 8, № 1. — P. 13-25.

Variouchina E.A., Antsiferova M.A., Aleksandrov G.V. et al. Topical application of interleukin-1p accelerates wound healing in hydrocortisone-treated mice // Russ. J. Immunol. — 2003. — Vol. 8. — P. 155-164.

Vegesna V., McBride W.H., Taylor J.M. at al. The effect of interleukin-1p or trans­forming growth factor-p on radiation-impaired murine skin wound healing // J. Surg. Res. — 1995. — Vol. 59, № 6. — P. 699-704.

Werner S., Breeden M., Hubner G. et al. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically dia­betic mouse // J. Invest. Dermatol. — 1994. — Vol. 103, № 4. — P. 469-473.

Yagisawa M., Yuo A., Kitagawa S. et al. Stimulation and priming of human neutrophils by interleukin-1a and interleukin-1p: complete inhibition by IL-1 receptor antagonist and no interaction with others cytokines // Exp. Hema- tol. — 1995. — Vol. 23, № 7. — P. 603-608.

Wound healing and local immunostimulatory activity of recombinant human IL-ip in patients with non-healing wounds and trophic leg ulcers

E.A. Variouchina1, V.V. Moskalenko2, A.S. Simbirtsev1, T.P. Lebedeva2, A.N. Bubnov2 1 State Research Institute of Highly Pure Biopreparations;

2 Medical Academy of Postgraduate Education, St. Petersburg

The aim of the study was to investigate the therapeutic effects of recombinant human IL-ip local ap­plication in patients with chronic wounds. IL-ip was used in the doses of 0.05 — 5000 ng/ml to treat non-healing wounds and trophic ulcers in patients with venous diseases or diabetes. Clinical assessment, wound areas measurements, cytological analysis and wound neutrophil functions (NBT-test and phagocy­tosis) study were performed before and several times during the treatment period. Treatment with IL-ip resulted in clinical improvement of wound healing in all groups of patients. Based on clinical results, the optimal concentration of IL-ip — 50 ng/ml - was chosen. IL-ip application caused a significant increase in number of wound leukocytes and epithelial cells as well as percent of macrophages and fibroblasts. IL-ip treatment stimulated spontaneous superoxide production and phagocytosis of wound neutrophils. Mechanisms of action of the preparation were the same in different groups of patients. Thus, IL-ip caused significant stimulation of wound reparation processes as well as activation of wound phagocyte functions which provides acceleration of wound healing, quicker clearance of wound areas and protects them from secondary infections. Local application of IL-ip can be a perspective way for treatment of chronic wounds in patients. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 2. P. 54-62.)

Key words: interleukin 1, non-healing wounds, neutrophils.