загрузка...
 
Цитокиновый баланс при болезнях Паркинсона и Вильсона — Коновалова О.Н. Учакина,П.Н. Учакин, М.В. Мезенцева, А.В. Карабанов, В.В. Полещук, И.А. Иванова-Смоленская, Ф.И. Ершов
Повернутись до змісту

Цитокиновый баланс при болезнях Паркинсона и Вильсона — Коновалова О.Н. Учакина,П.Н. Учакин, М.В. Мезенцева, А.В. Карабанов, В.В. Полещук, И.А. Иванова-Смоленская, Ф.И. Ершов

 ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН;  ГУ НИИ неврологии РАМН, Москва;  Mercer University School of Medicine, Macon, GA, USA

Проблема экстрапирамидных (ЭП) заболеваний стала в последние годы особенно острой в связи с увеличением продолжительности жизни и ростом числа больных. Вторичные иммунодефициты играют важную роль в патогенезе ЭП заболеваний. Целью настоящего исследования являлось изучение цитокинового каскада у больных болезнью Паркинсона (БП) и болезнью Вильсона — Коновалова (БВК) на фоне симптоматического лечения.В сыворотке крови больных выявлено сниженное содержание IFN?, IL-1?, IL-2, IL-6, и IL-10 и повышенное содержание IL-4, IL-12, и TNF?. Методом ОТ-ПЦР выявлены статистически достоверные изменения в экспрессии генов цитокинов Th1 (IFN? и IL-12) и Th2 (IL-4 и IL-6). Обнаружена очень низкая способность иммуноцитов к продукции IFN? in vitro, при нормальных уровнях экспрессии генов и концентрации IFN? в сыворотке крови больных ЭП заболеваниями. Это позволяет предполагать подавление противовирусного звена иммунитета на посттрансляционном уровне. Именно поэтому применение индукторов интерферона для коррекции состояния иммунной системы у этих больных может быть более эффективно, чем использование рекомбинантных форм интерферона. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 3. С. 63–68.)

Ключевые слова: нейродегенерация, экстрапирамидные заболевания, интерлейкины, интерферон.Проблема экстрапирамидных (ЭП) заболеваний стала в последние годы особенно острой в связи с увеличением продолжительности жизни и ростом числа больных. ЭП заболевания обусловлены дегенерацией нервных клеток центральной нервной системы (ЦНС), в результате чего происходит дисбаланс в синтезе нейромедиаторов и, как следствие, нарушение регуляции ЦНС нормального функционирования организма. Взаимодействие физиологических систем в организме осуществляется посредством растворимых медиаторов (нейропептидов, гормонов). В иммунной системе такими медиаторами служат цитокины, которые также несут и эффекторные функции. Действие медиаторов нервной и эндокринной систем на иммунную систему хорошо известны. С другой стороны, увеличивается количество данных, подтверждающих, что цитокины являются основными передатчиками между иммунной системой и мозгом [5]. Развитие адекватного иммунного ответа напрямую зависит от баланса клеточно-опосредованных (Th1) и гуморальных (Th2) иммунных реакций, регулируемых двумя группами цитокинов. Эти группы находятся в антагонистических взаимоотношениях, угнетая развитие цитокинового каскада противоположного типа. Дисбаланс в продукции Th1 и Th2 цитокинов может привести к развитию вторичных иммунодефицитов. Кроме иммунорегулирующих свойств, все цитокины обладают  выраженными психо- и нейротропными свойствами. Обнаружена положительная корреляция между уровнем IL-6 и тяжестью компульсивной симптоматики [16]. Использование IFN?, IL-1?, IL-6 и TNF? в высоких дозах может приводить к развитию симптомов тревоги, психоза [4] и депрессии [14].Вторичные иммунодефициты играют важную роль в патогенезе ЭП заболеваний [1]. Люди, страдающие экстрапирамидными расстройствами, подвержены частым инфекционным заболеваниям, которые протекают, как правило, в тяжелой форме. Этот факт лишний раз подтверждает тесное и, что более важно, двунаправленное взаимодействие между иммунной и нервной системами. Патофизиологические, биохимические и молекулярные основы экстрапирамидных заболеваний различны. При болезни Паркинсона (БП) происходит дегенерация нейронов дофаминергической системы, в первую очередь — нигростриальной. Кроме того, имеется множество данных о наличии иммунологических нарушений у больных БП [6, 10, 13]. Болезнь Вильсона — Коновалова (БВК) является хроническим наследственно-дегенеративным заболеванием, которое характеризуется поражением печени и подкорковых узлов ЦНС. Патогенез этого заболевания связан с генетически обусловленным нарушением обмена меди в организме, вследствие чего наблюдается избыточное накопление меди в различных органах и тканях. Выявлены различные изменения иммунных показателей при БВК [11], которые коррелируют с клиническим течением заболевания и эффективностью лечебных мероприятий. Основной целью настоящего исследования являлось изучение цитокинового каскада у больных ЭП заболеваниями на фоне симптоматического лечения. Поиск специфических для отдельных нозологических форм изменений в иммунной системе является одним из ключевых вопросов нейроиммунологии.

Материалы и методы

Были обследованы 7 больных БП с дрожательной или дрожательно-ригидной формами, 26–38 баллов по шкале UPDRS (средний возраст — 60,1 ± 7,7 лет, длительность заболевания — от 2 до 7 лет), и 9 больных БВК с дрожательной или дрожательноригидной формами по классификации Н.В. Коновалова (средний возраст — 27,5 ± 12,7 лет, длительность заболевания — от 2 до 25 лет). На момент обследования все пациенты проходили курс поддерживающей терапии на базе ГУ НИИ неврологии РАМН и никто не болел острыми распираторно-вирусными заболеваниями. Забор крови проводили пять раз с интервалом в три месяца (I–V точки соответственно). Образцы венозной крови забирали в гепаринизированные стерильные пробирки в утреннее время (9:00–11:00). Для получения сыворотки венозную кровь собирали в чистые сухие пробирки без гепарина.Определение интерферонового статуса проводили биологическим методом по методике, разработанной в отделе интерферонов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи [2]. Определяли продукцию IFN?, индуцируемую вирусом болезни Ньюкасла (NDV); продукцию IFN?; индуцируемую фитогемагглютинином (ФГА); уровень циркулирующего IFN в плазме крови; уровень спонтанно продуцируемого IFN.Тотальную клеточную РНК из мононуклеаров периферической крови людей выделяли гуанидин-тиоцианатным методом с фенол-хлороформной экстракцией [9]. Комплементарную ДНК (кДНК) синтезировали из 2мкг мРНК при 42 °С в течение 1 часа, используя олиго(dT) праймеры и обратную транскриптазу MuLV. Амплификацию кДНК проводили с термостабильной ДНК-полимеразой Thermus aquaticus (5 U/мкл). Использовали олигонуклеотидные праймеры, приводящие к наработке фрагментов кДНК IFN?, IFN?, IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF?. В качестве количественного маркера использовали актиновый ген, одинаково экспрессирующийся во всех тканях. Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 1,5 %-ном агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Концентрацию цитокинов IFN?, IFN?, IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF? в сыворотке крови измеряли иммуноферментным методом с использованием коммерческих реагентов («R&D Systems», USA).Математическую обработку полученных результатов проводили параметрическими и непараметрическими методами статистики с применением статистической программы SigmaStat (SPSS Inc.). Статистическую достоверность (p < 0,05) числовых данных определяли методом ANOVA, категориальных — критерием хиквадрат (?2). При выявлении негауссовского распределения полученных данных, а также при математической обработке ряда параметров (соотношение цитокинов, титры интерферонов при биологическом тестировании) производили логарифмическое преобразование результатов.

Результаты и обсуждение

Накопленные к настоящему времени данные позволяют рассматривать иммунную систему не только как эффекторную физиологическую структуру, но и как внутренний сенсорный орган, распознающий неосознанные стресс-индуцирующие воздействия (вирусы, бактерии, аллергены, и т. д.). Взаимодействие между системами, вовлеченными в стресс-ответ, осуществляется посредством цитокинов и лимфоцит-продуцируемых гормонов, с одной стороны, и нейромедиаторов, с другой. Глубокие взаимосвязи между иммунной, эндокринной и нервной системами привели к появлению новых научных направлений – нейроиммунологии и психонейроиммунологии.Взаимосвязь между психоневрологическим состоянием и повышенной восприимчивостью к заболеваниям уже хорошо известна. Множество исследований показали, что депрессия и другие психические расстройства приводят к подавлению защитных механизмов  [18]. Более того, даже при воздействии различных кратковременных психологических стрессоров (экзамены, тесты) были показаны изменения в продукции цитокинов и снижение иммуннореактивности, приводящие к реактивации латентных вирусных инфекций у обследованных лиц [19]. Сейчас уже хорошо известно, что люди, страдающие экстрапирамидными заболеваниями, подвержены частым инфекционным заболеваниям, которые протекают, как правило, в тяжелой форме. Это является результатом развития вторичных иммунодефицитов, возникающих, очевидно, из-за ряда метаболических нарушений [11].В настоящее время все больше внимания уделяется регуляторной и эффекторной роли цитокинов в развитии различных психоневрологических заболеваний. Отклонения в цитокиновом балансе были продемонстрированы при различных психологических, неврологических и психиатрических заболеваниях.Для оценки состояния иммунологической резистентности у больных экстрапирамидными заболеваниями были проанализированы частота встречаемости экспрессии генов цитокинов и концентрация этих цитокинов в сыворотке крови. Полученные результаты сравнивали с данными, принятыми в качестве международных норм для отдельных показателей. Сравнительный анализ содержания цитокинов в сыворотке крови у больных показал сниженное содержание IFN?, IL-1?, IL-2, IL-6 и IL-10 и повышенное (более чем десятикратно) содержание IL-4, IL-12 и TNF? (рис. 1). Мониторинг содержания цитокинов в сыворотке периферической крови в течение полугода (рис. 2) не показал каких-либо выраженных флуктуаций, связанных с цикличностью, часто наблюдаемой у психоневрологических больных.Анализ экспрессии генов цитокинов в крови больных БП и БВК суммированы в табл. 1 и 2, соответственно. Данные представлены в виде процента случаев положительной экспрессии гена от общего числа исследований. Статистическую достоверность оценивали с использованием критерия ?2. На протяжении всего обследования экспрессия гена IFN? наблюдалась у всех больных БП и БВК. Среди цитокинов Th1-типа статистически достоверные изменения в процессе исследования обнаружены в экспрессии генов IFN? (p = 0,002 для БП и p = 0,007 для БВК) и  IL-12 (p = 0,007 и p = 0,001 для БП и БВК, соответственно). Эти изменения имели разнонаправленный характер. Наблюдалось подавление экспрессии гена  IL-12 в II–V точках, в то время

 

Рис. 1. Уровень содержания цитокинов в сыворотке больных с экстрапирамидными заболеваниями (n = 16)

Данные представлены как процентное отношение к уровням контроля.

Таблица 1 Частота встречаемости экспрессии генов цитокинов у больных болезнью Паркинсона

 

Рис. 2. Уровень содержания цитокинов в сыворотке крови больных болезнью Паркинсона (БП) и болезнью Вильсона — Коновалова (БВК)

Результаты представлены как процент отклонения от нормальных значений.

Примечание к табл. 1–3.  Мониторинг в течение 1 года — пять

раз (I–V) с интервалом три месяца.

Таблица 2 Частота встречаемости экспрессии генов цитокинов у больных болезнью Вильсона — Коновалова

 

как ген  IFN? экспрессировался у всех больных в последней точке обследования. Обнаружено статистически достоверное увеличение частоты выявляемости экспрессии гена  IL-1? у больных БВК в процессе исследования (p = 0,003).Экспрессия генов цитокинов Th2-типа также статистически достоверно изменялась в процессе нашего исследования. Выявлена тенденция к нарастанию частоты экспрессии гена IL-4 (р = 0,003 и р = 0,011 у больных БП и БВК, соответственно). Достоверные колебания обнаружены в экспрессии гена IL-6 (р = 0,045 и р = 0,048).Содержание цитокинов в сыворотке крови оценивали в точках III, IV, и V. Обобщенный анализ данных показал повышенное содержание в сыворотке IL-1?, IL-4, растворимого рецептора IL-4, и IL-12. Содержание IL-2 и IL-6 в сыворотке было сниженным по сравнению с нормальными значениями (см. рис. 2). При использовании двустороннего метода ANOVA было выявлено достоверное снижение содержания IL-6 (5,32 ± 0,32 пг/мл) в последней точке обследования по сравнению с обеими предыдущими точками (7,9 ± 0,75 пг/мл и 9,2 ± 0,9 пг/мл, соответственно). Также достоверное различие в уровне содержания IL-12 было обнаружено в последней точке обследования между группами больных БП (43,60 ± 5,3 пг/мл) и БВК (27,85 ± 1,5 пг/мл). Несмотря на статистическую достоверность, эти изменения следует воспринимать с осторожностью, поскольку они обладают выраженной индивидуальной специфичностью, а не отражают тенденцию всей группы обследованных.

Полученные результаты в определенной мере противоречат данным литературных источников. Повышенное содержание IFN?, IL-6, рецептора IL-1, а также антагониста рецептора IL-1 было показано у больных, страдающих генерализированным депрессивным синдромом [15]. Повышенное содержание IL-10 в плазме было обнаружено у больных шизофренией [8]. Обратная корреляция была обнаружена между тяжестью заболевания (БП) и уровнем IL-6 [17]. В то же время, положительная корреляция была показана между уровнем IL-6 и тяжестью компульсивной симптоматики [16].При обсуждении клинической значимости полученных результатов необходимо учитывать, что литературные данные о продукции и секреции цитокинов при психоневрологических патологиях весьма противоречивы. Большинство авторов сходятся во мнении, что наиболее значимые нрушения при болезни Паркинсона происходят в секреции монокинов, а именно IL-1?, IL-6, и TNF?. Однако описывается как уменьшение митогениндуцированной продукции этих цитокинов [12], так и увеличение, когда митоген-индуцированная секреция IL-2 была достоверно снижена у больных болезнью Паркинсона, а секреция IL-1?, IL-6 и TNF? достоверно увеличена [6]. Повышение уровня IL-6 наблюдалось у больных БП, осложненной выраженным депрессивным синдромом как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с больными БП без депрессии [3]. В работе Blum-Degen D. et al. [7] было показано, что уровень содержания IL-1, IL-6 и IL-2 в плазме крови больных болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона не отличался от значений контрольной группы. В то же время, в работе Kluter H. et al. [13] было показано, что митоген-индуцированная секреция IL-2 была достоверно снижена у больных болезнью Паркинсона, а секреция IFN?2, IFN?, IL-2 и рецептора IL-6 не отличалась от значений контрольной группы. Противоречивость данных литературы, очевидно, можно объяснить различиями в методических подходах, длительности заболевания, сезонности обследований, социальных особенностях обследованного контингента и, конечно, различиями в схемах лечения. В своей работе Kluter H. et al. [13] отмечают, что при сравнимости уровней IFN?, IFN?, IL-6 и рецептора IL-2 в группе больных БП и здоровых доноров митоген-индуцированная секреция IL-2 была существенно cнижена в группе больных и обратно коррелировала с дозой леводопы и существенно коррелировала (p < 0,002) с приемом амантадина. В другой работе для оценки роли леводопы мононуклеары больных БП и здоровых доноров были инкубированы с концентрацией лекарства, соответствующей дозам, используемым на практике. При этом было показано, что леводопа ингибирует митоген-индуцированную пролиферацию, стимуляцию IL-6 и TNF?, но не влияет на секрецию IL-1? и IL-2 [6].

 

Рис. 3. Состояние противовирусного иммунитета больных, страдающих экстрапирамидными заболеваниями

Данные представлены как логарифмы (log2 для сывороточного IFN и log10 для IFN?) титров.

Необходимость поиска путей по предотвращению развития, а также лечения уже развившихся стресс-индуцированных вторичных иммунодефицитов у больных с ЭП заболеваниями не вызывает сомнения. При этом необходимо помнить, что использование иммуномодуляторов с выраженым цитокин-индуцирующим действием не является оптимальным, поскольку большинство цитокинов обладают выраженным психо- и нейротропными свойствами, вызывая симптомы тревоги, психоза, и депрессии [4, 14]. Особенно это касается интерферонов, которые играют ключевую роль в противовирусном иммунитете. Интерфероновый статус больных оценивали по уровню содержания сывороточных противовирусных факторов крови в нестимулированных, NDV- и ФГА-стимулированных культурах клеток крови. У всех обследованных больных уровень содержания NDV-индуцированного (IFN?) интерферона был снижен по сравнению с нормами, разработанными для этих параметров в отделе интерферонов ГУ НИИЭМ [2] (рис. 3). Содержание ФГА-стимулированного интерферона (IFN?) клетками крови больных БП и БВК находилось в пределах нормального разброса только в I и II точках исследования. В дальнейшем (III-V точки) наблюдалось достоверное снижение (р < 0,05) продукции IFN? иммуноцитами больных как БП, так и БВК (табл. 3).Обнаруженная в нашем исследовании очень низкая способность иммуноцитов к продукции IFN? in vitro при нормальных уровнях экспрессии генов и концентрации IFN? в сыворотке крови больных ЭП заболеваниями позволяет предполагать нарушение противовирусного звена иммунитета на посттрансляционном уровне. Возможно, именно поэтому применение индукторов интерферона, стимулирующих продукцию эндогенного гликопротеина, для коррекции состояния иммунной системы у этих больных может быть более эффективно, чем использование рекомбинантных форм интерферона.

Таблица 3 Титры интерферонов в системе in vitro у больных БП и БВК

 

Примечание.   Результаты представлены как M ± m антилогарифмов титров. Статистические

сравнения:

a — достоверно отличается от точки I;

b — достоверно отличается от точки II.

ЛИТЕРАТУРА

1.  Ганнушкина И.В., Жирнова И.Г., Торопова Н.Г. и др. Количественное изучение Т- и В-систем иммунитета при различных наследственных заболеваний нервной системы // Ж. невропатол. психиатр. им. С.С. Корсакова. — 1981 — Т. 81, № 7. — С. 1009–1013.

2.   Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина, 1996. –240 с.

3.  Селихова М.В., Кушлинский Н.Е., Любимова Н.В. и др. Нарушения продукции интерлейкина-6 в сыворотке крови больных болезнью Паркинсона // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2002. — Т. 133, № 1. — С. 94–97.

4.  Asnis G.M., De la Garza R., 2nd, Kohn S.R. et al. IFN-induced depression: a role for NSAIDs // Psychopharmacol Bull. — 2003. — Vol. 37, № 3. — P. 29–50.

5.  Besedovsky H.O., del Rey A. The cytokine-HPA axis feed-back circuit // Zh. Rheumatol. — 2000. — Vol. 59, Suppl 2. — P. II/26–30.

6.  Bessler H., Djaldetti R., Salman H. et al. IL-1 beta, IL-2, IL-6 and TNF-alpha production by peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson’s disease // Biomed. Pharmacother. — 1999. — Vol. 53, № 3. — P. 141–145.

7.  Blum-Degen D., Muller T., Kuhn W. et al. Interleukin-1 beta and interleukin-6 are elevated in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s and de novo Parkinson’s disease patients // Neurosci. Lett. — 1995. — Vol. 202, № 1–2. — P. 17–20.

8.  Chiavetto L.B., Boin F., Zanardini R. et al. Association between promoter polymorphic haplotypes of interleukin-10 gene and schizophrenia // Biol. Psychiatry. — 2002. — Vol. 51, № 6. — P. 480–484.

9.  Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162, № 1. — P. 156–159.

10. Fiszer U. Does Parkinson’s disease have an immunological basis? The evidence and its therapeutic implications // BioDrugs. — 2001. — Vol. 15, № 6. — P. 351–355.

11. Gannuszkina J.W., Zyrnowa J.G., Toropowa N.G. et al. [T and B immune systems in hereditary extrapyramidal disorders] // Neurol Neurochir Pol. — 1981. — Vol. 15, № 4. — P. 387–391.

12. Hasegawa Y., Inagaki T., Sawada M. et al. Impaired cytokine production by peripheral blood mononuclear cells and monocytes/macrophages in Parkinson’s disease // Acta Neurol. Scand. — 2000. — Vol. 101, № 3. — P. 159–164.

13. Kluter H., Vieregge P., Stolze H. et al. Defective production of interleukin-2 in patients with idiopathic Parkinson’s disease // J. Neurol. Sci. — 1995. — Vol. 133, № 1–2. — P. 134–139.

14. Maddock C., Baita A., Orru M.G. et al. Psychopharmacological treatment of depression, anxiety, irritability and insomnia in patients receiving interferonalpha: a prospective case series and a discussion of biological mechanisms // J. Psychopharmacol. — 2004. — Vol. 18, № 1. — P. 41–46.

15. Maes M., Bosmans E., De Jongh R. et al. Increased serum IL-6 and IL-1 receptor antagonist concentrations in major depression and treatment resistant depression // Cytokine. — 1997. — Vol. 9, № 11. — P. 853–858.

16. Maes M., Meltzer H.Y., Bosmans E. Psychoimmune investigation in obsessivecompulsive disorder: assays of plasma transferrin, IL-2 and IL-6 receptor, and IL-1 beta and IL-6 concentrations // Neuropsychobiology. — 1994. — Vol. 30, № 2–3. — P. 57–60.

17. Muller T., Blum-Degen D., Przuntek H. et al. Interleukin-6 levels in cerebrospinal fluid inversely correlate to severity of Parkinson’s disease // Acta Neurol. Scand. — 1998. — Vol. 98, № 2. — P. 142–144.

18. Tecoma E.S., Huey L.Y. Psychic distress and the immune response // Life Sci. — 1985. — Vol. 36, № 19. — P. 1799–1812.

19. Uchakin P.N., Tobin B., Cubbage M. et al. Immune responsiveness following academic stress in first-year medical students // J. Interferon Cytokine Res. — 2001. — Vol. 21, № 9. — P. 687–694.

 Cytokine balance in patients with Parkinson and Wilson — Konovalov diseasesO.N. Uchakina, P.N. Uchakin, M.V. Mezentseva, A.V. Karabanov, V.V. Poleschuk, .A. Ivanova-Smolenskaya, F.I. Yershov

N.F. Gamaleya State Research Institute of Epidemiology and Microbiology RAMS;  State Research Institute of Neurology RAMS, Moscow, Russia;  Mercer University School of Medicine, Macon, GA, USA

The problem of neurological diseases among elderly and middle-aged people becomes more and more significant and important with the constant increase of the lifespan and increasing stress related to advancing technology. Secondary immune deficiencies often correlate with different neurological and psychiatric diseases. The main purpose of this study was to investigate cytokine cascade in patients with Parkinson’s and Wilson — Konovalov’s diseases receiving regular treatment.In both groups of patients, plasma levels of IFN?, IL-1?, IL-2, IL-6, and IL-10 were significantly lower while concentrations of IL-4, IL-12, and TNF? higher compared to normal levels of healthy donors. Additionally, we observed significant differences in gene expression of Th1 (IFN? and IL-12) and Th2 (IL-4, IL-6) cytokines as measured by RT-PCR technique. Blood cell’s production of IFN? in vitro was dramatically suppressed in both groups of patients though gene expression of IFN? and its plasma level were near normal. The data suggests suppression of antiviral immunity at post-translation level. For this reason, the use of interferon-inducers for stimulation of endogenous interferon production would be more effective than the use of recombinant interferons for immuno-correction in neurological and psychiatric patients. (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 3. P. 63–68.)

Key words: neurodegeneration, extrapyramidal disease, interleukins, interferon.

 



загрузка...