НАДФН-оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция А.Н. Маянский
НАДФН-оксидаза нейтрофилов играет важную роль в фагоцитарных реакциях, защищая организм от патогенов и являясь одним из факторов, запускающих воспалительный ответ. Продукция супероксидного аниона и его производных совершается путем немитохондриальной активации многокомпонентного белкового комплекса, способного окислять восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФН) и передислоцировать электроны с НАДФН на молекулярный кислород. Этот процесс (респираторный взрыв) регулируется многими рецепторными и нерецепторными реакциями, которые завершаются конформационными изменениями компонентнов НАДФН-оксидазы и их готовностью вступать во взаимодействие друг с другом. Оксидантные реакции зависят от стимула и могут подвергаться деактивации или праймированию, т. е. негативному и позитивному кондиционированию. В обзоре обсуждаются ключевые элементы нейтрофильной НАДФН-оксидазы и механизмы ее регуляции.
(Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 3. С. 3–13.)А.Н. Маянский
Нижегородская медицинская академия Поглощение кислорода (респираторный взрыв) при нейтрофильном фагоцитозе отмечено в 1930-х гг., но его функциональный смысл был осознан лишь спустя два десятилетия. Оказалось, что, утилизируя кислород, фагоциты решают чисто эффекторные задачи, нарабатывая комплекс молекул, атакующих объекты фагоцитоза и внеклеточные субстраты. Реакции сводятся к частичному восстановлению кислорода с образованием супероксидного аниона и его оксидантных производных, которые разряжаются на внутри- и внеклеточных мишенях, вызывая их гибель или повреждение [2].Кроме явной (внешне заметной) стимуляции, нейтрофилы, как и другие клетки, подвергаются латентному раздражению, меняющему их чувствительность к вторичным стимулам [3]. Скрытая переадаптация проявляется в двух вариантах — ослаблении (деактивации) и усилении (праймировании) реакций. Элементы деактивации, которые неоднократно воспроизводились в опытах с глюкокортикоидами и нестероидными препаратами, используются как противовоспалительная терапия. Праймирование наблюдается при контакте нейтрофилов с цитокинами, бактериальными липополисахаридами и пр., при местном и системном воспалении — ожоговой болезни, остром респираторном дистресс-синдроме, сепсисе и др. [4]. Повышая эффекторный потенциал клеток, праймирование создает фон для поиска новых фагоцитарных стимуляторов.НАДФН-оксидаза
Оксидаза профессиональных фагоцитов принадлежит к группе немитохондриальных энзимов, катализирующих образование супероксида (О2–) в реакции одноэлектронного восстановления кислорода:
2О2 + НАДФН ? 2О2– + НАДФ+ + Н+О2– служит стартовым материалом для окисленных форм галогенов, свободных радикалов, перекиси водорода [1]. Являясь важными антимикробными метаболитами, оксиданты выполняют побочные функции, повреждая ткани, окружающие место реакции [2].
Ферменты, подобные, но менее активные, чем нейтрофильная НАДФН-оксидаза, присутствуют во многих тканях. Они получили название Nох (от англ. NADPH oxidase), являясь источником регуляторных молекул, которые отражают кислородное напряжение в клетках [8]. Если учесть, что НАДФН-оксидаза имеется у дрожжей, ее следует рассматривать как элемент эволюционного развития, важный для иммунных реакций многоклеточных организмов. У больных с хронической гранулематозной болезнью генетические дефекты НАДФН-системы сочетаются с опасными для жизни нарушениями противоинфекционного иммунитета [4].
НАДФН-оксидаза нейтрофилов состоит из пяти главных белков, которые при стимуляции собираются в клеточных мембранах, определяя оксидазную активность (рисунок). Три из них(р47phox, p67phox, p40phox; р — от англ. protein, phox — от англ. phagocyte oxidase; цифрами обозначена молекулярная масса в кДа) находятся в цитоплазме поящихся клеток, два (gp91 [gp — от англ. glycoprotein] и р22) — связаны с клеточными мембранами [8, 27, 75, 85].
При активации фосфорилирование р47phox в цитоплазме ведет к перемещению тримерного комплекса р47phox-p67phox-p40phox в плазматическую мембрану и фиксации p47phox и p67phox на флавоцитохроме b558 (gp91phox и p22phox). gp91phox содержит сайты, связывающие НАДФН, ФАД и гемы. При активации Rac2 высвобождается из комплекса с ингибитором (GDI) в виде ГТФ-формы. Rac2-ГТФ транслоцируется в мембрану, внедряясь в gp91phox и мембранные фосфолипиды. На первом этапе независимое взаимодействие Rac2 с флавоцитохромом b558 продуцирует поток электронов от НАДФН к ФАД. На втором этапе Rac2 взаимодействует с p67phox, обеспечивая переход электронов от ФАД на молекулярный О2 с образованием супероксиданиона (О2–).Сборка НАДФН-оксидазы требует дополнительных факторов. Они участвуют не только в респираторном взрыве, но и в других клеточных реакциях (поглощении, секреторной дегрануляции, хемотаксисе и др.). Для нейтрофилов главным является Rac2 — один из представителей малых G-белков подсемейства Rho гуанозинтрифосфатаз [30, 32, 98]. Его активность определяется регуляторами (см. ниже), которые действуют достаточно специфично, определяя возможность избирательного подавления или усиления Rac-2-зависимых реакций. В опытах на нокаутных rac2–/– мышах показано подавление респираторного взрыва при стимуляции нейтрофилов пептидом fMLP (от англ. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanin), IgG-опсонизиро- ванными эритроцитами и форболовыми эфирами; действие ростовых факторов и опсонизированного зимозана оставалось без изменений [32].Флавоцитохром b5581. Это главный компонент НАДФН-оксидазы. Он представляет прочный мембраносвязанный димер, состоящий из gр91phox (?-субъединица) и p22phox (?-субъединица) [85]. gp91phox содержит НАДФН-связывающий участок, а также сайты для фиксации флавинадениндинуклеотида (ФАД) и двух функционально различных гемов [8, 27]. Один из гемов сопряжен с gp91phox, другой соединяет gp91phox и р22phox. При активации нейтрофилов ФАД и гемовые группы обеспечивают переход электронов от НАДФН к кислороду с образованием супероксидного аниона (см. рис.). Процесс можно подавить при удалении ФАД или, напротив, восстановить при его возращении [9]. То же самое происходит под влиянием антагонистов флавина, например, дифенилениодония [79]. Это говорит о том, что в молекуле оксидазы флавин является носителем электронов [8]. С гемами не все так просто. Они необходимы для транслокации электронов между ФАД и кислородом, но не ингибируются стандартными антагонистами гемоглобина, такими как CN –, N3–, СО, изонитрилбутил [8].
В покоящихся нейтрофилах 10–15 % флавоцитохрома b558 находится в плазматической мембране, 85–90 % связаны с мембранами специфических и секреторных гранул [85]. При стимуляции клеточные мембраны сливаются вместе, что ведет к транслокации флавоцитохрома b558 в плазматическую мембрану. Основная роль в переносе электронов принадлежит gp91phox. Для этого g-91phox должен подвергнуться конформационным изменениям. Они совершаются при слиянии димера gp91phox-p22phox с цитозольными компонентами оксидазы, главным образом p47phox и p67phox. Но в этом участвует и р22phox, который связан своим цитоплазматическим концом с р47phox и p67phox [53, 58]. Известны случаи хронической гранулематозной болезни, которые проявляются при дефектах р22phox [28].
Комплекс p47phox-p67phox-p40phox. Остальные компоненты НАДФН-оксидазы находятся в цитоплазме, переходя в мембрану при стимуляции клеток. Первым был замечен гетеротример р47phoxp67phox-p40phox. Он состоит из эквимолярных концентраций р47phox, p67phox и p40phox [75] (см. рис.). р47phox существует и в свободной форме, самостоятельно перемещаясь в состав мембран. Его конформация меняется в стимулированных клетках, что коррелирует c кинетикой респираторного взрыва [75]. Перед стыковой с флавоцитохромом b558 сериновые остатки р47phox подвергаются активационному фосфорилированию [8, 75, 85]. Процесс затрагивает лишь часть молекул р47phox, и только они включаются в НАДФН-оксидазу [81]. Фосфорилирование раскрывает домены, необходимые для взаимодействия с p22phox, мембранными фосфолипидами, а также с другими элементами цитозольного комплекса (p67phox и p40phox)2
В активации (фосфорилировании) p47phox участвуют различные системы клеточных киназ — протеинкиназы С (РКС), митоген-активированные протеинкиназы (МАРК) (р38, р42/47 [ERK 1/2]), р21-активированная киназа (PAK), Akt (протеинкиназа В), казеин-киназа, киназа, активируемая фосфатидиловой кислотой [75]. В зависимости от стимула они вступают в контакт друг с другом и с другими факторами клеточного гомеостаза, например с Са2+-зависимыми каналами [50] и с фосфатидилинозитолами (продукт фосфатидилинозитол-3-киназ [PI-3K]) [99]. Главная роль отводится РКС. В нейтрофилах присутствуют четыре изоформы РКС — ?, ?, ? и ?, и все они в той или иной мере включаются в фосфорилирование р47phox [40].
Точная роль р47phox остается неясной. Известны бесклеточные системы, где активация оксидазы происходит без участия р47phox, но требует его присутствия для получения максимального эффекта [62]. Можно думать о формообразующей (шаперон-подобной) функции р47phox. В собранной оксидазе gp91phox-связывающий эффект р47phox в 100 раз превышает активность других цитозольных белков [8].Белок р67phox находится в тесном контакте с р47phox. При активации он мигрирует вместе или вслед за ним к клеточным мембранам, где вступает во взаимодействие с gp91phox [27, 35, 75, 85]. Активация (она затрагивает лишь 5 % р67phox [8]) зависит от умеренного фосфорилирования, которое происходит по РКС-зависимым и РКС-независимым каналам [25, 34]. Фосфорилирование обнажает ряд функциональных сайтов р67phox, которые используются для связывания р40phox и Rac2, а также для дополнительной фиксации НАДФН [59]. Высказано предположение о функциональных контактах р47phox-р67phox с цитоскелетом нейтрофила и об их значении для стабилизации НАДФН-оксидазы [73, 89, 90]. Это особенно важно для корпускулярных объектов, возбуждающих фагоцитоз. Так, цитохалазин В, разрывающий микрофиламенты и препятствующий поглощению опсонизированного зимозана, блокирует респираторный взрыв нейтрофилов [54]. Иначе обстоит дело с гуморальными стимулами: цитохалазин В вызывает 10-кратное усиление О2–-продукции fMLP-активированными нейтрофилами [27]. В бесклеточных системах цитохалазин не оказывает никакого эффекта, подчеркивая глубокие различия таких систем с цельными клетками [90].
Еще менее понятны функции р40phox. Известно, что он присутствует только в гемопоэтических клетках [102]. Подобно р47phox, p40phox имеет фрагмент, связывающий молекулы фосфатидилинозитолов, а также содержит богатый пролином С-концевой участок, который соединяется с р67phox [75]. При активации p40phox подвергается фосфорилированию по тирозину-154 и серину-315 [13]. Есть работы, показывающие, что в бесклеточных системах p40phox не только не стимулирует НАДФН-оксидазу, но даже угнетает ее активность [84]. Впрочем, другие авторы примерно в таких же условиях наблюдали потенцирующий эффект комплекса р40phoxр67phox в оксидазных реакциях [19, 61].
Гуанозинтрифосфатазы. Сравнительно недавно обнаружено участие одного из низкомолекулярных гуанозин-связывающих белков (Rac2) в респираторном взрыве нейтрофилов (см. рис.). Он имеет молекуляную массу 21 кДа и относится к подсемейству Rho-мономерных гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз) [30]. Такие ферменты функционируют в не совсем понятной сети, регулируя множество клеточных функций — организацию и реорганизацию цитоскелета, транскрипцию, клеточный рост, пролиферацию и, наконец, образование реактивных оксидантов. Известно около 30 клеточных белков, которые служат мишенью для Rac-ГТФаз [32]. Из трех Rac-изоформ нейтрофилы (как и другие гемопоэтические клетки) содержат в основном Rac2 [30]. Именно о нем пойдет речь в связи с продукцией О2–.
В покоящихся клетках Rac-ГТФаза находится в цитоплазме в виде неактивного комплекса с гуанозиндифосфатом (ГДФ). Комплекс поддерживается другим белком, GDI (англ. GDI — ингибитор диссоциации гуанозиннуклеотида) [14, 30, 32]. При активации наблюдаются по меньшей мере три события, которые необходимы для подключения Rac к оксидазным реакциям (см. рис.). Во-первых, под влиянием активированных киназ совершается растормаживание факторов GEF (англ. GEF — фактор обмена нуклеотидами), снимающих GDI-блокаду с Rac. GEF осуществляют ГДФ ? ГТФ обмен в Racмолекуле, меняя ее конформационную cтруктуру; это напоминает действие киназ, использующих АТФ для активационного фосфорилирования белков. Во-вторых, Rac-ГТФ независимо от цитозольных компонентов (р47phox-p67phox-p40phox) мигрирует в клеточные мембраны, к месту локализации флавоцитохрома b558. Наконец, Rac-ГТФ связывается с р67phox и gp91phox, включаясь в формирование НАДФН-оксидазы. В опытах на rac2-нокаутных мышах показано, что зависимость от Rac2 не абсолютна, отражая природу стимула [56]. Респираторный взрыв был резко снижен в реакциях с IgG-опсонизированными эритроцитами и форболмиристатацетатом (ФМА), почти отсутствовал в опытах с fMLP, но оставался нормальным при стимуляции опсонизированным зимозаном [56]. Это говорит о том, что регуляторное действие Rac-ГТФ осуществляется разными, возможно, многими путями. Позитивный эффект Rac связан с появлением р21-активированной киназы (или киназ), которая включается в фосфорилирование р47phox [30, 32].
Система Rac2-GEF участвует в регуляции оксидазных реакций нейтрофилов, адгезированных на белках экстрацеллюлярного матрикса. Установлено, что респираторный ответ нейтрофилов в лунках, покрытых фибронектином, фибриногеном и ламинином, значительно задержан [72, 101]. Например, при стимуляции fMLP и С5а вместо немедленного ответа (он наблюдается со взвешенными клетками) образование О2– происходит спустя 30–90 мин [101]. В реакциях (они не зависят от секреторной дегрануляции и синтеза белка) участвуют ?-интегрины, которые передают активаци- онные сигналы на другие рецепторы. Полагают, что это действует как защитный механизм против быстрого и опасного возбуждения нейтрофилов в зоне воспаления. Степень блокирующей реакции зависит от торможения Rac2, что, скорее всего, связано с фосфорилированием Vav1, одного из GEF-факторов, который регулирует баланс между ГДФ и ГТФ в молекулах Rac2 [101].
Негативное влияние на Rac-эффекты оказывают GAP-белки (англ. GAP — белок, активирующий ГТФазную активность). В человеческом геноме закодировано около 70 белков, функционирующих как GAP [12]. Нейтрофилы содержат в основном три GAP — p190RhoGAP, Bcr и RacGAP. Регулируя Rac-ГТФ, они воздействуют на фагоцитарные реакции, тормозя респираторный взрыв, реорганизацию цитоскелета, секреторную дегрануляцию и пр. [77]. В бесклеточных системах блокада GAP фторидом натрия увеличивает продукцию О2– [100]. GAP снижают образование О2– в нейтрофилах, активируемых даже в присутствии ГТФ [43], но не влияют на активность готового оксидазного комплекса [43]. Это заставляет предположить, что для стимуляции необходимо непрерывное образование и разрушение Rac-ГТФ [27].
Возможно и то, что в НАДФН-оксидазе Rac-ГТФ занимает позицию, недоступную для GAP. Негативное воздействие на оксидазу оказывает и другой G-белок, Cdc42. Это «родственник» Rac, имеющий около 70 % гомологии с Rac1/2 [85]. Есть данные, что Cdc42 — антагонист, конкурирующий с Rac за связывание с флавоцитохромом b558 и p67phox [31].
Еще одним компонентом, входящим в состав НАДФН-оксидазы, является Rap1A. Это протеин из Ras-суперсемейства ГТФ-связывающих белков, о котором известно очень мало. Возможно, он также тормозит оксидазную активность нейтрофила [42].
Транскрипционная регуляция
Еще недавно на зрелый нейтрофил смотрели как на конечную клетку, мало способную к синтезу белков [2]. Но все оказалось сложнее: нейтрофил не только использует готовый эффекторный заряд, но и может продолжать его наработку его по ходу реакции [69]. Это связано с регуляцией генов, которые находятся здесь под глубоким контролем. Многие из них находятся в тени дифференцировочных процессов, протекающих при созревании миелоцитарных клеток. Они функционируют лишь в экстремальных условиях, под воздействием цитокинов и воспалительных медиаторов [69]. Это, прежде всего, касается генов двух главных компонентов НАДФН-оксидазы — gp91phox и р67phoх, в позитивном и негативном кондиционировании которых участвуют 4не менее 15 регуляторов [75]. Будущее покажет, в какой степени генетический потенциал распространяется на фенотипические свойства зрелого нейтрофила, и может ли индуктивная транскрипция отразиться на его способности к респираторному взрыву. Не исключено, что это рудимент, который не имеет значения для профессиональных фагоцитов, а проявляется в деятельности других клеток.
Дефосфорилирование
Существует мнение, что кроме фосфорилирования (позитивное действие киназ) респираторный взрыв зависит от дефосфорилирования белков оксидазного комплекса (негативное действие фосфатаз) [5, 49, 51]. Отсюда подавление фосфатаз должно вызывать усиление оксидазных реакций нейтрофила. Вместе с тем применение фосфатазных ингибиторов дает неоднозначные результаты. Блокада серин/треониновых фосфатаз (окадаиковая кислота, каликулин А) действительно усиливает продукцию О2– в опытах с fMLP, однако ослабляет ее при стимуляции опсонизированным зимозаном или ФМА [27]. При подавлении тирозинфосфатаз (гербимицин А, ванадат) наблюдалось повышение НАДФН-оксидазной активности нейтрофилов (стимуляция fMLP и ФМА) [11, 45, 57]. В работе [44] изучалось влияние N-?-тозилфенилаланилхлорометилкетона (ТФХК) на респираторный взрыв нейтрофилов. ТФХК блокировал фосфорилирование и мембранную транслокацию р47phox, препятствуя сборке НАДФН-оксидазы. Кроме того, ТФХК вызывал разобщение уже активных НАДФН-комплексов. Полагают, что это могло быть связано с активацией фосфатаз.Значение арахидоновой кислоты (АК)АК образуется при стимуляции нескольких изотипов фосфолипазы А2 и служит источником для ряда факторов, которые участвуют в воспалительных реакциях [2]. Уже в первых исследованиях было показано, что добавление АК стимулирует нейтрофильную оксидазу, являясь мощным индуктором О2– [10, 47, 66]. По данным [66], ингибиторы фосфолипазы А2 подавляют образование АК и О2–. Эффект наблюдали только с интактными клетками, но не в бесклеточной системе; ингибиторы циклооксигеназы и липоксигеназы (ферментов, образующих эйкозаноиды — простагландины и лейкотриены) были не эффективны. В работе [67] сравнивали продукцию О2– нейтрофилами, стимулированными ФМА и опсонизированным зимозаном. ФМА вызывал респираторный взрыв, но не обеспечивал продукции АК. Опсонизированный зимозан действовал наоборот: ответ был связан с АК, блокировался ингибиторами фосфолипазы А2 (мепакрином, р-бромфенацил бромидом, BW755С, ацетилсалициловой кислотой, индометацином), но не зависел от протеинкиназы С. Иные результаты получили Dana R. et al. [23]. При стимуляции нейтрофилов ФМА и опсонизированным зимозаном ингибиторы фосфолипазы А2 (бромфенацил бромид, квинакрин) вызывали полное торможение НАДФН-оксидазы и образования АК; добавление АК восстанавливало продукцию супероксида. Миелоидные клетки PLB-985, дефектные по фосфолипазе А2 (за счет обработки антисмысловой мРНК против фосфолипазы А2), не продуцировали О2–, но сохраняли полный набор НАДФН-оксидазных компонентов; добавление АК восстанавливало оксидазную активность [22]. Примерно такая же картина наблюдалась в работе с нейтрофильными цитопластами: ФМА-зависимый респираторный взрыв тормозился ингибиторами фосфолипазы А2, добавление АК снимало эффект [46].
Исходя из того, что вместо АК стимуляцию НАДФН-оксидазы удается получить при добавлении неспецифических детергентов (додецилсульфата натрия [46] или ненасыщенных жирных кислот [10]), можно думать, что эйкозаноиды (они продуцируются на основе АК) не участвуют в респираторном взрыве нейтрофилов. Это подтверждает вышеприведенные данные [67], а также наблюдения Daniels I. et al. [26], которые нашли, что стимулирующий эффект перитонеального диализата на нейтрофильную оксидазу не зависел от простагландинов и лейкотриенов (лейкотриена В4); активирующее действие проявлялось через фосфолипазу А2 и АК.
Действие АК может быть связано с конформационным изменением оксидазы (в частности, с повышением НАДФН-связывания флавоцитохромом b558 [83]) или с регуляцией протонных каналов плазматической мембраны нейтрофила для НАДФН-оксидазы (они образуются gp91phox) [48]. АК способна вызывать транслокацию цитозольных белков [94], усиливать диссоциацию комплекса Rac2-GDI [18], действовать как сигнальный трансдуктор в киназных каскадах [52] или как модулятор внутриклеточного кальция [96]. Несмотря на противоречия [47, 87], можно полагать, что АК усиливает активирующую активность киназ, но в бесклеточных системах АК действует непосредственно (без помощи киназ) на НАДФН-оксидазу и ее компоненты [18, 48, 55, 94].
Есть и иные наблюдения. Roberts P.J. et al. [78] не нашли связи между активностью фосфолипазы А2 и респираторным взрывом нейтрофилов: при стимуляции fMLP, ионофором кальция и ФМА. Мепакрин ингибировал фосфолипазу А2, но не влиял на НАДФН-оксидазу. Впрочем, нейтрофилы, праймированные гранулоцитарномоноцитарным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), вели себя иначе: образование супероксида при стимуляции fMLP зависело от фосфолипазы А2 и подавлялось мепакрином. Еще решительнее высказываются Rubin B.B. et al. [82]. Они не нашли изменений в оксидазной активности при подавлении фосфолипазы А2 специфическим ингибитором (пирролидином-1) и при полной блокаде синтеза АК нейтрофилами (у нокаутных мышей). Bylund J. et al. [16] деактивировали нейтрофилы к fMLP (инкубацией при комнатной температуре), а затем восстанавливали их реактивность цитохалазином В. Респираторный взрыв зависел от клеточных киназ, но не от фосфолипазы А2 и внутриклеточного Са2+. В своем обзоре DeCoursey T.E., Ligetti E. [27] говорят, что благодаря липофильности арахидоновая кислота должна оставаться в мембране. Поэтому трудно представить механизм действия АК на цитозольные компоненты in vivo. Впрочем, и в этом случае АК может влиять через плазматическую мембрану и собранную в ней НАДФН-оксидазу.Что касается других фосфолипаз и их производных, то генерация таких вторичных посредников, как диацилглицерол (фосфолипазой С) и фосфатидиловая кислота (фосфолипазой D), может положительно влиять на киназы и способствовать активационному фосфорилированию оксидазных компонентов [76]. Отдельно стоят фосфатидилинозитолкиназы (PI-3K). При стимуляции они взаимодействуют с мембранными фосфолипидами, продуцируя фосфатидилинозитолы, которые участвуют в широком спектре клеточных реакций, активируя другие киназы, необходимые для респираторного взрыва нейтрофилов [63, 93, 99].
Значение эндогенных регуляторов
Число публикаций, посвященных описанию эндогенных субстанций, способных тормозить НАДФН-оксидазную активность нейтрофилов, гораздо меньше, чем сведений об АК. В организме присутствуют ферменты (редуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы), способные погасить волну оксидазной активности нейтрофилов [1]. Это важно для ограничения действия оксидантов рамками фагоцитарных вакуолей. Существует множество искусственных антиоксидантов, действующих на продукты респираторного взрыва или блокирующих простетические группы оксидазы (НАДФН, флавин, гемы) [1]. Но речь может идти и о проксимальных отделах оксидазного комплекса, т. е. о действии на сигналвоспринимающие рецепторы, транслокацию цитозольных факторов и cборку мембранной оксидазы. Одной из первых была работа Akard L.P. et al. [6]. Авторы обнаружили быстрое подавление респираторного взрыва при добавлении сульфгидрид-модифицирующего агента (N-этилмалеимид) к нейтрофилам, стиму- лированным ФМА, fMLP, опсонизированным зимозаном или арахидоновой кислотой. Мембранная оксидаза оставалась без изменений и могла быть проактивирована повторно после тщательного отмывания от ингибитора, что указывает на наличие цитозольного фактора, который участвует в активации оксидазных компонентов. Здесь заложена концепция о поэтапности клеточных реакций, в частности респираторного взрыва нейтрофилов.
Оксидазный процесс формируется, начиная с клеточных рецепторов; отсюда импульс передается на цитозольные эффекторы и далее возвращается на мембрану, вызывая внешние реакции. Это совершается раздельно, позволяя говорить о ряде последовательных событий [7, 17, 49, 88, 95]. Деактивацию цитозольных компонентов наблюдали под влиянием липидной фракции цитозоля [33] и в присутствии богатого пролином антибактериального пептида PR-39 нейтрофилов [86]. В последнем случае блокада наступала с опозданием (не менее 45 мин после стимуляции ФМА) и была связана с подавлением р47phox.
Деактивация не зависит от недостатка НАДФН и других компонентов нейтрофильной оксидазы. Об этом говорят негативные опыты с их добавлением к деактивированным клеткам, данные об ограниченном использовании мембранных и цитозольных компонентов [15], а также реактивация нейтрофилов после завершения респираторного взрыва [10, 20]. Это доказывает, что прекращение оксидазной реакции подчиняется гомеостазу клеток, экономя силы для их функционирования в очаге воспаления. Следует заметить, что многие работы проводились с клеточными фракциями или с солюбилизированными ферментами. На этом основании трудно говорить о том, что же происходит в действительности. Можно согласиться с DeCoursey T.E., Lige -ti E. [27], которые называют такие исследования «работами о загадочном цитозольном деактиваторе».
Праймирование
Каждая из реакций нейтрофила (как и других клеток) определяется многими факторами. Поэтому решить вопрос, каким образом он отреагирует на тот или иной стимул, — сложная задача. Это касается и такого ответа, как респираторный взрыв, который, как показано выше, реализуется комплексом реакций на цитозольном и мембранном уровнях. Один стимул, прилагаемый извне, не всегда будет единственной причиной ответа. Это подтверждают исследования, демонстрирующие способность зрелого нейтрофила к транксрипционному процессу, раскрывающему эффекторные возможности клетки, в том числе продукцию «самостимулирующих» (провоспалительных) цитокинов [69]. Английское слово «priming» означает «подготовку», «натаскивание», «затравку». Праймирование (мы называем его позитивным кондиционированием) вошло в биологию для обозначения предактивационного воздействия на клетку, которое обеспечивает повышенную чувствительность к гетерологичным стимулам. Это справедливо для всех клеток, в том числе и для зрелого нейтрофила. Праймированный нейтрофил внешне не отличается от покоящегося, но имеет ряд функциональных особенностей, которые готовят его к возбуждению, в том числе к респираторному взрыву. Отвечая более выраженной реакцией, нейтрофил не только выполняет свое физиологическое назначение (оно связано с подготовкой к экстренному выходу из сосудов и уничтожению фагоцитарных объектов), но и включается в патологическое воспаление — развитие септического синдрома, подагры, ревматоидного артрита, уретритов и пр. [2, 4].Большинство факторов, стимулирующих нейтрофил, являются физиологичными. Из искусственных отметим форболовые эфиры. Они имитируют диацилглицерол и напрямую (без рецепторных посредников) активируют мембранную протеинкиназу С [80].
Кондиционирующие эффекты обычно не зависят от синтеза белка. Их компоненты преформированы в зрелых нейтрофилах и готовы включиться в работу по мере необходимости. Тем не менее, в опытах с ?-интерфероном показано значение синтеза белка и мРНК для усиления fMLP-зависимых респираторных реакций нейтрофила [91].
В своем большинстве праймирующие агенты принадлежат к провоспалительным факторам. Они не способны простимулировать оксидазу (по крайней мере, в низких дозировках), но предактивируют респираторные и другие реакции нейтрофилов. Так действуют цитокины, ростовые факторы, хемокины, липидные медиаторы, бактериальные липополисахариды [85]. Чтобы представить механизм их активности, надо помнить о событиях, запускающих респираторный взрыв: он начинается с клеточных рецепторов, продолжается активацией киназ и гуанозинтрифосфатаз, ведет к фосфорилированию оксидазных компонентов, их мембранной передислокации и, наконец, завершается сборкой оксидазы. В ряде работ позитивное кондиционирование сопровождалось активацией рецепторов, связанных с эффекторами нейтрофила через гетеротримерные G-белки. Однако не это определяло праймирующие свойства таких факторов, как TNF?, IFN? и IL-18 [36, 74, 92]. Более того, отмечена обратная тенденция: праймирующий эффект был связан с эндоцитозом, т. е. с сокращением нейтрофильных рецепторов, через которые происходила стимуляция [36]. Прямая активация G-белков (опыты с GM-CSF и TNF?) также возможна. Допускается, что это необходимо для кондиционирования нейтрофила прямыми Rac2-активаторами, например, фторидом натрия [68]. Вместе с тем, коклюшный токсин (он разобщает G-чувствительные рецепторы с G-белками) не оказывал влияния на ЛПС-праймирующий эффект (ЛПС — липополисахаридный эндотокснн грамотрицательных бактерий) [41]. Можно полагать, что праймирование не связано с активацией рецепторов, а решается на пострецепторном пространстве, захватывая факторы, важные для инициации и развития респираторного взрыва.
В целом механизм позитивного кондиционирования менее понятен, чем сам респираторный взрыв. Приходится гадать, чего не хватает нейтрофилу для реакций, ведущих к стимуляции оксидазы. Много работ посвящено фосфорилированию оксидазных компонентов и киназным ферментам, ответственным за данный процесс. Поскольку главным участником фосфорилирования является р47phox, большинство наблюдений посвящено этому белку. Можно было бы предположить, что праймирующий эффект определяется частичным фосфорилированием р47phox, подготавливая его к полной активации [24, 29, 36]. Но степень фосфолирирования р47phox может быть различна — от пороговых [15, 25, 65] до максимальных значений [28]. Таким же реакциям подвергаются и остальные белки респираторного комплекса. Это сочетается либо происходит независимо от активации р47phox [15].
На роль праймирующих киназ претендуют те же ферменты, которые участвуют в активации нейтрофила. Центральными являются изоформы протеинкиназы С, которые запускаются многими факторами в системах PI-3K [93, 99]. В зависимости от природы кондиционирующего агента в реакцию включаются каскады МАРК (р38, р42/47, но не JNK), Akt/РКВ, тирозинкиназы и, возможно, другие ферменты, которые образуют киназную сеть, действующую в активированной клетке [27, 75, 85].
Представить этот комплекс непросто, и даже в современных исследованиях учитывается лишь малая часть происходящих сдвигов. Достаточно сказать, что воздействие на нейтрофил при помощи ЛПС (один из стандартных праймирующих агентов) сопровождается генетической перестройкой более 40 белков, тогда как современные цитологи учитывают менее десятка показателей [64]. В некоторых случаях (например, в системе IL-18-fMLP) праймирование не подавляется ингибиторами PI-3K, протеинкиназы С, р42/47МАРК, но блокируется торможением тирозинкиназ и р38МАРК [36]. Делались попытки найти узловой фактор, ответственный за позитивное кондиционирование. В работе [63] сообщается о торможении праймирования нейтрофилов (для fMLP), связанного с фактором активации тромбоцитов, GM-CSF, TNF?, аналогом субстанции Р. Этого добивались, ингибируя сфингозин-киназу. Авторы считают, что ими найдена «позиция, конвергирующая действие различных нейтрофил-праймирующих агентов». Однако тут же приводятся данные о блокирующем эффекте ингибитора PI-3K. Скорее всего, подобно активации, праймирование зависит от клеточных факторов, действие которых неодинаково проявляется в зависимости от стимула и условий, где они работают.
Плоскости, в которых находятся праймированный и покоящийся нейтрофилы, неодинаковы. Это, в частности, относится к сборке отдельных элементов в единый НАДФН-оксидазный комплекс. В работах [28, 65, 97] показано, что праймирование, вызванное ЛПС, TNF?, GM-CSF и IL-18, сопровождается повышенной экспрессией флавоцитохрома b558. По данным Elbim C. et al. [36], это происходит в результате слияния специфических и секреторных (желатиназных) гранул с плазматической мембраной и может быть одной из причин праймирующего эффекта IL-18 (для fMLP); праймирование (но не респираторный взрыв) удавалось задержать при помощи колхицина — ингибитора секреторной дегрануляции нейтрофила.
Возникает вопрос об идентичности механизмов праймирования и активации клеток. Почти все работы проводились с нейтрофилами, изолированными из крови человека. Трудно судить о влиянии процедуры выделения на функциональный статус клеток, в частности, на их активационные параметры. Поэтому большой интерес представляют исследования, выполненные на цельной крови [15, 36]. Мы только что говорили о том, что в работе [36] с цельной кровью удалось разобщить IL-18-праймирование от fMLP-активации нейтрофилов при помощи колхицина. Более сложную задачу решали Brown G.E. et al. [15]. Для регистрации респираторного взрыва они воспользовались высокой чувствительностью люминол-зависимой хемилюминесценции. Фрагмент этих исследований сводился к следующему. Для праймирования в цельную кровь добавляли TNF?, в том числе в присутствии р38 MAPK-ингибитора (SB203580). Кровь разводили 1:800 и анализировали НАДФН-оксидазную реакцию нейтрофилов при стимуляции fMLP и опсонизированным зимозаном (ОЗ). Оказалось, что праймирование и активация по-разному зависят от р38 МАРК-фосфорилирования. ОЗ вызывал респираторный взрыв независимо от киназной активности р38 МАРК, но она играла ключевую роль в TNF?-праймировании ОЗ-активированных нейтрофилов. Напротив, в опытах с fMLP блокада р38 МАРК одинаково (на 70 %) подавляла респираторный взрыв покоящихся и TNF?-праймированных нейтрофилов. Это говорит о том, что позитивное кондиционирование может происходить без активации нейтрофилов, но (так же, как активация) зависит от факторов, подключение которых решается в конкретных системах праймер-стимулирующий сигнал. Вопрос о степени обособленности праймирующих механизмов требу- ет дополнительного изучения исходя из регуляторных воздействий на клеточную реактивность.
Важным является отношение кальция к праймированию нейтрофила. Многие ферменты, которые участвуют в регуляции респираторного взрыва (например, протеинкиназа С, МАРК, тирозинкиназы и пр.), зависят от цитозольного Са2+ и тормозятся при его отсутствии. Уже в ранних работах было показано, что ЛПС-праймирующий эффект зависит от внутриклеточного кальция и блокируется его хелаторами [41]. Finkel T.N. et al. [39] впервые обнаружили нейтрофил-праймирующую активность кальций-специфического ионофора, иономицина.
По данным [37], иономицин имеет две нейтрофилактивирующих дозировки. Дозировка 2 мкМ вызывает прямую стимуляцию респираторного взрыва клеток, тогда как низкие концентрации (2–200 нM) праймируют оксидазу. Эффект зависел от уровня внутриклеточного кальция и блокировался ингибиторами тирозинкиназ и р38 МАРК (но не другого каскада МАРК – р42/44). Напротив, действие ФМА (прямой активатор протеинкиназы С) не зависело от кальция и тирозинкиназ. Не исключено, что при стимуляции Са2+-ионофорами фосфорилирирование обеспечивается кальмодулином — Са2+-зави симой протеинкиназой, которая активируется потоком Са2+ из внешней и внутренней среды [2]. Впрочем, есть и работы с другими результатами. Naccache P.R. et al. [71] нашли, что активность НАДФН-оксидазы напрямую не связана с уровнем внутриклеточного Са2+; от Са2+ (при действии на нейтрофил fMLP и лейкотриена В4) зависит лишь закисление цитозоля. Согласно [60], внутриклеточный Са2+ лишь частично участвует в р38 МАРК-зави симых эффектах fMLP. Dahlgren C., Follin P. [21] показали, что стимулирующее действие иономицина отличается от аналогичного эффекта fMLP: иономицин активирует НАДФН-оксидазу, связанную с мембраной гранул, а для fMLP мишенью является оксидаза плазматической мембраны. Таким образом, эффекты Са2+ также зависят от факторов и условий, в которых совершаются клеточные реакции.
Ряд авторов сообщают о праймировании нейтрофилов, связанном с арахидоновой кислотой (АК). В концентрации 1 мкМ АК вызывала усиление fMLP-стимулированной продукции О2– нейтрофилами [78]. Подавление образования АК мепакрином блокировало GM-CSF-праймирование, но не влияло на продукцию О2– интактными (непраймированными) клетками [78]. В работе [70] исследовались праймирование (GM-CSF, TNF?) и активация (fMLP, С5а) оксидазы и фосфолипазы А2 нейтрофилов. Реакции удавалось по-разному заблокировать ингибиторами МАРК. Например, SB203580 (ингибитор р38) подавлял образование О2– интактными и праймированными нейтрофилами, но не влиял на активность фосфолипазы А2. PD98059 (инги битор р42/47) не влиял на респираторный взрыв нативных и праймированных нейтрофилов, но подавлял образование АК праймированными нейтрофилами. Это показывает, что генерация АК может быть отделена от праймирования оксидазной активности, или их связывают более сложные механизмы.
Заключение
НАДФН-оксидаза занимает важное место в элиминационных реакциях нейтрофилов. Ее эффекты могут выходить за рамки компенсаторных процессов, внося существенный вклад в патогенез воспалительных заболеваний. Респираторный взрыв нейтрофилов является суммой процессов, зависящих от комплекса мембранных и цитозольных протеинов, которые собираются вместе, чтобы отреагировать на действие многих факторов. Без такого рода активации оксидазные компоненты остаются разобщенными и не могут ответить на стимуляцию. Как и другие клетки, нейтрофил способен регулировать (кондиционировать) свою реактивность, в частности деактивировать или праймировать способность к респираторному взрыву. Природа регулирующего эффекта затрагивает разные механизмы клеточных реакций. В таком конгломерате трудно выделить основное, а тем более инициирующее звено, хотя это не означает, что его нет. Говоря о кондиционировании клеток, дискретности или взаимозависимости обеспечивающих его механизмов, трудно избежать противоречий, связанных с неделимостью (точнее с диалектическим единством) того, что относится к таким интегральным понятиям, как гомеостаз и реактивность. Вновь приходится говорить об условности вычленения первичных и вторичных посредников, мишеней и эффекторов. Стремление к их разграничению вязнет в каскаде прямых и обратных связей, на которых держится развитие и гашение всех реакций. И если стратегические узлы известны, тактические каналы, от которых зависят детали процесса, остаются загадкой. Уже сейчас праймированный нейтрофил воспринимается как важнейший эффектор гомеостаза, который включается в реализацию защитных функций и клинически значимых осложнений воспалительного процесса. Здесь заложены новые подходы к диагностике и лечению патологических состояний, связанных с воспалением, а также пути к управлению эффекторными механизмами иммунитета.
5. Сафронова В.Г., Габдулхакова А.Г., Миллер А.В. и др. Вариабельность действия инсулина на респираторный взрыв в нейтрофилах. Роль тирозиновых киназ и фосфатаз // Биохимия. — 2001. — Т. 66. — С. 1036–1047.
6. Akard L.P., English D., Gabig T.G. Rapid deactivation of NADPH oxidase in neutrophils: continuous replacement by newly activated enzyme sustains the respiratory burst // Blood. — 1988. — Vol. 72. — P. 322–327.
7. Ambruso D.R., Bolscher B.G., Stokman P.M. et al. Assembly and activation of the NADPH:O2 oxidoreductase in human neutrophils after stimulation with phorbol myristate acetate // J. Biol. Chem. — 1990. — Vol. 265. — P. 924–930.
8. Babior B.M. NADPH oxidase: an update // Blood. — 1999. — Vol. 93. — P. 1464–1476.
9. Babior B.M., Peters W.A. The O2-producing enzyme of human neutrophils: further properties // J. Biol. Chem. — 1981. — Vol. 256. — P. 2321–2331.
10. Badwey J.A., Curnutee J.T., Robinson J.M. et al. Effects of free fatty acids on release of superoxide and on change of shape by human neutrophils. Reversibility by albumin // J. Biol. Chem. — 1984. — Vol. 259. — P. 7870–7877.
11. Bennett P.A., Finan P.M., Dixon R.J., Kellie S. Tyrosine phosphatase antagonistinduced activation of the neutrophil NADPH oxidase: a possible role for protein kinase C // Immunology. — 1995. — Vol. 85. — P. 304–310.
12. Bernards A. GAPs galore! A survey of putative Ras superfamily GTPase activating proteins in man and Drosophila // Biochim. Biophys. Acta. — 2003. — Vol. 1603. — P. 47–82.
13. Bouin A.P., Grandvaux N., Vignais P.V., Fuchs A. p40(phox) is phosphorylated on threonine 154 and serine 315 during activation of the phagocyte NADPH oxidase. Implication of a protein kinase c-type kinase in the phosphorylation process // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. — P. 30097–30103.
14. Brandes R.P., Kreuzer J. Vascular NADPH oxidases: molecular mechanisms of activation // Cardiovasc. Res. — 2005. — Vol. 65. — P. 16–27.
15. Brown G.E., Srewart M.Q., Bissonnette S.A. et al. Distinct ligand-dependent roles for p38 MAPK in priming and activation of the neutrophil NADPH oxidase // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 27059–27068.
16. Bylund J., Bjorstad A., Granfeldt D. et al. Reactivation of formyl peptide receptors triggers the neutrophil NADPH-oxidase but not a transient rise in intracellular calcium // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 578–586. 17. Chollet-Przednowed E., Lederer F. Aminoacyl chloromethanes as tools to study the requirements of NADPH oxidase activation in human neutrophils // Eur. J. Biochem. — 1993. — Vol. 218. — P. 89–93.
18. Chuang T.H., Bohl B.P., Bokoch C.M. Biologically active lipids are regulators of Rac.GDI complexation // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268. — P. 26206–26211.
19. Cross A.R. p40phox participates in the activation of NADPH oxidase by increasing the affinity of p47phox for flavocytochrome b558 // Biochem. J. — 2000. — Vol. 349. — P. 113–117.
20. Curnutte J.T., Babior B.M., Karnovsky M.L. Fluoride-mediated activation of the respiratory burst in human neutrophils. A reversible process // J. Clin. Invest. — 1979. — Vol. 63. — P. 637–647.
21. Dahlgren C., Follin P. Degranulation in human neutrophils primes the cells for subsequent responsiveness to the chemoattractant N-formylmethionylleucylphenylalanine but does not increase the sensitivity of the NADPH-oxidase to an intracellular calcium rise // Biochim. Biophys. Acta. — 1990. — Vol. 1052. — P. 42–46.
22. Dana R., Leto T.L., Malech H.L., Levy R. Essential requirement of cytosolic phospholipase A2 for activation of the phagocyte NADPH oxidase // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. — P. 441–445.
23. Dana R., Malech H.L., Levy R. The requirement for phospholipase A2 for activation of the assembled NADPH oxidase in human neutrophils // Biochem. J. — 1994. — Vol. 297. — P. 217–223.
24. Dang P.M., Dewas C., Gaudry M. et al. Priming of human neutrophil respiratory burst by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) involves partial phosphorylation of p47phox // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 20704–20708.
25. Dang P.M., Morel F., Gougerot-Pocidalo M.A., El-Benna J. Phosphorylation of the NADPH oxidase component p67phox by ERK2 and P38MAPK: selectivity of phos- phorylated sites and existence of an intramolecular regulatory domain in the tetratrico- peptiderich region // Biochemistry. — 2003. — Vol. 42. — P. 4520–4526.
26. Daniels I., Lindsay M.A., Keany C.I. et al. Role of arachidonic acid and its metabolites in the priming of NADPH oxidase in human polymorphonuclear leukocytes by peritoneal dialysis effluent // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 1998. — Vol. 5. — P. 683–689.
27. DeCoursey T.E., Ligeti E. Regulation and termination of NADPH oxidase activity // Cell. Mol. Life Sci. — 2005. — Vol. 62. — P. 2173–2193.
28. DeLeo F.R., Rence J., McCormick S. et al. Neutrophils exposed to bacterial lipopolysaccharide upregulate NADPH oxidase assembly // J. Clin. Invest. — 1998. — Vol. 101. — P. 455–463.
29. Dewas C., Dang P.M., Gougerot-Pocidalo M.A., El-Benna J. TNF-? induces phosphorylation of p47phox in human neutrophils: partial phosphorylation of p47phox is a common event of priming of human neutrophils by TNF-? and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor // J. Immunol. — 2003. — Vol. 171. — P. 4392–4398. 30. Diebold B.A., Bokoch G.M. Rho GTPases and the control of the oxidative burst in polymorphonuclear leukocytes // CTMI. — 2005. — Vol. 291. — P. 91–111.
31. Diebold B.A., Fowler B., Lu J. et al. Antagonistic cross-talk between Rac and Cdc42 GTPases regulates generation of reactive oxygen // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 28136–28142.
32. Dinauer M.C. Regulation of neutrophil function by Rac GTPases // Curr. Opin. Hematol. — 2003. — Vol. 10. — P. 8–15.
33. Eklund E.A., Gabig T.G. Purification and characterization of a lipid thiobis ester from human neutrophil cytosol that reversibly deactivates the O2–-generating NADPH-oxidase // J. Biol. Chem. — 1990. — Vol. 265. — P. 8426–8430.
34. El-Benna J., Dang P.M., Gaudry M. et al. Phosphorylation of the respiratory burst oxidase subunit p67phox during human neutrophil activation. Regulation by protein kinase C-dependent and independent pathways // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 17204–17208.
35. El-Benna J., Dang P.M., Gougerot-Pocidalo M.A., Elbim C. Phagocyte NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses // Arch. Immunol. Ther. Exp. — 2005. — Vol. 53. — P. 199–206.
36. Elbim C., Guichard C., Dang P.M et al. Interleukin-18 primes the oxidative burst of neutrophils in response to formyl-peptides: role of cytochrome b558 translocation and N-formyl peptide receptor endocytosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 2005. — Vol. 12. — P. 436–446.
37. Elzi D.J., Bjornsen A.J., MacKenzie T. et al. Ionomycin causes activation of p38 and p42/44 mitogen-activated protein kinases in human neutrophils // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. — 2001. — Vol. 281. — C. 350–360.
38. Erickson R.W., Langel-Peveri P., Traynor-Kaplan A.E. et al. Activation of human neutrophil NADPH oxidase by phosphatidic acid or diacylglycerol in a cell-free system. Activity of diacylglycerol is dependent on its conversion to phosphatidic acid // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 22243–22250.
39. Finkel T.H., Pabst M.J., Suzuki H. et al. Priming of neutrophils and macrophages for enhanced release of superoxide anion by the calcium ionophore ionomycin. Implications for regulation of the respiratory burst // J. Biol. Chem. — 1987. — Vol. 262. — P. 12589–12596.
40. Fontayne A., Dang P.M., Gougerot-Pocidato M.A., El-Benna J. Phosphorylation of p47phox sites by PKC?, ?II, ?, and ?; effect on binding to p22phox and on NADPH oxidase activation // Biochemistry. — 2002. — Vol. 41. — P. 7743–7750.
41. Forehand J.R., Pabst M.J., Phillips W.A., Johnston R.B., Jr. Lipopolysaccharide priming of human neutrophils for an enhanced respiratory burst. Role of intracellular free calcium // J. Clin. Invest. — 1989. — Vol. 83. — P. 74–83.
42. Gabig T.G., Crean C.D., Mantel P.L., Rosli R. Function of wild-type or mutant Rac2 and Rap1a GTPases in differentiated HL60 cell NADPH oxidase activation // Blood. — 1995. — Vol. 85. — P. 804–811.
43. Geiszt M., Dagher M.C., Molnar G. et al. Characterization of membrane-localized and cytosolic Rac-GTPase-activating proteins in human neutrophil granulocytes: contribution to the regulation of NADPH oxidase // Biochem. J. — 2001. — Vol. 355. — P. 851–858.
44. Gillibert M., Dehry Z., Terrier M. et al. Another biological effect of tosylphenylalanylchloromethane (TPCK): it prevents p47phox phosphorylation and translocation upon neutrophil stimulation // Biochem. J. — 2005. — Vol. 15. — P. 549–556.
45. Grinstein S., Furuya W., Lu D.J., Mills G.B. Vanadate stimulates oxygen consumption and tyrosine phosphorylation in electropermeabilized neutrophils // J. Biol. Chem. — 1990. — Vol. 265. — P. 318–327.
46. Henderson L.M., Chappell J.B., Jones O.T. Superoxide generation is inhibited by phospholipase A2 inhibitors. Role for phospholipase A2 in the activation of the NADPH oxidase // Biochem. J. — 1989. — Vol. 264. — P. 249–255.
47. Henderson L.M., Moule S.K., Chappell J.B. The immediate activator of the NADPH oxidase is arachidinate not phosphorylation // Eur. J. Biochem. — 1993. — Vol. 211. — P. 157–162.
48. Henderson L.M., Thomas S., Banting G., Chappell J.B. The arachidonate-activatable NADPH oxidase-associated H+ channel is contained within the multi-membranespanning N-terminal region of gp91phox // Biochem. J. — 1997. — Vol. 325. — P. 701–705.
49. Heyworth P.G., Badwey J.A. Continuous phosphorylation of both the 47 and the 49 kDa proteins occurs during superoxide production by neutrophils // Biochim. Biophys. Acta. — 1990. — Vol. 1052. — P. 299–305.
50. Heyworth P.G., Badwey J.A. Protein phosphorylation associated with the stimulation of neutrophils. Modulation of superoxide production by protein kinase C and calcium // J. Bioenerg. Biomembr. — 1990. — Vol. 22. — P. 1–26.
51. Heyworth P.G., Robinson J.M., Ding J., Ellis B.A., Badwey J.A. Cofilin undergoes rapid dephosphorylation in stimulated neutrophils and translocates to ruffled membranes enriched in products of the NADPH oxidase complex. Evidence for a novel cycle of phosphorylation and dephosphorylation // Histochem. Cell. Biol. — 1997. — Vol. 108. — P. 221–233.
52. Hii C.S., Huang Z.H., Bilney A. et al. Stimulation of p38 phosphorylation and activity by arachidonic acid in HeLa cells, HL60 promyelocytic leukemic cells, and human neutrophils. Evidence for cell type-specific activation of mitogen-activated protein kinases // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. — P. 19277–19282.
53. Huang J., Kleinberg M.E. Activation of the phagocyte NADPH oxidase protein p47phox phophorylation controls SH3 domain-dependent binding to p22phox // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 19731–19737.
54. Jandl R.C., Andre-Schwartz J., Borges-DuBois L., Kipnes R.S. Termination of the respiratory burst in human neutrophils // J. Clin. Invest. — 1978. — Vol. 61. — P. 1176–1185.
55. Khan W.A., Blobe G.C., Hannun Y.A. Arachidonic acid and free fatty acids as second messengers and the role of protein kinase C // Cell Signal. — 1995. — Vol. 7. — P. 171–184. 56. Kim C., Dinauer M. Rac2 is an essential regulator of neutrophil NADPH oxidase activation in response to specific signaling pathways // J. Immunol. — 2001. — Vol. 166. — P. 1223–1232.
57. Kim-Park W.K., Moore M.A., Hakki Z.W., Kowolik M.J. Activation of the neutrophil respiratory burst requires both intracellular and extracellular calcium // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 1997. — Vol. 832. — P. 394–404.
58. Kobayashi T., Tsunawaki S., Seguchi H. Evaluation of the process for superoxide production by NADPH oxidase in human neutrophils: evidence for cytoplasmic origin of superoxide // Redox Rep. — 2001. — Vol. 6. — P. 27–36.
59. Koga H., Terasawa H., Nunoi H. et al. Tetratricopeptide repeat (TPR) motifs of p67phox participate in interaction with the small GTPase Rac and activation of the phagocyte NADPH oxidase // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 25051–25060.
60. Krump E., Sanghera J.S., Pelech S.L. et al. Chemotactic peptide N-formyl-metleu-phen activation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) and MAPK-activated protein kinase-2 in human neutrophils // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 937–944.
61. Kuribayashi F., Nunci H., Wakamatsu K. et al. The adaptor protein p40phox as a positive regulator of the superoxide-producing phagocyte oxidase // EMBO J. — 2002. — Vol. 21. — P. 6312–6320.
62. Leusen J.H., Fluiter K., Hilarius P.M. et al. Interactions between the cytosolic components p47phox and p67phox of the human neutrophil NADPH oxidase that are not required for activation in the cell-free system // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270. — P. 11216–11221.
63. MacKinnon A., Buckley A., Chilvers E.R. et al. Sphingosine kinase: a point of convergence in the action of diverse neutrophil priming agents // J. Immunol. — 2002. — Vol. 169. — P. 6394–6400.
64. Malcolm K.C., Arndt P.C., Manos E.J. et al. Microarray analysis of lipopolysaccharide-treated human neutrophils // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. — 2003. — Vol. 284. — P. L663–670.
65. Mansfield P.J., Hinkovska-Galeheva V., Shayman J.A., Boxer L.A. Granulocyte colony-stimulating factor primes NADPH oxidase in neutrophils through translocation of cytochrome b558 by gelatinase-granule release // J. Lab. Clin. Med. — 2002. — Vol. 140. — P. 9–16.
66. Maridonneau-Parini I., Tauber A.I. Activation of NADPH-oxidase by arachidonic acid involves phospholipase A2 in intact human neutrophils but not in the cell-free system // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1986. — Vol. 138. — P. 1099–1105.
67. Maridonneau-Parini I., Tringale S.M., Tauber A.I. Identification of distinct activation pathways of the human neutrophil NADPH-oxidase // J. Immunol. — 1986. — Vol. 137. — P. 2925–2929.
68. McColl S.R., Beauseigle D., Gilbert C., Naccache P.H. Priming of the human neutrophil respiratory burst by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor-alpha involves regulation at a post-cell surface receptor level. Enhancement of the effect of agents which directly activate G proteins // J. Immunol. — 1990. — Vol. 145. — P. 3047–3053.
69. McDonald P.P. Transcriptional regulation in neutrophils: teaching old cells new tricks // Adv. Immunol. — 2004. — Vol. 82. — P. 1–48.70. Mollapour E., Linch D.C., Roberts P.J. Activation and priming of neutrophil nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and phopholipase A2 are dissociated by inhibitors of the kinases p42erk2 and p38sapk and by methyl arachidonyl fluorophosphonate, the dual inhibitor of cytosolic and calcium-independent phospholipase A2 // Blood. — 2001. — Vol. 97. — P. 2469–2477.
71. Naccache P.R., Therrien S., Caon A.C. et al. Chemoattractant-induced cytoplasmic pH changes and cytoskeletal reorganization in human neutrophils. Relationship to the stimulated transients and oxidative burst // J. Immunol. — 1989. — Vol. 142. — P. 2438–2444.
72. Nathan C.F. Respiratory burst in adherent human neutrophils: triggering by colony-stimulating factors CSF-GM and CSF-G // Blood. — 1989. — Vol. 73. — P. 301–306.
73. Nauseef W.M., Volpp B.D., McCormick S. et al. Assembly of the neutrophil respiratory burst oxidases, Protein kinase C promotes cytoskeletal and membrane association of cytosolic oxidase components // J. Biol. Chem. — 1991. — Vol. 266. — P. 5911–5917.
74. O’Flaherty J.T., Rossi A.G., Redman J.F., Jacobson D.P. Tumor necrosis factor-alpha regulates expression of receptors for formyl-methionyl-leucyl-phenilalanine, leukotriene B4, and platelet-activating factor. Dissociation from priming in human polymorphonuclear neutrophils // J. Immunol. — 1991. — Vol. 147. — P. 3842–3447.
75. Quinn M.T., Gauss K.A. Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase: comparison with nonphagocyte oxidases // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 76. — P. 760–781.
76. Regier D.S., Greene D.G., Sergeant S. et al. Phosphorylation of p22phox is mediated by phospholipase D-dependent and -independent mechanisms // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 28406–28412.
77. Rittinger K., Walker P.A., Ecclesion J.F. et al. Crystal structure of a small G protein in complex with the GTPase-activating protein rhoGAP // Nature. — 1997. — Vol. 388. — P. 693–697.
78. Roberts P.J., Williams S.L., Linch D.C. The regulation of neutrophil phospholipase A2 by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and its role in priming superoxide production // Br. J. Haematol. — 1996. — Vol. 92. — P. 804–814.
79. Robertson A.K., Cross A.R., Jones O.T., Andrew P.W. The use of diphenylene iodonium, an inhibitor of NADPH-oxidase, to investigate the antimicrobial action of human monocyte delivered macrophages // J. Immunol. Methods. — 1990. — Vol. 133. — P. 175–181. 80. Rossi F., Bellavite P., Berton G. et al. The respiratory burst of phagocytic cells: facts and problems // Adv. Exp. Med. Biol. — 1982. — Vol. 141. — P. 283–322.
81. Rotrosen D., Leto T.L. Phosphorylation of neutrophil 47-kDa cytosolic oxidase factor. Translocation to membrane is associated with distinct phosphorylation events // J. Biol. Chem. — 1990. — Vol. 265. — P. 19910–19915.
82. Rubin B.B., Downey G.F., Koh A. et al. Cytosolic phospholipase A2-alpha is necessary for platelet-activating factor biosynthesis, efficient neutrophil-mediated bacterial killing, and the innate immune response to pulmonary infection: cPLA2-alpha does not regulate neutrophil NADPH oxidase activity // J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 280. — Р. 7519–7529.
83. Rubinek T., Levy R. Arachidonic acid increases the activity of the assembled NADPH oxidase in cytoplasmic memnbranes and endosomes // Biochim. Biophys. Acta. — 1993. — Vol. 1176. — P. 51–58.
84. Sathyamoorthy M., de Mendez I., Adams A.G., Leto T.L. p40phox down-regulates NADPH oxidase activity through interactions with its SH3 domain // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 9141–9146.
85. Sheppard F.R., Kelher M.R., Moore E.E. et al. Structural organization of the neutrophil NADPH oxidase: phosphorylation and translocation during priming and activation // J. Leukoc. Biol. — 2005. — Vol. 78. — P. 1025–1042.
86. Shi J., Ross C.R., Leto T.L., Blecha F. PR-39, a praline-rich antibacterial peptide that inhibits phagocyte NADPH oxidase activity by binding to Src homology 3 domains of p47phox // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93. — P. 6014–6018.
87. Shiose A., Sumimoto H. Arachidonic acid and phosphorylation synergistically induce a conformational change of p47phox to activate the phagocyte NADPH oxidase // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 13793–13801.
88. Tamura M., Takeshita M., Curnutte J.T. et al. Stabilization of human neutrophil NADPH oxidase activated in a cell-free system by cytosolic proteins and by 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide // J. Biol. Chem. — 1992. — Vol. 267. — P. 7529–7538.
89. Tamura M., Kai T., Tsunawaki S. et al. Direct interaction of actin with p47phox of neutrophil NADPH oxidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2000. — Vol. 276. — P. 1186–1190.
90. Tamura M., Kanno M., Endo Y. Deactivation of neutrophil NADPH oxidase by actin-depolymerizing agents in a cell-free system // Biochem. J. — 2000. — Vol. 349. — P. 369–375.
91. Tennenberg S.D., Fey D.E., Lieser M.J. Oxidative priming of neutrophils by interferon-gamma // J. Leukoc. Biol. — 1993. — Vol. 53. — P. 301–308.
92. Tennenberg S.D., Solomkin J.S. Activation of neutrophils by cachectin/tumor necrosis factor: priming of N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine-induced oxidative responsiveness via receptor mobilization without degranulation // J. Leukoc. Biol. — 1990. — Vol. 47. — P. 217–223.
93. Toker A. Protein kinases as mediators of phosphoinositide 3-kinase signaling // Mol. Pharmacol. — 2000. — Vol. 57. — P. 652–658.
94. Uhlinger D.J., Tyagi S.R., Ingo K., Lambeth J.D. The respiratory burst oxidase of human neutrophils. Guanine nucleotides and arachidonate regulate the assembly of a multicomponent complex in a semirecombinant cell-free system // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 269. — P. 8624–8631.
95. Van Bruggen R., Anthony E., Fernandez-Borja M., Roos D. Continuous translocation of Rac2 and the NADPH oxidase component p67phox during phagocytosis // J. Biol. Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 9097–9102.
96. Van der Zee L., Nelemans A., den Hertog A. Arachidonic acid is functioning as a second messenger in activating the Ca2+ entry process on Hi-histaminoceptor stimulation in DDT1 MF-2 cells // Biochem. J. — 1995. — Vol. 305. — P. 859–864.
97. Ward R.A., Nakamura M., McLeish K.R. Priming of the neutrophil respiratory burst involves p38 mitogen-activated protein kinase-dependent exocytosis of flavocytochrome b558-containing granules // J. Biol. Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 36713–36719.
98. Werner E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signalling // J. Cell Sci. — 2004. — Vol. 117. — P. 143–153.
99. Wetzker R., Rommel C. Phosphoinositide 3-kinases as targets for therapeutic intervention // Curr. Pharmaceut. Des. — 2004. — Vol. 10. — P. 1915–1922.
100. Wolfl J., Daugher M.C., Fuchs A. et al. In vitro activation of the NADPH oxidase by fluoride. Possible involvement of a factor activating GTP hydrolysis on Rac (Rac- GAP) // Eur. J. Biochem. — 1996. — Vol. 239. — P. 369–375.
101. Zhao T., Benard V., Bohl B.P., Bokoch G.M. The molecular basis for adhesion-mediated suppression of reactive oxygen species generation by human neutrophils // J. Clin. Invest. — 2003. — Vol. 112. — P. 1732–1740.
102. Zhan S., Vazquez N., Zhan S. et al. Genomic structure, chromosomal localization, start of transcription, and tissue expression of the human p40phox, a new component of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase complex // Blood. — 1996. — Vol. 88. — P. 2714–2721. NADPH-oxidase of neutrophils: activation and regulation A.N. Mayansky
Medical Academy, Nizhny Novgorod Neutrophil NADPH-oxidase is of great importance for phagocytic reactions being one of factors resisting to pathogens and inducing the inflammation. Production of superoxide anion and its derivatives takes place in non-mitochondrial activation of multicomponent protein complex having the ability to oxidize NADPH and to translocate the electrons from NADPH to molecular oxygen. This process (respiratory burst) is regulated by a number of receptor and non-receptor reactions that provide the conformational changes of NADPH-oxidase components making them to interact with one another. Oxidant reactions depend on stimulus and may be deactivated or primed, i.e. negatively or positively conditioned. This review covers the basic elements of neutrophil NADPH-oxidase and mechanisms of its regulation. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 3. P. 3–13.)
