загрузка...
 
Интерфероны и другие цитокины при остром вирусном гепатите С Ф.И. Ершов, М.В. Мезенцева
Повернутись до змісту

Интерфероны и другие цитокины при остром вирусном гепатите С Ф.И. Ершов, М.В. Мезенцева

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

В настоящей работе на примере острого вирусного гепатита С (ОВГС) сделана попытка определить закономерности изменений цитокинового профиля у больных. Другой задачей было определение эффективности нового противогепатитного препарата — Аллокина А (ОАО «Аллоферон», Россия). Для этого у 100 больных ОВГС, леченных Аллофероном, и 40 здоровых добровольцев были исследованы интерфероновый статус (биологическим методом) и цитокиновый профиль (методом ОТ-ПЦР). Отмечены нарушения ряда параметров системы интерферона и цитокинов у больных ОВГС до лечения. В результате лечения положительный эффект (снижение активности инфекционного процесса) наблю-

дался при следующих закономерностях в изменении лабораторных показателей: 1) активации системы IFN и нормализации Т- и В-клеточного иммунитета, 2) нормализации или тенденции к нормализации у больных ОВГС экспрессии генов следующих цитокинов: IFN? (через 10–30 дней наблюдения), IFN? (через 10–30 дней и до конца срока наблюдения), TNF? и IL-12 (через 10 дней–2 месяца и до конца срока наблюдения), IL-8 и IL-10 на начальном этапе терапии (10–30 дней), 3) нормализации продукции IFN? на разных этапах его синтеза и, соответственно, восстановлении функциональной активности Т-лимфоцитов, способности к активации иммунной системы и нормализации иммунного ответа по Тh1-типу. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 3. С. 32–35.)

Ключевые слова: острый вирусный гепатит, интерфероновый статус, цитокиновый профиль, Аллокин. Среди вирусных гепатитов доминирующее место занимают инфекции, вызванные вирусами гепатитов В и С (ВГВ и ВГС). С ними связаны практически все летальные исходы у больных острыми вирусными гепатитами (ОВГ), а также развитие хронических заболеваний печени (хронизация при ВГС достигает 80%) с исходом в циррозы и первичный рак печени. Значительно выросли в последнее время показатели заболеваемости ВГВ и ВГС в России, что связано, в первую очередь, с ростом наркомании. По сравнению с 1994 г. (первым годом официальной регистрации ВГС в России), в 2002 г. официальные показатели заболеваемости ВГС в России возросли в 7 раз. Однако истинные масштабы этих инфекций значительно выше, т. к. в ряде случаев они протекают бессимптомно в течение многих лет [6, 11].В медицинской практике существует пока одна рекомбинантная вакцина — против ВГВ. Большинство экспертов считает наиболее целесообразной противовирусную терапию больных острыми ВГВ и ВГС (ОВГВ и ОВГС) с помощью препаратов интерферона альфа (IFN??). В то же время, длительная терапия препаратами IFN?? связана с рядом побочных эффектов [1, 2, 3]. Препараты экзогенного IFN могут заменяться в клинической практике использованием его индукторов, вызывающих в организме образование собственного (эндогенного) IFN и обладающих антивирусной, иммуномодулирующей и антитуморогенной активностью [3]. Ряд индукторов IFN (амиксин, циклоферон, ридостин) в настоящее время широко применяется в терапии ОВГС. Исследования показали, что противовирусная активность названных препаратов в целом совпадает с активностью экзогенных IFN [3, 9].К сожалению, несмотря на достаточно большой набор препаратов, заболеваемость вирусными гепатитами плохо контролируется. Поэтому актуальной задачей остается разработка новых лечебных препаратов, эффективных при острых и хронических вирусных гепатитах В и С.Известно, что при ВГС, как и при многих других вирусных заболеваниях, развивается дисбаланс в иммунной системе человека. У больных отмечены значительные нарушения систем иммунитета и интерферона. По данным литературы, в ходе первичного обследования больных ВГС отмечена супрессия Th1-лимфоцитов [1, 5]. В настоящей работе на примере острого вирусного гепатита С сделана попытка определить закономерности изменений цитокинового профиля у обследованных больных. Другой задачей проведенных исследований было определение эффективности нового противогепатитного препарата аллокина А (ОАО «Аллоферон», Рос сия).

Материалы и методы

Обследовано 100 больных в возрасте от 16 до 50 лет с верифицированным диагнозом острый вирусный гепатит С. Диагноз ОВГС подтверждался определением серологических маркеров (анти-HCV IgG, анти-HCV IgM, aнти-core-HCV IgG), а также количественным анализом уровня РНК HCV c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).Контрольную группу составляли 100 здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 45 лет. Для определения показателей интерферонового статуса и цитокинового профиля использовали гепаринизированную цельную кровь, полученную асептически из локтевой вены.Исследование расширенного интерферонового статуса проводили по методике, разработанной в отделе интерферонов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи [4, 7]. Определяли следующие показатели:

1) продукцию IFN?, индуцируемую вирусом болезни Ньюкасла (лаборатория препаратов интерферона НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва);

2) продукцию IFN?, индуцируемую стафилококковым энтеротоксином А (НПО «Иммунопрепарат», Уфа, Россия);

3) уровень циркулирующего IFN в плазме крови;

4) уровень спонтанно продуцируемого IFN;

5) чувствительность к препаратам IFN? (с использованием прайминг-эффекта). Пациента считали чувствительным к IFN?, если клетки его крови отвечали увеличением ВБН-индуцируемой продукции IFN при праймировании одним из следующих шести препаратов IFN?:

а) человеческим лейкоцитарным IFN и лейкинфероном («Интекор», Москва, Россия),

б) реафероном (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия), в) реальдироном («Биотехна», Литва), г) интроном А («Шеринг-Плау», США), рофероном А («Хоффманн-Ля Рош», Швейцария);

6) уровень чувствительности к препарату IFN? —  Гаммаферону (НПО «Фермент», Рига, Латвия) (с использованием прайминг-эффекта);

7) уровень чувствительности к разрешенным для медицинского применения индукторам IFN: ридостину (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия) и циклоферону (НТФФ «Полисан», СанктПетербург, Россия), а также к иммуномодулирующему препарату Аллокин (ОАО «Аллоферон», Россия). Пациента считали чувствительным к указанным препаратам, если клетки его крови продуцировали IFN при действии этих препаратов;

8) IFN-ингибирующая /IFN-стимулирующая способность плазмы или сыворотки крови.

Определение активности IFN Титрование IFN проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах с культурой диплоидных фибробластов человека (получены из музея клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва), выращенных в ростовой среде до образования монослоя. В качестве индикаторного тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (получен из музея вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). За единицу активности IFN (ЕД/мл) принимали величину, обратную его максимальному разведению, которая защищала 50 % клеток от цитопатического действия 100 ТЦД50 вируса. В каждом титровании использовался также референс-препарат IFN для перевода полученной активности IFN в международные единицы.Определение мРНК цитокиновОпределение активности мРНК 11 цитокинов в мононуклеарах периферической крови проводили с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Выделение РНК проводили по методике P. Chomczynsky, N. Sacchi [14] методом кислой экстракции тиоцианатом гуанидина — фенолом — хлороформом. Обратная транскрипция и ПЦР-амплификация были выполнены в соответствии с методикой, предложенной G. Gelder [16]. В работе были использованы пары праймеров для следующих цитокинов: IFN? [16], IL-6, IL-8 [18], IL-1?, IL-2, IL-4, IL-10, TNF?, IFN? [20], IL-18 [15], IL-12 [17]. В качестве положительного контроля использовали ?-актин [18]. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega (G 1758).

Результаты и обсуждение

Цитокиновый профиль при остром вирусном гепатите С

Как известно, нарушения в системе иммунитета, в частности нарушение продукции IFN и других цитокинов, определяют течение заболеваний, вызываемых ВГС, поэтому определение уровня IFN и других цитокинов у больных ВГС может служить одним из критериев результативности терапии. Представляло интерес изучить нарушения экспрессии генов ряда цитокинов и IFN у больных ОВГС и возможность коррекции обнаруженных нарушений новым отечественным препаратом Аллокин.Исследование интерферонового статуса больных ОВГС до лечения показало:

— повышенное содержание IFN в сыворотке крови в среднем у 40% пациентов;

— наличие в среднем у 17% пациентов IFN, спонтанно вырабатываемого клетками крови;

— снижение способности к продукции IFN? практически у всех обследованных больных (93%);

— снижение способности к продукции IFN? в среднем у 52% пациентов;

— снижение чувствительности к препаратам IFN? и IFN? в среднем у 41% и 55% пациентов, соответственно;

— снижение чувствительности к индукторам IFN в среднем у 14% больных;

— повышение IFN?/?-ингибирующей активности сыворотки крови выше нормы у 30–50% пациентов.

Терапия ОВГС препаратом Аллокин

Определение показателей интерферонового статуса больных ОВГС после курса лечения, вклю-

чающего препарат Аллокин в дозе 10 мг, выявило в большинстве случаев нормализацию титров циркулирующего в сыворотке крови (90%) и спонтанно вырабатываемого IFN (80%), а также IFN-ингибирующей активности сыворотки крови — в среднем у 35% пациентов. Способность к продукции IFN? и IFN? восстанавливалась у 40% и 80% больных, соответственно. При этом чувствительность к препаратам IFN?/? и индукторам IFN повышалась.Следует отметить, что нормализация большинства параметров интерферонового статуса соответствовала положительному клиническому эффекту. В то же время отсутствие клинического эффекта или отрицательный клинический эффект наблюдался у больных при совокупном изменении следующих параметров: повышении циркулирующего и спонтанно вырабатываемого IFN, снижении способности к продукции IFN?, IFN? и чувствительности к иммуномодулирующим препаратам.

В табл. 1 представлены данные о количестве здоровых добровольцев и больных ВГС с выявленной мРНК цитокинов. Показано, что при ВГСинфекции возрастало число больных, у которых определялись мРНК IFN?, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-18 по сравнению со здоровыми добровольцами. При этом обнаружено, что в стадии обострения до лечения снижалась встречаемость больных с выявленной мРНК IFN?, TNF?, IL-12, а мРНК IL-8 и IL-10 определялись у больных ВГС с той же частотой, что и у здоровых добровольцев.Изучение РНК цитокинов у обследованных больных в процессе и после лечения Аллокином показало следующее.

1. На протяжении всего срока наблюдения (180 дней) сохранялась продукция мРНК IFN?,

IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-18 у большинства обследованных пациентов, леченных препаратом Аллокин в дозе 10 мг.

2. Встречаемость мРНК IFN? через 10 дней терапии обнаруживалась в 2 раза чаще, чем до лечения. А через 20–30 дней и до конца срока наблюдения выявляемость мРНК этого цитокина у обследованных пациентов была такой же, как и у здоровых добровольцев. Таким образом, можно предполагать нормализацию иммунного ответа у этих больных по Тh1-типу, что явлется благоприятным признаком при лечении.

3. Применение препарата Аллокин вызывало появление мРНК TNF? и IL-12 у 80% больных через 2 месяца лечения. Этот факт можно рассматривать как положительный, т. к. до лечения экспрессия генов этих цитокинов наблюдалась у значительно меньшего числа больных по сравнению со здоровыми добровольцами.

4. Терапия с применением Аллокина способствовала снижению встречаемости мРНК IL-6 через 20–30 дней лечения. Но через 2 месяца экспрессия гена этого цитокина наблюдалась у всех обследованных больных.

5. Отмечено снижение встречаемости мРНК IL-10 у обследованных больных ОВГС до 20–30 дня наблюдения. Через 2 месяца обнаружено увеличение числа пациентов с выявленной мРНК IL-10. Именно в это же время обнаружено повышение встречаемости мРНК другого антивоспалительного цитокина — IL-4.

6. Активность В-лимфоцитов может характеризоваться синтезом IFN?, IL-1?, IL-4, IL-10 и IL-12, а Th2-лимфоцитов — способностью к продукции IL-4 и IL-10. При лечении Аллокином отмечалось увеличение числа больных с повышенной экспрессией генов именно этих цитокинов, определяющих активацию гуморального иммунитета.

Таким образом, проведенные исследования интерферонового и цитокинового статусов больных ОВГС показали, что в результате лечения положительный клинический эффект наблюдался при следующих закономерностях в изменении лабораторных показателей (табл. 2):

1) снижение активности инфекционного процесса при активации системы IFN и нормализации Т- и В-клеточного иммунитета;

2) нормализация или тенденция к нормализации у больных ОВГС экспрессии генов следующих ци- токинов: IFN? (через 10–30 дней наблюдения), IFN? (через 10–30 дней и до конца срока наблюдения), TNF? и IL-12 (через 10 дней-2 месяца и до конца срока наблюдения), IL-8 и IL-10 (через 3 месяца и до конца срока наблюдения);

3) нормализация продукции IFN? на разных этапах его синтеза, и, соответственно, восстановление функциональной активности Т-лимфоцитов, способности к активации иммунной системы и нормализации иммунного ответа по Тh1-типу.

Авторы выражают благодарность ведущим специалистам в области гепатологии проф. С.Г. Чешеку и к.м.н. Д.В. Быченко (Клиническая инфекционная больница № 1, Москва) за оказанную помощь в проведении исследований.

Таблица 1 Продукция мРНК цитокинов у здоровых добровольцев (n = 100) и больных ОВГС (n = 100) до и после лечения Аллокином

 

Таблица 2 Эффективность терапии больных ВГС в зависимости от показателей цитокинового, интерферонового и иммунного статуса

 

Примечание:   (+) — наличие мРНК цитокина; (–) — отсутствие мРНК цитокина; ? — повышение; ? — снижение; N — норма.

ЛИТЕРАТУРА 1. Гусев В.А., Жданов К.В., Лобзин Ю.В., Симбирцев А.С. Сравнительный анализ некоторых показателей иммунитета при желтушных формах гепатитов В, С и В + С // Мед. иммунол. — 2001. — Т. 3, № 2. — с. 217.

2. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина, 1996. — 240 с.

3. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты — М.: Медицина, 1998. — 186 с.

4. Ершов Ф.И., Мезенцева М.В., Васильев А.Н. и др. Методические указания по определению индивидуальной чувствительности организма к интерферонам, другим цитокинам и индукторам интерферона // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. — 2002. — № 1 (9). — C. 22–26.

5. Журкин А.С., Соловьев с.В. Продукция цитокинов и интерферонотерапия у больных хроническими вирусными гепатитами // Эпидемиол. инфекц. болезни. — 1999. — № 5. — C. 27–29.

6. Каркищенко Н.Н. Лекарственная профилактика. — М.: Воентехлит, 2001. — 752 с.

7. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Амченкова А.М. и др. Определение клеточной чувствительности к интерферонам в цельной крови (расширение показателей интерферонового статуса): Метод. рекомендации. НИИЭМ им.  Н.Ф. Гамалеи. — М., 1997.

8. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Оспельникова Т.П. и др. Прогнозирование эффективности интерферонотерапии при различных формах патологии // Иммунология. — 2001. — № 4. — С. 41–44.

9. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Касьянова Н.В. и др. Циклоферон в терапии острого гепатита С у наркоманов // В кн. Циклоферон — от эксперимента в клинику. — СПб.: 2002. — С. 108–114.

10. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Оспельникова Т.П., Ершов Ф.И. Продукция цитокинов клетками крови при герпесе, гепатите С и других формах патологии // Вопр. вирусол. — 2002. — Т. 47, № 1. — С. 44–47. 11. Онищенко Г.Г. Доклад на конференции «Лекарственная профилактика» в Министерстве здравоохранения РФ. — М., 2002.

12. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты. — СПб.: НТФФ «Полисан», 1998. — 113 с.

13. Царегородцева Т.М., Серова Т.И. Цитокины в гастроэнтерологии. — М.: Анахарсис, 2003. — 96 с.

14. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162, № 1. — Р. 156–159.

15. Gaede K.I., Mamat U., Schlaak M. et al. Analysis of differentially regulated mRNAs in monocytic cells induced by in vitro stimulation // J. Mol. Med. — 1999. — Vol. 77, № 12. — Р. 847–852.

16. Gelder с.М., Thomas P.S., Yates D.H. et al. Cytokine expression in normal, atopic, and asthmatic subjects using the combination of sputum induction and the polymerase chain reaction // Thorax. — 1995. — Vol. 50, № 10. — P. 1033–1037.

17. Harrison T.S., Levitz S.M. Role of IL-12 in peripheral blood mononuclear cell responses to fungi in persons with and without HIV infection // J. Immunol. — 1996. — Vol. 156, № 11. — Р. 4492–4497.

18. Lin Y., Zhang M., Barnes P.F. Chemokine production by a human alveolar epithelial cell line in response to Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun. — 1998. — Vol. 66, № 3. — Р. 1121–1126.

19. Tomasi T.B. The discovery of secretory IgA and the mucosal immune system // Immunol. Today. — 1992. — Vol. 13, № 10. — P. 416–418.

20. Yamamura M., Uyemura K., Deans R.J. et al. Defining protective responses to pathogens: cytokine profiles in leprosy lesions // Science. — 1991. — Vol. 254, № 5029. — Р. 277–279.

Interferons and other cytokines in acute viral hepatitis CF.I. Yershov, M.V. Mezentseva N.F. Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology, RAMS, Moscow

The aim of the study was to investigate the changes in interferon production and gene expression of certain cytokines in patients with acute hepatitis C (AHC), and to develop methods of individual correction of the found abnormalities. Another aim of the investigation was the study of efficiency of a new anti-HCV preparation Allokin-A (Russia). 40 healthy volunteers and 100 patients with AHC were studied. Parameters of the interferon status were investigated using biological method and of the cytokine profile by RT-PCR.We found that parameters of the interferon and cytokine system have been violated in all AHC patients. Also we described some regular trends in interferon and cytokine profile changes under positive results of treatment. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 3. P. 32–35.)

Key words: acute hepatitis C, interferon status, cytokine profile, preparation Allokin-A.



загрузка...