Н.И. Шарова, М.М. Литвина, С.В. Шевелев, А.Х. Дзуцев, А.А. Ярилин Институт иммунологии Минздрава России, Москва Выработка интерферона ? и интерлейкина тимоцитами человека in vitro
Н.И. Шарова, М.М. Литвина, С.В. Шевелев, А.Х. Дзуцев, А.А. Ярилин Институт иммунологии Минздрава России, Москва Выработка интерферона ? и интерлейкина тимоцитами человека in vitro
Примерно каждый четвертый тимоцит, выделенный из тимуса детей первого года жизни, содержит в цитоплазме IFN?, а каждый шестой — IL-4. Часть тимоцитов несет указанные цитокины на своей поверхности. IFN? присутствует в основном в зрелых тимоцитах, а также в CD4CD8 клетках предшественниках, а IL-4 — в незрелых клетках фенотипов CD4CD8 и CD4+CD8+. Культивирование тимоцитов в течение суток без активаторов приводит к снижению числа цитокин содержащих клеток (за одним исключением: повышается доля IFN?+ CD4+CD8+ клеток), что, вероятно, обусловлено деградацией цитокинов внутри клеток. Активация тимоцитов путем культивирования в течение 1 сут. в присутствии форболмиристатацетата (ФМА) и иономицина не влияла начисленность IFN? и IL-4клеток. Однако контакт тимоцитов с тимусными эпителиальными клетками значительно повышал число IL-4 клеток, а при дополнительном действии ФМА и иономицина —также IFN? клеток.Ключевые слова: тимоциты человека, продукция цитокинов, IFN?, IL-4.Как известно, интерферон ? (IFN?) и интерлейкин 4 (IL-4) являются ключевыми цитокинами, продуцируемыми Т хелперными клетками типов Th1 и Th2 [11], и по своему биологическому действию во многих отношениях выступают в качестве антагонистов. Сказанное в полной мере проявляется в периферическом отделе иммунной системы при выработке этих цитокинов стимулированными зрелыми Т лимфоцитами. Условия образования этих цитокинов в тимусе существенно иные.
Это обусловлено прежде всего двумя обстоятельствами:
1) тимоциты представляют собойсмесь Т клеток, находящихся на разных стадияхразвития, причем на долю зрелых клеток приходится всего около 15 % от их числа;
2) в норме развитие иммунного ответа в тимусе практически невозможно в связи с особенностями его структуры, клеточного состава и ограниченным поступлением антигенов в его внутреннюю среду. По скольку в тимусе отсутствуют условия для физиологической стимуляции Т клеток, выработка цитокинов здесь подчиняется другим закономерностям, чемв периферическом отделе иммунной системы.
Тем не менее, известно, что тимоциты образуют ряд цитокинов, включая IFN? и IL-4, однако условия их выработки и проявления биологических эффектов в тимусе существенно иные, чем на периферии иммунной системы. Уже самые юныетимоциты фенотипа CD3CD4CD8 способны продуцировать небольшие количества цитокинов,причем для выработки IFN? требуется стимуляция этих клеток (например, смесью форболовогоэфира и кальциевого ионофора [13]), тогда как выработка IL-4 индуцируется даже простым контактом с тимусными эпителиальными клетками(ТЭК) [5]. При дальнейшем созревании тимоцитовв CD4+CD8 клетки способность экспрессировать гены цитокинов блокируется [14]. Лишь после успешного осуществления положительной селекциии перехода со стадии CD3lo на стадию CD3hi способность клеток вырабатывать IFN? восстанавливается [11]. В то же время сообщалось о том, что выработка IL-4 при этом, наоборот, ослабляется[2]. Показано, что и в зрелых CD4+CD8 тимоцитах с большей легкостью удается индуцировать синтез IL-4, чем IFN?: для выработки ими IL-4 необходимо воздействие на Т клеточный рецептор (например, моноклональными антителами кCD3) в сочетании с костимуляцией антителами к CD28 или действием форболмиристатацетата(ФМА), тогда как для индукции выработки IFN? дополнительно требуется действие IL-12 [6, 12]. С другой стороны, СD4СD8+ тимоциты при активации через CD3/TCR и костимуляции секретируют IFN?, а для индукции выработки IL-4 требуется дополнительное действие самого IL-4 [11].Приведенные данные получены преимущественно путем оценки экспрессии мРНК соответствующих цитокинов или определения секретируемого цитокина в культуральном супернатантетимоцитов (практически исключительно мышиных) с помощью иммуноферментного метода. Между тем при изучении выработки цитокиновпериферическими Т лимфоцитами очень продуктивным подходом оказалось определение цитокинпродуцирующих клеток путем цитофлуорометрического выявления цитокинов в их цитоплазме в условиях блокады процесса транспорта и, следовательно, секреции белков [4].Мы применили данный подход к анализу способности тимоцитов человека продуцировать IFN?и IL-4 при их культивировании в условиях стимуляции или при контакте с ТЭК, в частности, нафоне блокады синтеза РНК или транспорта белков. При этом обнаружились существенные отличия условий выработки и секреции этих цитокинов тимоцитами от условий их образования зрелыми периферическими Т лимфоцитами.
Материалы и методы Тимоциты получали из фрагментов тимуса детей первого года жизни; фрагменты тимуса иссекали во время операций по поводу врожденных пороков сердца (Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева, Москва) в соответствии с принятой операционной тактикой. Из первичной культуры тимусных фрагментов получали ТЭК, подвергавшиеся перед исследованием 3–4 пассажам in vitro [1].Тимоциты фракционировали с использованием наборов магнитных шариков «CD8 Positive Isolation Kit» и «CD4 PositiveIsolation Kit» (Dynal) по стандартной методике, предложенной фирмой производителем. Для этого суспензию тимоцитов добавляли к магнитным шарикам в соотношении 1:4 и в течение 20 мин инкубировали при 4°С. Затем суспензию клеток помещали в магнитное поле, в котором и осуществлялось разделение клеток. После выделения клетки освобождали от шариковс помощью энзиматической обработки. Для получения CD4+CD8+процедуру селекции клеток на шариках осуществляли дважды. После отмывок фракции тимоцитов использовали в опытах. Тимоциты культивировали в течение суток в концентрации1 ? 106 в мл в питательной среде RPMI c добавлением эмбриональной сыворотки (Flow; 10 %), Lглутамина (Flow;300 мкг/мл) и HEPES буфера (Sigmа; 0,02 М). В опытах с сокультивированием клеток тимоциты наслаивали на монослойадгезивного эпителия [10].Для активации клеток их инкубировали в течение суток вприсутствии форболмиристатацетата (ФМА, Sigma; 10 нг/мл)и иономицина (Sigma; 2 мкМ) в присутствии GolgiPpug (BeсtonDickinson; 1 мкг/мл). Для определения в тимоцитах внутриклеточных цитокинов[4] использовали соответствующие МонАТ и проточную лазерную цитометрию. В работе использовали МонАТ к INF?, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, и МонАТ к IL-4, мечены ефикоэритрином (Caltag). Тимоциты фиксировали 2 % ным параформальдегидом в течение 20 мин при температуре 4°С,затем пермеабилизировали 0,5 % ным сапонином 20 мин при4°С. Не отмывая от сапонина, добавляли МонАТ в количестве,рекомендованном фирмой производителем. Клетки отмывали забуференным физиологическим раствором, рН 7,4, с 2 % сапонина и 1 % BSA. При определении мембранных цитокиновпермеабилизацию клеток сапонином не проводили. Анализ образцов осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson) с аргоновым лазером (длина волны 488 нм) на основе определения четырех параметров:малоуглового светорассеяния (FCS) и бокового светорассеяния (SSC) и двух показателей флуоресценции — зеленой (флуоресцеин изотиоцианат — ФИТЦ — 530 нм) и оранжевой (фикоэритрин — ФЭ — 585 нм). В координатах FCS и SSC вычленяли гейт тимоцитов (мелкие клетки со слабой гранулярностью) ианализировали их одновременно на наличие зеленой и оранжевой флуоресценции для выявления клеток, содержащих INF?и IL-4.
Результаты и обсуждение
Сведения о численности тимоцитов, в которых без какихлибо активирующих воздействий и без подавления внутриклеточного транспорта белков выявляются внутриклеточные IFN? и IL-4, представлены в табл. 1. В ней отражены сведения очисленности цитокин содержащих клеток сразу после суспендирования тимоцитов и после их культивирования в течение 1 сут. Здесь же представлены данные о численности тимоцитов, содержащих IFN? и IL-4 на своей поверхности. Все этирезультаты получены при изучении клеток тимуса детей в возрасте 1 года без патологии иммунной системы. Если по данным определения внутриклеточныхцитокинов в свежевыделенных тимоцитах содержание IFN?+ клеток несколько превосходит численность IL-4 клеток, то на поверхности тимоцитов, наоборот, чаще выявляется IL-4. Культивирование в течение 1 сут. приводит к 2кратномуснижению численности клеток, содержащих внутриклеточный IFN?, и к 4кратному снижению содержания клеток, содержащих IL-4.Фракционирование на магнитных бусах, нагруженных моноклональными антителами к CD4 иСD8, позволило оценить распределение тимоцитов, содержащих внутриклеточные цитокины, по основным субпопуляциям. Данные отражены в табл. 2.В популяции свежевыделенных тимоцитов IFN? + клетки сосредоточены довольно равномерно во всех фракциях, кроме фракции CD4CD8 клеток, в которой они практически отсутствуют. Наибольшее количество IFN? клеток сосредоточено во фракции CD4+CD8 тимоцитов. Последствием культивирования явилось почти полное исчезновение IFN? из клеток фракции CD4CD8 и,наоборот, его появление в значительной части CD4+CD8+ клеток.
Таблица 1 Процентное содержание тимоцитов, содержащих внутриклеточныеи мембранные цитокины, по данным исследования ex vivo и после суточного культивирования (M ± m; n = 5)
Примечание. Н.д. — нет данных.
Таблица 2 Распределение клеток, содержащих цитокины в цитоплазме, пофракциям тимоцитов
Примечание. Здесь и в табл. 3 и 4 представлены результаты типичного эксперимента.
Таблица 3 Оценка эффекта активации клеток и роли экспрессии цитокиновыхгенов de novo, а также секреторного процесса в накоплении IFN? иIL-4 в тимоцитах (длительность культивирования — 1 сут.)
Примечание. К — контроль, БфА — брефелдин А, АктD — актиномицин D.
Таблица 4 Влияние сокультивирования тимоцитов с ТЭК на экспрессиювнутриклеточных цитокинов
Во фракциях зрелых тимоцитов число IFN? клеток снизилось в 2,5–3 раза. IL-4до культивирования обнаружен в CD4CD8 иCD4+CD8+ тимоцитах; он практически отсутствует во фракциях зрелых тимоцитов. После культивирования он исчезает из большей части CD4 CD8 и CD4+CD8+ тимоцитов и не появляется в зрелых тимоцитах. Фракцией, наиболее богатой IL-4, остаются клетки предшественники CD4CD8. Поскольку при определении цитокинов в вышеописанных опытах клетки не подвергали активации и не обрабатывали ингибиторами транспорта белков, представленные данные отражают уровень спонтанной экспрессии цитокинов, причем данные, полученные после культивирования, могут отражать уровень цитокинов, остающихся в клетках после эвакуации цитокинов в результате секреции или в результате деградации цитокина внутри клетки. Для того чтобы блокировать секрецию, клетки обрабатывали брефелдином А, а для того чтобы оценить эффект активации, их культивировали в течение 1 сут. в присутствии ФМА и иономицина.Результаты отражены в табл. 3. Отсутствие сколько нибудь существенного влияния брефелдина Ана уровень цитокинсодержащих клеток свидетельствует о практически полном отсутствии потери тимоцитами цитокинов за счет процесса секреции. Обработка ФМА и иономицином, обычно используемая для активации тимоцитов, а также для индукции накопления цитокинов в периферических Т клетках [4], способствовала скорее снижению, чем повышению числа IFN? тимоцитов,но привела почти к двукратному повышению числа IL-4 клеток (и в этом случае брефелдин А не вызывал повышения этого числа). Наконец, обработка клеток актиномицином D для блокады процесса транскрипции привела к примерно 2 кратному снижению числа клеток, экспрессирующих цитокины, во всех ситуациях, кроме выявления IL-4 в покоящихся тимоцитах. Поскольку ряд авторов указывает на возможность индукции выработки цитокинов тимоцитами при их контакте с ТЭК [11, 9], мы оценили влияние сокультивирования тимоцитов с ТЭК на численность IFN? и IL-4 клеток в 1суточной культуре. Данные отражены в табл. 4. Присутствие ТЭК не влияет на число IFN? клеток в отсутствиедополнительной активации ФМА и иономицином.При наличии такой активации число IFN?+ клеток резко возрастает, но выявить это возрастание удается лишь при условии блокады секреторного процесса. Что касается IL-4 клеток, то для столь же выраженного увеличения их числа достаточно одного сокультивирования с ТЭК, причем дополнительная активация ФМА и иономицином лишь незначительно усиливают этот эффект. Таким образом, под влиянием сокультивирования сТЭК и (для IFN?+ клеток) дополнительной активации тимоцитов резко возрастает содержание клеток, продуцирующих и немедленно секретирующих исследованные цитокины.Итак, примерно каждый четвертый тимоцит,выделенный из тимуса детей первого года жизни,содержит в цитоплазме IFN?, а каждый шестой —IL-4; часть тимоцитов несет указанные цитокины на своей поверхности. IFN? присутствует в основном в зрелых тимоцитах, а также в CD4CD8 клетках предшественниках, а IL-4 — в незрелых клетках фенотипов как CD4CD8, так иCD4+CD8+. Это не вполне согласуется с данными литературы, полученными при изучении секреторной активности тимоцитов, которые свидетельствуют о необходимости стимуляции клеток для индукции выработки IFN? [3], тогда как IL-4 может вырабатываться спонтанно лишь кортизон резистентными (т.е. зрелыми) клетками [8].Культивирование в течение суток приводит к снижению числа цитокин содержащих клеток (за одним исключением: повышается доля IFN?+CD4+CD8+ клеток). Это снижение не удается связать с выходом цитокинов из клеток в процессе секреции, т.к. блокада этого процесса не влияет на результат. Вероятно, снижение содержания цитокинсодержащих клеток обусловлено деградацией цитокинов внутри клеток. Очевидно, этот процесс сочетается с их синтезом de novo, поскольку обработка клеток актиномицином D не очень резко но закономерно снижает долю клеток, содержащих IFN? и IL-4.Активация, обязательная для индукции выработки цитокинов периферическими Т клетками и,по данным литературы, необходимая для индукции секреции цитокинов тимоцитами, не влияет начисленность IFN? и IL-4 тимоцитов. Отметим,что в работе использованы именно те средства активации (ФМА и иономицин), которые обычно используют для стимуляции тимоцитов. Тем более удивительно, что такое «мягкое» средство стимуляции, как контакт тимоцитов с ТЭК, привел к значительному повышению числа IL-4+ клеток, а при дополнительном действии ФМА и иономицина — также IFN?+ клеток. О способности контакта с ТЭК индуцировать выработку IL-4 тимоцитами уже упоминалось в литературе [3], также како большей требовательности индукции синтезаIFN? к комплексу стимулирующих факторов [6,12]. Очень важно, что индуцированный синтез цитокинов сопровождается их секрецией (выявляется только на фоне действия брефелдина А). По видимому, лишь эти данные могут служить эквивалентом литературных сведений об условии секреции цитокинов тимоцитами in vitro.Полученные результаты отражают по преимуществу выработку цитокинов тимоцитами в условиях культивирования in vitro (хотя данные о содержании цитокинсодержащих клеток в суспензии тимоцитов ex vivo в значительной степени отражают процессы, происходящие в условиях целостного организма).Общая картина выработки IFN? и IL-4 в тимусе может быть реконструирована таким образом.Значительная часть тимоцитов спонтанно или подвлиянием контакта с окружающими клеткамивырабатывает цитокины, но не секретирует их.Синтез цитокинов зависит от микроокружения и ослабляется в суспензионной культуре тимоцитов.Цитокины достаточно быстро подвергаются внутриклеточной деградации. Хотя цитокины вырабатываются на разных стадиях развития тимоцитов,интенсивность процесса варьирует. Так, спонтанный синтез IFN? прекращается на стадииCD4+CD8+ клеток, а синтез IL-4 — на стадии зрелых тимоцитов. Синтез IFN? CD4+CD8+ клетками может возобновиться in vitro — вследствие созревания клеток или освобождения от факторов микроокружения, подавляющих синтез цитокина. Физиологическим фактором стимуляции не только выработки, но и секреции цитокинов служит контакт тимоцитов с ТЭК (в случае выработки IFN? — в сочетании с другими активирующими воздействиями).Пока весьма затруднительно понять биологический смысл наработки внутриклеточных IFN? и IL-4 тимоцитами (причем не только юными, но и зрелыми) без их секреции. Возможно, цитоплазматические цитокины играют роль в развитии Т клеток. С другой стороны, локализация цитокиов в цитоплазме может быть этапом на пути их эвакуации на мембрану, а мембранные цитокины,возможно, участвуют в межклеточных коммуникациях. Что касается решающей роли контактовс ТЭК в индукции дополнительного синтеза и секреции IFN? и IL-4, то его можно связать с достаточно хорошо известной ролью цитокинов, вырабатываемых тимоцитами (в первую очередь IFN?),в их стимулирующем действии на ТЭК. Таким образом, ТЭК, контактируя с тимоцитами, провоцируют образование и секрецию ими цитокинов, в действии которых они нуждаются.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шарова Н.И., Дзуцев А.Х., Литвина М.М. и др. Результаты взаимодействия лимфоидных и эпителиальных клеток тимуса in vitro. Активация и апоптоз //Иммунология. — 2000. — № 3. — С. 7–10.
2. BendrissVermare N., Barthelemy C., Durand I. et al. Human thymus containsIFN?producing CD1c myeloid CD11c+ and mature interdigitating dendriticcells // J. Clin. Invest. — 2001. — Vol. 107. — P. 835–844.
3. DacusIL- R., Vallier D., Gualde N. Regulation by PGE2 of IL-2, IL-3 and IFN production by corticoresistant thymocytes // Immunol. Let. — 1993. —Vol. 38.— P. 229–235.
4. Jung T., Schauer U., Heusser C. et al. Detection of intercellular cytokines byflow cytometry // J. Immunol. Meth. — 1993. — Vol. 159. — P. 197–207.
5. Lu L., Chen W. Functional maturation of mouse CD4+CD8+ thymocytes inducedby medullarytype thymus epithelial cells // Sci. China C. Life Sci. — 1996.—Vol. 39. — P. 427–439.
6. Mingari M.C., Maggi E., Cambiaggi A. et al. Development in vitro of humanCD4 thymocytes into functionally mature Th2 cells. Exogenous IL-12 is required for priming thymocytes to produce both Th1 cytokines and IL-10 //Eur. J. Immunol. — 1996. — Vol. 26. — P. 1083–1087.
7. Mossman T.R., Chervinski H., Bond M.W. et al. Two types of murine helper T cellclones. I. Definition according to profIL-es of lymphokine activities and secretedproteins // J. Immunol. — 1986. — Vol. 136. — P. 2348–2357.
8. Murphy M., Friend D.S., PikeNobIL-e L., Epstein L.B. TNF? and IFN? expressionin human thymus. Localization and overexpression in Down syndrome // J.Immunol. — 1992. — Vol. 149. — P. 2506–2512
9. Napolitano M., Bellavia D., Maroder M. et al. Modulation of cytokine gene expression by thymic lymphostromal cell to cell interaction: effect of retinoicacid // Thymus. — 1997. — Vol. 24. — P. 247–258.
10. Sharova N.I., Dzutsev A.K., Litvina M.M. et al. Thymic epithelial cells induceFasindependent activation apoptosis of thymocytes // Immunol. Lett. —2001. — Vol. 78. — P. 201–207.
11. Vanderkerckhove B.A., Barcena A., Schols D. et al. In vivo cytokine expressionin the thymus. CD3hi human thymocytes are activated and already functionallydifferentiated in helper and cytotoxic cells // J. Immunol. — 1994. —Vol. 152.— P. 1738–1743.
12. Yamaguchi E., de Vries J., Yessel H. Differentiation of human singlepositivefetal thymocytes in vitro into IL-4 and IFN?producing CD4+ and CD8+T cells // Int. Immunol. — 1999. — Vol. 11. — P. 593–603.
13. Zlotnik A., Godfrey D.I., Fischer M., Suda T. Cytokine production by mature andimmature CD4CD8 T cells. бвTCR+CD5CD8 T cells produce IL-4 // J. Immunol. — 1992. — Vol. 149. — P. 1211–1215.
14. Zlotnik A., Moore T.A. Cytokine production and requirements during T cell development // Curr. Opin. Immunol. — 1995. — Vol. 7. — P. 206–213.
