Т.Н. Суровенко, Я.С. Шелудько, О.В. Овчинникова, Е.В. Маркелова,Б.И. Гельцер Владивостокский государственный медицинский университет, Лаборатория иммунологии Главного госпиталя Тихоокеанского Флота, г. Владивосток, Дальневосточный филиал Института клинической иммунологии СО РАМН, г.Владивосток Прогностическое значение исследования IL-4,IFN? и IgEв конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и аллергическом рините у детей
Т.Н. Суровенко, Я.С. Шелудько, О.В. Овчинникова, Е.В. Маркелова,Б.И. Гельцер Владивостокский государственный медицинский университет, Лаборатория иммунологии Главного госпиталя Тихоокеанского Флота, г. Владивосток, Дальневосточный филиал Института клинической иммунологии СО РАМН, г.Владивосток Прогностическое значение исследования IL-4,IFN? и IgEв конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и аллергическом рините у детей
Исследование конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) при бронхиальной астме (БА) и аллергическом рините (АР) признается перспективным методом для контроля активности воспалениядых ательных путей (ДП). Обследовано 34 ребенка в возрасте от 4 до 18 лет с БА и 16 пациентов того же возраста с АР с моносенсибилизацией к клещам домашней пыли (КДП). Изучено содержание IL-4 и IFN? в КВВ, их взаимосвязь с уровнем общего IgE в КВВ в зависимости от экспозициии причиннозначимого аллергена. Маркером экспозиции служило количество КДП в постелидетей. Установлено повышение содержания IL-4 в КВВ при БА и АР (7,68 ± 3,14 и 5,36 ± 1,75 пг/млсоответственно). При этом содержание IFN? в КВВ больных оставалось относительно низким —3,92 ± 1,16 пг/мл, в результате отношение IL-4/IFN? при обострении БА было высоким (10–30),при ремиссии снижалось до 3–4. В отличие от IL-$4, не наблюдали нормализации содержания IgEу пациентов с изначально повышенным его уровнем. Нахождение IL-4, IFN? и IgE в КВВ позволяет предположить наличие механизмов их секреции на поверхность эпителия ДП и возможное использование этих показателей для уточнения локализации аллергического воспаления и определения показаний и контроля эффективности топической иммунотерапии.
В последние годы продолжается поиск информативных и, по возможности, не инвазивных и низко бюджетных методов диагностики и мониторинга воспаления верхних и нижних дыхательных путей (ДП). Одним из возможных способов является поиск биохимических и иммунологических маркеров воспаления в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ). Впервые исследование КВВ в этих целях было предложено Г.И. Сидоренко и др. в1980 г.[4], и в течение двух десятилетий в отечественной пульмонологии интенсивно изучался егобиохимический состав [1, 3, 8, 9]. В последние годы интерес исследователей к КВВ повысился во всем мире в связи с возможностью использования КВВ в качестве субстрата для контроля и даже самоконтроля эффективности проводимого лечения при заболеваниях ДП [2, 5, 14, 15, 18, 22]. КВВ получают путем конденсации выдыхаемого воздуха при его охлаждении в специальном приборе конденсоре. Метод получения конденсата не инвазивен, достаточно доступен и легко выполним для детей как старшего, так и младшего возраста. Кнастоящему моменту доказано присутствие в КВВ метаболитов оксида азота [2, 20], провоспалительного белка альфакислого гликопротеина [2],3нитротирозина, перекиси водорода [22] , 8 изопростана [14], лейкотриенов [10, 15], которые попадают в КВВ со слизистой оболочки дыхательных путей. В отношении определения цитокинов и IgE в КВВ наши исследования являются пионерскими, и значимость этих маркеров при патологии дыхательных путей не ясна [5, 19, 20, 21].В последние годы показано, что в основе бронхиальной астмы (БА) и аллергического ринита(АР) у детей лежит IgEопосредованное воспаление слизистой оболочки, при АР верхних, при БА нижних дыхательных путей. Эти два заболевания настолько связаны друг с другом, что в последние годы предложена концепция «одни дыхательные пути — одна болезнь». Это в первую очередь характерно для детей атопиков, у которых БА чаще начинается с АР или одновременно с ним. IgE ответ индуцируется взаимодействием Т клеток и антиген представляющих клеток, приводящим к стимуляции образования IL-4 и одновременно к подавлению секреции интерферонагамма (IFN?), что переключает активированные Ig Mнесущие В клетки на синтез IgE [11, 12, 13].Одновременно IL-4 повышает экспрессию молекулы CD23, являющейся низко аффинным рецептором IgE [12]. Поэтому диcрегуляция секреции IL-4 является ключевой в развитии аллерго патологии. Увеличенный уровень IL-4 в ДП астматиков коррелирует с уровнем гиперреактивности [17] и эозинофилии мокроты [16], так как может изменять состояние молекул адгезии на эндотелиальных клетках легких и этим способствовать рекрутизации эозинофилов в ДП [16]. IFN?, наоборот, стимулирует пролиферацию хелперов Th1 типа,и поэтому считается, что повышение содержания IFN? может снизить активность аллергического воспаления [11]. Системное содержание IL-4 иIFN? в сыворотке крови больных БА и АР, как отмечают многие авторы, отражает течение заболевания, и при обострении как БА, так и АР наблюдается дисбаланс в содержании этих цитокинов.IL-4 и IFN? обнаружены также в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, назальном секрете ииндуцированной мокроте. Поэтому в последниегоды предпринимаются попытки разработки иммунологического метода топического лечения БАс помощью моноклональных антител к IL-4 или рекомбинантного IFN?.Общепризнано, что определение общего уровня IgE в сыворотке крови имеет диагностическое и прогностическое значение при аллергических заболеваниях [7, 12]. IgE синтезируется в основном плазматическими клетками, локализующимися в слизистых оболочках. Поэтому нормальный уровень IgE в сыворотке периферической крови не исключает возможности участия в заболевании IgE зависимого механизма, так как местный синтез IgE и сенсибилизация тучных клеток могут происходить и при отсутствии его в кровотоке. Поэтому у достаточно большой группы больных классической IgE ассоциированной патологией, в том числе БА и АР, нет системного повышения уровня IgE. В то же время, увеличение концентрации общего IgE у этих больных может наблюдаться в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, назальном секрете и индуцированной мокроте. В КВВ его нахождение ранее не описано.Материалы и методы В связи с отсутствием сведений о наличии IL-04, IFN? и IgE вКВВ и их предположительно ключевой роли в развитии аллергического воспаления ДП мы поставили перед собой задачу уточнить возможность их определения в КВВ и установить их прогностическое значение в развитии аллерго патологии ДП. Для решения поставленной задачи нами было обследовано 34 ребенка с БА и 16 детей с персистирующим АР в возрасте от 4 до 18 лет, с сенсибилизацией к клещам домашней пыли(КДП). Сенсибилизация была подтверждена положительными скарификационными кожными пробами с антигеном КДП, по0вышением специфического IgE и у некоторых больных положительной назальной провокационной пробой с клещевым аллергеном. В качестве контрольной группы служили 10 практически здоровых детей того же возраста, но без проявлений атопии. 24 пациента с БА из наблюдаемой группы получали базисную противовоспалительную терапию (ПВТ): 12 детей ромогликат натрия, 6 — недокромил натрия и 6 — ингаляционные глюкокортикостероиды (иГКС), остальные пациенты —только в период обострения. 28 пациентов с БА имели сопутствующий персистирующий АР. Часть пациентов была обследована в динамике через 1 и 3 мес. после обострения (в фазе обострения, затухающего обострения и ремиссии заболевания). Одновременно с обследованием детей проводили определение количества КДП в их постели как маркера естественной экспозиции причинно значимого аллергена. КВВ получали методом Г.И. Сидоренко и др. [4]. Объем получаемого КВВ составлял 3 мл. Для повышения чувствительности определения конденсат предварительно готовили по авторской методике [6]. В исследовании использовали иммуноферментный метод: для определения IL-4 и IFN? применяли моноклональные антитела в сэндвичварианте с помощью набора «RD Diagnostics Inc» (США) согласно прилагаемой инструкции. Для определения IgЕ использовали тест системы производства ЗАО «ВекторБест» (Россия). Определение количества клещей в пыли постели детей проводили морфологическим методом.
Результаты и обсуждение
Как оказалось, IL-4 присутствует в минимальных количествах в КВВ здоровых детей. Нами он был определен у 6 из 10 детей в средней концентрации 1,34 ± 0,96 пг/мл. Содержание же IL-4 в КВВ больных имело широкие колебания в зависимости от тяжести течения и обострения заболевания, этиологического фактора обострения. В КВВ (рис. 1) в период ремиссии АР и БА легкой и средней степени тяжести наблюдалось нормальное содержание IL-4 (1,78 ± 1,26; 1,65 ± 1,08;1,43 ± 0,96 пг/мл соответственно), кроме тяжелой астмы (4,45 ± 2,43 пг/мл). В период обострениямаксимальными были показатели при БА среднейстепени тяжести (15,65 ± 3,36 пг/мл). Содержание IL-4 в КВВ при обострении АР тяжелой/среднетяжелой степени было таким же, как при обострении БА средней степени тяжести (17,12 ± 2,45 и15,65 ± 3,24 пг/мл соответственно). На содержание IL-4 выраженное влияние оказывала природа провоцирующего обострение фактора. Так, еслипричиной обострения был контакт с причинно значимым аллергеном, концентрация IL-4 повышалась до максимальных цифр (100–120 пг/мл);при обострении, вызванном вирусной инфекцией ,показатели были в пределах 5–8 пг/мл.IFN? нами обнаружен в 7 из 10 образцов КВВздоровых детей в количестве от 0,5 до 2,14 пг/мл.У детейатопиков IFN? определялся во всех образ
Рис. 1. Содержание IL-04 в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с аллергическим ринитом и бронхиальной астмой в зависимости от течения заболевания.
Рис. 2. Содержание IgE в конденсате выдыхаемого воздуха у детей с бронхиальной астмой и аллергическим ринитом в зависимости от течения заболевания.
Рис. 3. Уровень IgE и IL-04 в конденсате выдыхаемого воздуха у детей атопиков иколичество клещей домашней пыли.
цах, за исключением 1 больного АР в стадии ремиссии, в количестве от 2,01 до 14,35 пг/мл (средний уровень при БА составил 4,39 ± 1,16, при АР3,13 ± 0,94 пг/мл). Достоверных различий содержания IFN? в зависимости от степени тяжести и течения заболевания нами не обнаружено.При исследовании IgE(рис. 2) в КВВ выявлено его присутствие в незначительных количествах у6 из 10 здоровых детей (до20 МЕ/мл) и значительное повышение его содержания при БА, особенно при тяжелой (до 330 МЕ/мл). 5 детей атопиков также имели нормальное содержание IgE, все они находились в состоянии ремиссии. При БА легкой и средней степени тяжести уровень IgE был достоверно выше нормы, но не различался у больных в зависимости от фазы заболевания. Содержание IgE в КВВ при обострении АР было таким же, как при обострении БА легкой и средней степени тяжести. А карологическое исследование, проведенное в квартирах больных и здоровых детей, показало, что в постели больных детей количество КДП было достоверно больше при первичном обследовании, чем в постели здоровых (1161,67 ± 283,9 и 695,71 ± 261,3 экз./г соответственно, р < 0,005).Мы не нашли ни одной квартиры, где содержание клещей было бы меньше 100 на 1 грамм пыли по версии ВОЗ, относительно безопасного уровня для атопиков. При повторных обследованиях количество клещей в постели больных стало значимо меньшим (357,4 ± 134,9 экз./г) как результат обучения родителей и детей и проведенных деакарологических мероприятий, но также не достигло уровня менее 100 особей клещей на грамм пыли ни в одном случае. При анализе зависимости выбранных маркеров от содержания КДП в постели детей корреляционной зависимости между содержанием IL-4, IFN?и числом КДП в постели не обнаружено. В то же время, при анализе 2 групп детей тех, у кого в постели обнаружено менее 1000 и более 1000 клещей на 1 г пыли, — определены значимые различия в содержании IL-4 и IgE (рис. 3). Максимальными показатели IL-4 и IgE были у детей при числе клещей более 1000 в 1 грамме пыли. Причем при такой концентрации клеща у 2 из 10 здоровых детей в возрасте 4 и 5 лет также были определены высокие показатели IL-4. Обнаружена тенденция к положительной коррелятивной связи между количеством КДП и уровнем IgE в КВВ (r = 0,38).Согласно полученным результатам, содержание IL-4 в КВВ при БА и АР зависит от активности патологического процесса и повышается в приступный период БА, при обострении АР и при утяжелении клинического течения БА и АР. В предыдущих исследованиях нами отмечено одновременное повышение IL-4 и метаболитов оксида азота в КВВ детей при клещевой БА после экспозиции причиннозначимого аллергена [17, 18]. В настоящем исследовании у больных БА зафиксирована выраженная активация местной продукции IL-4 слизистой бронхов, о чем свидетельствует исследование КВВ, особенно в приступном периоде болезни и в период клинической ремиссии при тяжелом течении патологического процесса. При персистирущем АР у значительного количества пациентов наблюдается также гиперсекреция IL-4 в нижних ДП, что свидетельствует о распространении аллергического воспаления и заинтересованности слизистой нижних ДП при АР. Максимальная секреция IL-4 в нижних ДП имела место в приступном и постприступном периоде БА, вызванном контактом с причиннозначимым аллергеном. По нашему мнению, повышение IL-4 в КВВ в ранние сроки формирования воспаления ипоследующее быстрое его снижение при проведении противовоспалительной терапии свидетельствует о важной роли IL-4 в инициации воспаления ДП и прогностическом значении этого цитокина для последующего развития аллергического воспаления нижних ДП и развития БА. Содержание IgE в нашем исследовании не зависело от периода течения БА и АР. Уровень IgE оставался повышенным как в период обострения,так и во время ремиссии заболеваний. Следовательно, продукция IgE не зависит полностью от секреции IL-4. Согласно полученным нами данным, как при АР, так и при БА отмечается общая закономерность в динамике IL-4, IFN? и IgE в КВВ, что свидетельствует об общих патогенетических механизмах воспаления в ДП. Нахождение IL-4, IFN? и IgE в КВВ позволяет предположить наличие механизмов их секрециина поверхность эпителия дыхательных путей. Повышение IL-4 в КВВ и снижение индексаIL-4/IFN?, а также появление IgE в КВВ у больныхАР может служить предвестником развития БА. Количество КДП, превышающее 100 экз./г в пыли постели, ассоциируется с повышением IgE в КВВ; при десятикратном превышении этого уровня наблюдается выраженное повышение IL-4 и IgE в КВВ. Определение высоких концентраций IgE в КВВ отражает высокую активность IgE опосредованного аллергического воспаления дыхательных путей. Использование метода определения содержания IL-4,IFN? и IgE в КВВ может быть перспективно в дальнейшем не только для оценки степени воспаления и эффективности лечения, но и для отбора пациентовс БА для топической терапии анти IgE антителами,IFN? или моноклональными антителами к IL-4.
Таким образом, результаты проведенного исследования отражают общность иммунных механизмов при аллергическом воспалении слизистой ДП при АР и БА и определяют необходимость исследования локальной секреции цитокинов и IgE для уточнения локализации аллергического воспаления в ДП, степени его тяжести и оценки эффективности терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гончарова В.А., Борисенко Л.В., Доценко Е.К., Похазникова М.А. Показатели калликреин0кининовой системы крови и биохимический состав конденсата влаги выдыхаемого воздуха у больных острым бронхитом с различны0ми вариантами течения // Клин.мед. 1996. Т. 74, № 7. С. 46–48.
2. Невзорова В.А., Просекова Е.В., Гельцер Б.И. и др. Динамика биохимических маркеров воспаления в оценке эффективности базисной терапии прибронхиальной астме // Тер. арх.2001.Т. 73, № 3. С. 24–27.
3. Рыбакова Е.В., Сидельников В.М., Брюзгина Т.С., Кравченко Е.Я. Спектр жирных кислот и уровень свободного холестерина в конденсате выдыхаемоговоздуха // Лаб. дело.1991.№ 4. С. 74–75.
4. Сидоренко Г.И., Зборовский Э.И., Левина Д.И. Поверхностноактивные свойства конденсата выдыхаемого воздуха (новый способ исследования функций легких) // Тер. арх. 1980. № 3.С.65–68.
5. Суровенко Т.Н., Кочеткова Е.А., Гельцер Б.И. Цитокины (ИЛ4, ИЛ8, ИЛ10)в конденсате влаги выдыхаемого воздуха (КВВВ) как маркеры воспаленияпри бронхиальной астме (БА): Тезисы доклада 110 го национального конг0ресса по болезням органов дыхания. М., 2001.С. 113.
6. Суровенко Т.Н., Маркелова Е.В., Чикаловец И.В. и др. Способ определения цитокинов и иммуноглобулина Е в конденсате выдыхаемой влаги: Приоритетная справка № 2002114030 от 29.05.2002.
7. Тотолян А.А. Иммуноглобулин Е: структура, продукция, биологические эффекты и диагностическое использование // Аллергология.1998.№ 2. С. 4– 7.
8. Федосеев Г.Б., Емельянов А.В., Малакаускас К.К. и др. Использование конденсата выдыхаемого воздуха для исследования биохимического состава содержимого бронхов у больных бронхиальной астмой // Клин. мед.1992.Т. 70, № 3/4. С. 27–28.
9. Яценко В.П., Брюзгина Т.С., Хоменко В.Е., Рева С.Н. Газохроматографический анализ липидов конденсата выдыхаемого воздуха у детей при бронхолегочной патологии // Клин. лаб. диагн.1997.№ 4.С. 16–17.
10. Antczac A., Montuschi P.,Kharitonov S. et al.Increased exhaled cysteinyl0leu0kotrienes and 8isoprostane in aspirin0induced asthma // Am. J. Respir. Crit.Care Med.2002.Vol. 166, № 3.P. 301–306.
11. Barnes P.J, Chung K.F., Clive P. Inflammatory mediators of asthma // Pharma0col. Rev. 1998. Vol. 50, № 4. P. 515–596.12.Dolesek С., Steinbergen P., Susani M. Effect of IL-4 and IL-13 on total andallergen specific IgE production by cultured PBMC from allergic patients determined with recombinant allergens // Clin. Exp. Allergy. 1995.Vol.25 P. 879–889.
13. Haas H., Falcone F.H., Holland M.J. et al. Early IL-4: its role in the switch to0wards a Th2 response and IgEmediated allergy // Int. Arch. Allergy Immunol.1999 Vol. 119. — P. 86–94.
14. Montuschi P., Corradi M., Ciabattoni G. et al. Increased 80isoprostane, a mark0er of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients // Am. J.Respir. Crit. Care Med. 1999.Vol. 160, № 1.P. 216–220.
15. Reinhold P., Becher G., Rothe M. Evaluation of the measurement of leukot0riene B4 concentrations in exhaled condensate as a noninvasive method forassessing mediators of inflammation in the lungs of calves // Am. J. Vet. Res.2000.Vol. 61, № 7.P.742–749.
16. Schleimer R.P., Sterbinsky S.A., Kaiser J. et al. IL-4 induces adherence of hu0man eosinophIL-s and basophIL-s but not neutrophIL-s to endothelium. Associa0tion with expression of VCAM01 // J. Immunol.1992.Vol. 148..1086–1092.
17. Shi H.Z., Deng J.M., Xu H. et al. Effect of inhaled IL-4 on airway hyperreactivityin asthmatics // Am. Rev. Resp. Dis. 1998.Vol. 157.P. 1818–1821.18. Sourovenko T.N., Kochetkova Y.A., Geltser B.I. Interleukin04 (IL-4) and NO me0tabolites in the exhaled air condensates (EAC) of atopic chIL-dren as a predictorof BA development // Eur. Respir. J.2001.Vol.
18 (Suppl. 33).P. 38s.19. Sourovenko T.N., Zheleznova L.V. Association between house dust mites (HDM)level in homes of atopic chIL-dren and interleukin04 and IgE in expired air con0densate (EAC) // Eur. Respir. J.2002.Vol.
20 (Suppl. 38).P. 536.20. Sourovenko T.N., Ovchinnikova O.V., Geltser B.I. Nitric oxide metabolites and totalIgE in exhaled air condensate (EAC) of the patients with bronchial asthma (BA) andallergen exposure // Eur. Respir. J.2002.Vol. 20 (Suppl. 38).P. 604s.
21. Sourovenko T.N., Zheleznova L.V., Nevzorova V.A. Interleukin04 and IgE levelin exhaled air condensate (EAC) of the atopic patients // Eur. Respir. J.2002.V. 20 (Suppl. 38).P. 509–510s.
22. van Beurden W.J., Harff G.A., Dekhuijzen P.N. et al. An efficient and reproduc0ible method for measuring hydrogen peroxide in exhaled breath condensate //Respir. Med.2002.Vol. 96, № 3P. 197–203.
