Г.Н.Можокина, Н.А. Елистратова, Л.П. Михайлова, А.Д. Куничан Научно исследовательский институт фтизиопульмонологии ММА им.И.М. Сеченова, Москва Влияние Глутоксима на формирование и течениетуберкулезного воспаленияу экспериментальных животных .
Г.Н.Можокина, Н.А. Елистратова, Л.П. Михайлова, А.Д. Куничан Научно исследовательский институт фтизиопульмонологии ММА им.И.М. Сеченова, Москва Влияние Глутоксима на формирование и течениетуберкулезного воспаленияу экспериментальных животных .
В эксперименте на мышах, зараженных микобактериями туберкулеза, проведено изучение влияния Глутоксима на формирование и течение туберкулезного процесса. Глутоксим вводили внутрибрюшинно со второго дня после заражения в течение 3 нед. в широком диапазоне доз. Показано, что препарат уменьшает выраженность экссудативного компонента и распространенности воспалительного процесса. Наиболее эффективными оказались дозы 1и 0,5 мг/кг массы.
Глутоксимхимически синтезированное биологически активное соединение (гексапептид со стабилизированной дисульфидной связью)является представителем нового класса лекарственных веществ тиопоэтинов, обладающих эффектами системных цитопротекторов, иммуномодуляторов и гемопоэтических факторов. Глутоксим регулирует экспрессию таких иммунологически значимых генов, как гены ?цепи IL-2,TNF?,IFN? и IFN?;активирует пролиферацию идифференцировку клеток гемопоэтической ткани. Глутоксим осуществляет позитивную модификацию биологического ответа клеток при всех состояниях, когда целесообразна регулируемая активация продукции цитокинов, процессов пролиферации, дифференцировки и механизмов апоптоза. Иммунопатологические состояния при туберкулезе являются показаниями для назначения иммунокорригирующих препаратов для повышения эффективности противотуберкулезной терапии[1–3].Первые экспериментальные исследования по применению Глутоксима в комплексной химиотерапии свидетельствуют о положительном эффекте, что проявилось в снижении весовых индексов и высеваемости микобактерий туберкулеза на 37,5 % по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе, где лечение осуществлялось одними противотуберкулезными препаратами [1]Целью настоящего исследования явилось изучение влияния нового лекарственного препарата Глутоксим на формирование и течение туберкулезного воспалении в условиях эксперимента.
Материалы и методы Модель генерализованного туберкулеза у мышей воспроизводили путем внутривенного введения 2 недельной высоковирулентной культуры микобактерий туберкулеза (МБТ)штамма Н37Rv в дозе 0,05 мг на мышь. Глутоксим вводили внутрибрюшинно один раз в день со второго дня после заражения мышей в течение 3 нед. ежедневно. Дозы препарата рассчитаны исходя из рекомендуемых дозировок для человека 5–40 мг. Минимальная 0,08 мг/кг(1я группа); средние 0,5 и 1 мг/кг (соответственно 2 и 3 я группа) и 10 кратно превышающая среднюю терапевтическую дозу 5 мг/кг (4я группа). Контрольной группе мышей (спонтанное течение туберкулезного процесса) вводили физиологический раствор. Оценку влияния препарата проводили в динамике через 7,14 дней и 21 день после заражения и сравнивали с контрольными показателями. В каждой группе в указанные сроки было взято по 10 мышей. Критериями оценки действия препарата на туберкулезное воспаление были изменения весовых индексов внутренних органов (легких, селезенки, печени, почки); степени поражения легких (СТПЛ) у мышей по О.О. Макеевой; высеваемости МБТ из гомогенатов легких и селезенки. При вскрытии мышей производили забор легких, кусочков печени, селезенки и фиксировали их в 10 %ном забуференном по Лилли формалине.После фиксации и проводки материал
Таблица 1 Весовые индексы внутренних органов мышей контрольной и опытных групп в процессе формирования генерализованного туберкулеза
Примечание. Достоверность различий по сравнению с показателями в контроле (p < 0,05);достоверность различий по сравнению с данными в первой группе(p<0,05).
Примечание. Достоверность различий по сравнению с контролем(p < 0,05–0,01).
заливали в парафин и из парафиновых блоков изготовляли ступенчатые гистологические срезы. Использовали гистологические окраски гематоксилином и эозиномитолуидиновым синим(рН 2,0). Окраска толуидиновым синим позволяла идентифицировать нейтрофилы при морфологическом исследовании. В гистологических препаратах печени при увеличении 160 подсчитывали абсолютное количество гранулем и среди них гранулем с четким просветлением и перигранулемным лимфоидным валом. При увеличении?400 в поле зрения определяли в дольках печени число ретикулоэндотелиальных элементов, лимфоцитов и двуядерных гепатоцитов.В гистологических срезах легких с помощью сетки Г.Г.Автандилова (1980) при увеличении ? 160 определяли объемную плотность (в %) очагов туберкулезной пневмонии.В составе воспалительного инфильтрата в легких при увеличении ? 400 подсчитывали число нейтрофилов и лимфоцитов.
Полученные результаты подвергали статистической обработке. Достоверность различий оценивали по t критерию Стъюдента.
Результаты и обсуждение
Характеристика туберкулезного воспаления у мышей опытной и контрольной групп через7,14 дней и 21 день после заражения их МБТ представлена в табл.1, 2, 3. Как следует из табл.1, прогрессирование туберкулезного процесса у зараженных мышей характеризовалось повышением весовых показателей легких и селезенки и степени пораженности легких. Колебание весового индекса легких у мышей опытных групп зависело от дозы;в большей степени различия с контролем были выражены у мышей 2 и 3й групп. Морфологическая характеристика экспериментального туберкулезного воспаления у мышей после лечения различными дозами Глутоксима На 7 е сут. после заражения мышей культурой H37Rv при микроскопическом исследовании выявлялась картина интерстициальной пневмонии. Метаальвеолярные перегородки были очагово инфильтрированы гистиоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами. Из всех мышей только у 3 определялись единичные макрофагальные гранулемы без четкого просветления.Показатели объемной плотности воспалительного инфильтрата в легких мышей контрольной группы и всех опытных групп достоверно не различались (см. табл. 2).В сравниваемых группах не было существенных различий показателей содержания в составе воспалительного инфильтрата нейтрофилов и лимфоцитов.В гистологических срезах печени определялись макрофагальные гранулемы без четкого просветления и перигранулемного лимфоидно
Примечание. Достоверность различий по сравнению с показателями в контроле (p < 0,05–0,001).
го вала, а также явления слабо или умеренно выраженной мезенхимально воспалительной реакции. Дистрофические изменения гепатоцитов ни в одной из групп не выявлялись. Поморфометрическим данным,у мышей 3 и 4 й групп наблюдалась тенденция к увеличению числа гранулем по сравнению с данными в контрольной группе. При введении различных доз Глутоксима отмечается тенденциях увеличению числа ретикулоэндотелиальных клеток в печеночных дольках. По сравнению с контрольными показатели числа ретикулоэндотелиальных клеток в 1 и 2 й группе мышей были статистически достоверно более высокими. Во всех сравниваемых группах число лимфоцитов, диффузно рассеянных по ходу печеночных балок, было сходным. Количество двуядерных гепатоцитов (косвенный показатель усиления регенераторных процессов) у мышей, леченных различными дозами Глутоксима, было повышено.При этом у мышей 2й группы этот показатель статистически достоверно отличался от данных контрольной группы (см. табл. 3).Таким образом, на 7 е сут. после заражения мышей МБТ, по данным морфологического и морфометрического исследований, в легких нелеченных и леченных различными дозами Глутоксима различий не выявлено. В печени мышей, получавших Глутоксим, по сравнению с данными в контроле отмечена тенденция к увеличению числа ретикулоэндотелиальных (купферовских) клеток и двуядерных гепатоцитов, причем в 1 и 2 й группах эти различия были статистически достоверными. Выявленные изменения свидетельствуют о выраженном активирующем воздействии Глутоксима на макрофагальную систему, что приводит к увеличению числа макрофагальных гранулем икупферовских клеток в печени. Кроме того, Глутоксим, по видимому, оказывает стимулирующее действие на пролиферативные процессы (увеличено число двуядерных гепатоцитов), однако это требует более детального подтверждения с помощью более точных методов исследования (авторадиография). На 14 е сут. эксперимента при микроскопическом исследовании в легких мышей всех групп на фоне уже описанных в предыдущий срок изменений выявлялись единичные в препарате (1–3) макрофагальные гранулемы с тенденцией к просветлению. При морфометрическом исследовании показатели объемной плотности очагов туберкулезной пневмонии в сравниваемых группах были сходными. Статистически не различались и показатели числа нейтрофилов в составе инфильтрата. Содержание лимфоцитов в воспалительном инфильтрате у мышей 3 и 4 й групп было достоверно ниже, чем в контрольной группе (см. табл. 2).В печени мышей 1 и 2 й групп число гранулем было выше, чем в контроле (р < 0,05) (см. табл. 3).При этом у мышей, леченных Глутоксимом, было более высокое число зрелых гранулем (с «просветлением»); показатели числа гранулем с лимфоидным валом в опытных и контрольной группах не различались. У мышей 1 и 2 й групп наблюдалось достоверное увеличение по сравнению с контролем числа ретикулоэндотелиальных клеток. Число лимфоцитов и двуядерных гепатоцитов было сходным в сравниваемых группах. Таким образом, на 14е сут. экспериментального туберкулеза у мышей в легких под влиянием Глутоксима, примененного в дозах 1 и 5 мг/кг, выявлено достоверное снижение лимфоцитов всоставе воспалительного инфильтрата, что указывает на иммунотропный эффект препарата. В печени, по данным морфометрического исследования у мышей, получавших Глутоксим в дозах 0,08 и 0,5 мг/кг, отмечена активация макрофагального звена: увеличено число гранулем и среди них более зрелых со светлым центром, а также увеличено число диффузно рассеянных ретикулоэндотелиальных клеток, среди которых большую часть составляют клетки Купфера (тканевые макрофаги).На 21е сут. после заражения мышей МБТ влегких животных всех групп выявлялись обширные сливающиеся между собой очаги интерстициальной пневмонии. В печени определялись гранулемы, большая часть которых была с просветлением в центре и перигранулемным лимфоидным валом. По ходу печеночных балок отмечалась умеренно выраженная ретикулоэндотелиальная реакция и скудная инфильтрация диффузно рассеянными лимфоцитами. По морфометрическим данным, в легких мышей опытных групп, леченных Глутоксимом, выявлялась тенденция к снижению распространенности пневмонии. При этом показатель объемной плотности очагов у мышей 2 й группы был достоверно ниже, чем в контрольной. В составе воспалительного инфильтрата в легких мышей отмечено снижение содержания нейтрофилов и лимфоцитов(см. табл. 2). В печени у мышей 2, 3, 4 й групп увеличивалось по сравнению с данными в контроле число гранулем в целом, а также число гранулем с «просветлением» и гранулематозным лимфоидным валом. Отмечено также увеличение числа ретикулоэндотелиальных элементов под влиянием Глутоксима. Таким образом, на 21 е сут. после заражения МБТ в легких мышей, леченных Глутоксимом, отмечено уменьшение распространенности пневмонии, что сопровождалось снижением содержания в составе воспалительного инфильтрата нейтрофилов. Выявленная динамика морфологическихизменений в легких свидетельствует об иммунокорригирующем действии Глутоксима на гранулематозный воспалительный процесс. Указанный эффект, по видимому, реализуется через систему цитокинов, в частности, за счет снижения продукции IL-8, что приводит к снижению содержания нейтрофилов в составе воспалительного инфильтрата. По данным исследования воспалительного процесса в печени под влиянием Глутоксима, отмечается активация макрофагального звена: повышается число гранулем и гранулем со светлым центром, увеличивается число диффузно рассеянных купферовских клеток.
Данные морфометрии представлены в табл. 2, морфологическая характеристика воспалительного процесса впечени приведена в табл. 3. Анализируя данные морфологического исследования течения туберкулезного воспалительного процесса в различные сроки под влиянием разных доз Глутоксима, можно отметить следующие закономерности. Глутоксим в сроки 7 и 14 сут. наблюдения после заражения не утяжеляет течение воспалительного процесса в легких и печени. На 21 е сут. под влиянием Глутоксима выявлена положительная динамика: в легких тенденция к снижению распространенности пневмонии и уменьшению выраженности экссудативного компонента воспалительной реакции; в печени ускорение эволюции гранулем. Кроме того, в печени под воздействием этого препарата увеличивается число ретикулоэндотелиальных элементов, большую часть которых составляют клетки купфера. Таким образом, влияние Глутоксима на развитие гранулематозного процесса реализуется в основном за счет влияния на систему макрофагальных клеток. Глутоксим не оказывает гепатотоксического действия, более того, на ранних этапах развития туберкулезной инфекции стимулирует пролиферативную активность гепатоцитов. При анализе данных по влиянию Глутоксима натечение туберкулезного процесса в зависимостиот его дозы выявлен оптимальный эффект во 2 и3й группах наблюдения, т.е. при использовании доз 0,5 и 1,0 мг/кг.
Заключение
Глутоксим положительно влияет на динамику развития туберкулезного воспаления. Он уменьшает выраженность экссудативного компонента и распространенность туберкулезной пневмонии и усиливает отграничительные реакции в гранулемах печени.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева С.Н., Сапожникова Н.В., Виноградова Т.И. и др. Экспериментальноклиническая эффективность применения глутоксима во фтизиатрии //11 Нац. конгресс по болезням органов дыхания: Тезисы докладов.М.,2001.С. 244.
2. Кноринг Б.Е., Симбирцев А.С., Сахарова И.Л. и др. Изменения в продукцииIL-1a , фактора некроза опухоли TNFa и IL-2 в зависимости от состоянияиммунитета у больных туберкулезом // Пробл. туберкулеза.1994.№ 4.С. 31–35.
3. Селицкая Р.П., Пономарева Ю.Ю. Функциональная активность антигенов HLAI и II класса при туберкулезе легких // Пробл. туберкулеза.1996.№ 1.С. 47–49.
4. Шендерова Р.И., Якунова О.А., Новикова Н.С. и др. Иммунорегуляция прииммунопатологии, вызванной туберкулезной инфекцией // Иммунология.1998. № 6.С. 25.
