ЗАО «Вектор-Бест», п. Кольцово, Новосибирская обл.;
МУЗ Городская клиническая больница № 1, г. Новосибирск
Синдром воспалительного ответа плода (FIRS — fetal inflammatory response syndrome) определяется как субклиническое состояние, при котором часто происходят преждевременные роды и преждевременное излитие околоплодных вод. Развитие и степень выраженности FIRS зависит от уровней экспрессии как про-, так и противовоспалительных цитокинов. Микробное поражение плода и другие патогенные факторы, приводящие к развитию FIRS, могут вызвать полиорганную недостаточность, септический шок и внутриутробную гибель плода. Раннее выявление FIRS позволяет своевременно прервать его развитие путем родоразрешения либо проведением антибактериальной или противовоспалительной патогенетической терапии. Целью работы было сравнительное изучение содержания цитокинов в сыворотке крови беременных, плодов и околоплодных водах у пациенток с осложненным течением беременности, при благоприятном (группа I) и неблагоприятном (группа II) перинатальных исходах родов. Обследовано 30 беременных, которым по различным показаниям для проведения пренатальной диагностики был выполнен кордоцентез. Концентрации цитокинов и иммуноглобулинов (TNF?, INF?,
IL-8, IL-1?, IL-4, INF?, IL-18, IL-6, IL-1Ra, IgG, IgA, IgE,) определяли с помощью соответствующих наборов реагентов для иммуноферментного анализа производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). При исследовании сыворотки крови плодов в группе II были определены более высокие уровни цитокинов IL-6 и IL-18 (рU = 0,03 и рU = 0,006 соответственно) по сравнению с группой I. Выявленная повышенная концентрация цитокинов IL-6 и IL-18 во 2-м триместре беременности у плодов, которые в последующем имели неблагоприятный перинатальный исход, свидетельствует о развитии FIRS. IL-6
и IL-18 являются перспективными маркерами для своевременной лабораторной диагностики FIRS. (Цитокины и воспаление. 2007. Т. 6, № 4. С. 42–47.)
Синдром воспалительного ответа плода (FIRS — fetal inflammatory response syndrome) определяется как субклиническое состояние, при котором часто происходят преждевременные роды и преждевременное излитие околоплодных вод. Микробное поражение плода и другие патогенные факторы, приводящие к развитию FIRS, могут вызвать полиорганную недостаточность, септический шок и внутриутробную гибель плода [4, 9]. Гистологическими маркерами FIRS являются фуникулит и воспалительные изменения сосудов ворсин хориона. У новорожденных с фуникулитом отмечается более высокий процент таких осложнений, как неонатальный сепсис, бронхопульмональная дисплазия, детский церебральный паралич. Поэтому при наличии признаков воспалительных изменений в амниотической полости значительно ухудшается прогноз для новорожденного, даже если прямые признаки интраамниальной инфекции не проявляются [5]. преждевременным родам обычно приводит восходящая инфекция, поражающая плодные оболочки. При гематогенной диссеминации возбудителя или при FIRS неинфекционной этиологии (аллоиммунизация) преждевременные роды не развиваются, несмотря на патологические процессы в органах и тканях плода [4].В норме в амниотической жидкости присутствует очень мало клеток (около 2 лейкоцитов в 1 мм3), которые имеют плодное происхождение. При развитии FIRS их количество значительно возрастает, достигая более 1 000 клеток/мм3 [5]. Это приводит к интенсивному синтезу провоспалительных цитокинов и увеличению их концентрации в амниотической жидкости. Следует отметить, что в этом случае установлено также повышенное, более 11 пг/мл, содержание интерлейкина 6 (IL-6) в плазме плода [4, 9]. Увеличение уровня IL-6 обусловливает многие биохимичес-кие, физиологические и иммунологические изменения в организме плода, включая стимуляцию синтеза ряда белков острой фазы, активацию Т- и NK-клеток, а также тканевые повреждения. У плодов с высоким уровнем IL-6 отмечается маловодие, что связывают с сердечной дисфункцией и гипотензией, а также значительно увеличивается частота внутрижелудочковых кровоизлияний и перивентрикулярной лейкомаляции [4].В исследовании M.V. Zaretsky et al. показана возможность двустороннего трансплацентарного трансфера IL-6 [13]. Это, по мнению авторов, позволяет понять, почему у беременных с системными воспалительными реакциями при развитии FIRS могут происходить полиорганные поражения плода и такие осложнения, как поздний выкидыш и преждевременные роды. Провоспалительные цитокины IL-1 и TNF? не способны преодолеть плацентарный барьер, вместе с тем считается, что они способствуют более интенсивному транспорту IL-6 через плаценту [13].В целом, развитие воспалительного ответа и степень выраженности FIRS зависит от уровней экспрессии как про-, так и противовоспалительных цитокинов, которая детерминирована генетически. E.M. Speer et al. описали некоторые полиморфные варианты генов IL-6, TNF?, IL-10, которые обусловливают синтез провоспалительных цитокинов в избыточной концентрации при
недостаточной экспрессии противовоспалительных цитокинов, что ведет к развитию амниальной инфекции и преждевременным родам [11]. Высокая противовоспалительная активность колоплодных вод — физиологическая норма, а одним из важнейших факторов устойчивости плодного яйца к воздействию воспалительных агентов является IL-10 [8]. Интраамниальное же введение беременной мыши IL-1? и TNF? приводит к преждевременным родам [10]. Установлено, что концентрация IL-16, обладающего, как иIL-6, плейотропными свойствами, повышается в околоплодных водах при микробной инвазии амниотической полости, но не в случае преждевременных родов, вызванных другими причинами [3].Раннее выявление FIRS позволяет своевременно прервать его развитие путем родоразрешения либо проведением антибактериальной или противовоспалительной патогенетической терапии. Поэтому актуальность исследований, направленных на поиск надежных маркеров для лабораторной диагностики FIRS, несомненна. Цель настоящей работы ? сравнительное изучение содержания цитокинов всыворотке крови беременных, плодов и околоплодных водах в группах пациенток с осложненным течением беременности, при благоприятном и неблагоприятном перинатальных исходах родов.
Материалы и методы
Обследовано 30 беременных, которым по различным показаниям для проведения пренатальной диагностики был выполнен кордоцентез. Его проводили в операционной родильного дома методом «свободной руки», двухигольным способом, используя иглы 18G и 22G, под ультразвуковым контролем и местной анестезией. С токолитической целью внутривенно вводили гинипрал. Параллельно у беременной брали пробы околоплодных вод и крови из кубитальной вены. В результате генетического исследования у всех обследованных плодов определен нормальный кариотип. В зависимости от течения беременности и состояния плода все обследованные пациентки были разделены на две группы (табл. 1). Группа I состояла из 12 женщин с отсутствием какихлибо значительных отклонений в развитии плода, по данным пренатального обследования, благоприятным исходом родов для плода и физиологическим течением раннего неонатального периода. В группу II вошли 18 пациенток с осложненным течением беременности, неблагоприятным перинатальным исходом родов для плода и патологическим течением раннего неонатального периода: 5 случаев тяжелой гемолитической болезни плода, требующих внутриутробных и постнатальных трансфузий; 2 — вторичного серопозитивного сифилиса (у одного из плодов вентрикуломегалия); 3 — с врожденными пороками развития плода: атрезией двенадцатиперстной кишки, синдромом Арнольда-Киари, транспозицией магистральных артерий; 1 — с острым многоводием; 1 — с синдромом задержки развития плода II степени; 1 — с острым
Таблица 1 Показания к кордоцентезу в группах сравнения
Примечание. а — Физиологическая незрелость, б — заболевания ЦНС у беременной и врожденные пороки развития плода. гайморитом, фронтитом у беременной, требующим интенсивной антибактериальной терапии;2 — с гистологически подтвержденным плацентитом; 1 — с вентрикуломегалией; 1 — с наркотической зависимостью; 1 — с морфологическими признаками внутриутробной инфекции у плода (беременность прервана по медицинским показаниям в связи с заболеванием ЦНС у беременной). По основным клиническим показателям две группы обследованных беременных были сопоставимы и различались только по количеству аномалий, выявленных при ультразвуковом исследовании плода (табл. 2).
Пороки развития верифицированы при морфологическом исследовании абортусов. Патоморфологические исследования плодов и последов выполняли на базе отделения патологической анатомии МУЗ Городской клинической больницы № 1 г. Новосибирска. Концентрации цитокинов и иммуноглобулинов (TNF?, INF?, IL-8, IL-1?, IL-4, INF?, IL-18, IL-6, IL-1Ra, IgG, IgA, IgE) определяли с помощью соответствующих наборов реагентов для иммуноферментного анализа производства ЗАО «ВекторБест» (г. Новосибирск). Околоплодные воды перед проведением анализа соединяли с равным объемом фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего 0,5 % Тритона Х-100, и тщательно перемешивали. Полученные препараты осветляли центрифугированием при
Таблица 2 Общая характеристика беременных в группах сравнения
18000 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость использовали для постановки анализа, полученный результат умножали на 2.
Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы Statistica 6.0. Данные представлены в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (SE). Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона — Манна — Уитни (рU). Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера (рТМФ)
.Результаты и обсуждение
Как показали результаты проведенного исследования, содержание цитокинов и иммуноглобулинов в сыворотке крови и амниотической жидкости у беременных с осложненным течением беременности, неблагоприятным перинатальным исходом родов для плода и патологическим течением раннего неонатального периода (группа II) не имело достоверных различий от группы, включающей беременных с отсутствием значительных отклонений в развитии плода, благоприятным исходом родов и нормальным течением раннего неонатального периода (группа I). При этом была отмечена высокая концентрация противовоспалительного цитокина IL-1Ra в околоплодных водах у всех беременных, и, хотя его уровни в группе I были в 1,5 раза выше, чем в группе II, это различие не было достоверным (р = 0,18).
Ранее было показано, что у женщин с осложненным амниальной инфекцией течением беременности и преждевременными родами наблюдаются повышенные уровни провоспалительных цитокинов (IL-6, G-CSF) [6]. Однако полученные экспери-ментальные данные свидетельствуют о том, что, хотя в обеих группах концентрация IL-6 в сыворотке крови и амниотической жидкости была значительно повышена, это статистически значимо не оказало влияния на исход родов. При исследовании сыворотки крови плодов в группе II были определены более высокие уровни цитокинов IL-6 и IL-18 (рU = 0,03 и рU = 0,006, соответственно), по сравнению с группой I (табл. 3). О повышении уровня ряда цитокинов, в том числе IL-6, при неблагополучном течении беременности (преждевременные роды ипреждевременное излитие околоплодных вод), а также при выявленной внутриутробной инфекции сообщалось ранее [4, 9]. Однако в эти исследования не было включено определение плейотропного цитокина IL-18, который не только стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов (INF?, TNF?, IL-1, IL-2), но и является мощным фактором ангиогенеза [2, 7]. Известно, что содержание ангиогенных факторов, в частности ангиогенина, в околоплодных водах во втором триместре беременности значительно повышается у тех женщин, беременность которых в последующем завершилась преждевременными родами [12]. Высокий уровень факторов ангиогенеза, очевидно, связан с неоангиогенезом — компенсаторным процессом, развивающимся при недостаточности плаценты, которая может быть обусловлена различными причинами. Таким образом, выявленная нами повышенная концентрация цитокинов IL-6 и IL-18 во втором триместре беременности у плодов, которые в последующем имели неблагоприятный перинатальный исход, очевидно, свидетельствует о том, что в период данного обследования у беременных уже развился FIRS.При измерении основных классов иммуноглобулинов в образцах сыворотки крови плодов группы II в целом были определены более низкие их уровни, чем в группе I. Однако достоверные отличия были зарегистрированы только в отношении IgE (рU = 0,02). В более ранних работах высказывалось предположение, что это может быть связано с развитием у плода иммунной недостаточности на уровне гуморального звена иммунитета при его инфекционном поражении, пороках развития и иммунном конфликте [1].В результате сравнительного определения содержания цитокинов и иммуноглобулинов в
Таблица 3 Уровни цитокинов и иммуноглобулинов в сыворотке крови у плодов
в группах сравнения, М ± SE
Таблица 4 Уровни цитокинов и иммуноглобулинов в околоплодных водах и сыворотке крови беременных
и плодов группы II, М ± SEсыворотке крови плода, беременной и околоплоных вод пациентов группы II было установлено, что концентрация таких цитокинов, как TNF?, IL-8, IL-18, IL-1Ra во всех исследованных средах значительно отличается (табл. 4). Это позволяет сделать вывод об устойчивости плацентарного барьера к проникновению этих белков.Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что при развитии FIRS IL-6 и IL-18 обнаруживаются в сыворотке крови плода, имеющего впоследствии неблагоприятный перинатальный исход, в высоких концентрациях уже во втором триместре беременности, т. е. в то время, когда какие-либо манифестные клинические признаки неблагополучного течения беременности у данных женщин отсутствовали. Очевидно, что IL-6 и IL-18 могут оказаться перспективными маркерами для своевременной лабораторной диагностики FIRS, но для этого, несомненно, требуется проведение дальнейших исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Останин А.А., Макогон А.В., Леплина О.Ю. и др. Показатели иммунитета плода в ранней диагностике внутриутробной инфекции // Мед. иммунол. — 2001. — Т. 3, № 4. — С. 515–524.
2. Система цитокинов: Теоретические и клинические аспекты / Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова. — Новосибирск: Наука, 2004. — С. 125–140.
3. Athayde N., Romero R., Maymon E. et al. Interleukin 16 in pregnancy, parturition, rupture of fetal membranes, and microbial invasion of the amniotic cavity// Am. J. Obstet. Gynecol. — 2000. — Vol. 182, № 1, pt. 1. — P. 135–141.
4. High Risk Pregnancy: Management Options / Ed. James D.K. — Elsevier Inc., 2006. — P. 590–591.
5. Lee S.E., Romero R., Kim C.J. et al. Funisitis in term pregnancy is associated with microbial invasion of the amniotic cavity and intra-amniotic inflammation// J. Matern. Fetal Neonatal Med. — 2006. — Vol. 19, № 11. — P. 693–697.
6. Murtha A.P., Sinclair T., Hauser E.R. et al. Maternal serum cytokines in preterm premature rupture of membranes // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2007. — Vol. 109, № 1. — P. 121–127.
7. Puren A.J., Fantuzzi G., Gu Y. et al. Interleukin-18 (IFNgamma-inducing factor) induces IL-8 and IL-1beta via TNFalpha production from non-CD14 + human blood mononuclear cells // J. Clin. Invest. — 1998. — Vol. 101, № 3. — P. 711–721.
8. Robertson S.A., Skinner R.J., Care A.S. Essential role for IL-10 in resistance to lipopolysaccharide-induced preterm labor in mice // J. Immunol. — 2006. — Vol. 177, № 7. — P. 4888–4896.
9. Romero R., Espinoza J., Goncalves L.F. et al. The role of inflammation and infection in preterm birth // Semin. Reprod. Med. — 2007. — Vol. 25, № 1. — P. 21–39.
10. Sadowsky D.W., Adams K.M., Gravett M.G. et al. Preterm labor is induced by intraamniotic infusions of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-alpha but not by interleukin-6 or interleukin-8 in a nonhuman primate model // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2006. — Vol. 195, № 6. — P. 1578–1589.
11. Speer E.M., Gentile D.A., Zeevi A. et al. Role of single nucleotide polymorphisms of cytokine genes in spontaneous preterm delivery // Hum. Immunol. — 2006. — Vol. 67, № 11. — P. 915–923.
12. Spong C.Y., Ghidini A., Sherer D.M. et al. Angiogenin: a marker for preterm delivery in midtrimester amniotic fluid // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1997. — Vol. 176, № 2. — P. 415–418.
13. Zaretsky M.V., Alexander J.M., Byrd W., Bawdon R.E. Transfer of inflammatory cytokines across the placenta // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2004. — Vol. 103, № 3. — P. 546–550.
Joint Stock Company «Vector-Best», Novosibirsk; 1st Municipal Hospital, Novosibirsk
The fetal inflammatory response syndrome (FIRS) was coined to define a subclinical condition originally described in fetuses of women presenting with preterm labor and intact membranes as well as those presenting with preterm rupture of membrane. Fetal microbial invasion or other insults result in a systemic fetal inflammatory response that can progress toward multiple organ dysfunction, septic shock, and perhaps death in the absence of timely delivery. Three approaches can be used to interrupt the course of FIRS: 1 — delivery; 2 — antimicrobial treatment of women in whom the FIRS is due to microbial invasion of susceptible bacteria; and 3 — administration of agents that down-regulate the inflammatory response. The aim of the study: comparative analysis of the cytokine levels in the plasma of pregnant women, fetal plasma and amniotic fluid in two groups of patients with complicated pregnancy: with favorable (group 1) and unfavorable (group 2) outcomes for neonates. 30 pregnant women were included in the study. Cordocentesis had been executed with the different indications. The cytokines and immunoglobulins concentrations (TNF?, INF?, IL-8, IL-1?, IL-4, INF?, IL-18, IL-6, IL-1Ra, IgG, IgA, IgE) were determined with
the reagents of «Vector-Best» (Novosibirsk). Levels of IL-6 and IL-18 in the fetal blood were higher in group 2 compared to group 1 (pU = 0,03 and рU = 0,006 accordingly). The heightened fetal blood IL-6 and IL-18 concentrations in the second trimester of pregnancy testifies the development of FIRS (Cytokines and Inflammation. 2007. Vol. 6, № 4. P. 42–47.)
