Е.В. Маркелова, Б.И. Гельцер, И.В. Корявченкова, А.В. Костюшко Владивостокский государственный медицинский университет Состояние системы цитокинов при нозокомиальных пневмониях
Е.В. Маркелова, Б.И. Гельцер, И.В. Корявченкова, А.В. Костюшко Владивостокский государственный медицинский университет Состояние системы цитокинов при нозокомиальных пневмониях
Представлены результаты исследований системы цитокинов у больных с нозокомиальными пневмониями разной степени тяжести и этиологии. Показана преимущественная активация Th2 лимфоцитов, что предопределяет недостаточность реакций клеточного типа при нозокомиальных пневмониях. Установлено, что увеличение уровней IL- 6, IL- 8, IL- 10 с резким падением уровня IFN? в динамике заболевания является прогностически неблагоприятным.
Полученные результаты расширяют представление о цитокин опосредованных механизмах повреждения легких. Ключевые слова: нозокомиальные пневмонии, цитокины, Th2лимфоциты. Несмотря на достижения в изучении патогенеза и терапии пневмоний, до настоящего времени не удалось достигнуть существенных изменений в уровнях заболеваемости и смертности [7, 9, 10]. Но зокомиальная пневмония (НП) занимает второе место в структуре госпитальных инфекционных осложнений [3, 4, 12]. НП является серьезным и частым осложнением, развивающимся у 5–10 больных из 1000 госпитализированных в стационар, а в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) это осложнение составляет 7–44 % [1, 2]. У больных, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ), заболеваемость несравнимо выше — от 20 до 76 %, а летальность возрастает примерно в 3 раза, достигая 50–80 % [2, 12]. НП, развивающиеся на фоне вторичных иммунодефицитных состояний (в том числе и в послеоперационном периоде), ухудшают прогноз и создают угрозу жизни пациента. Известно, что иммунный ответ включает в себя разнонаправленные типы эффекторных механизмов, каждый из которых оптимален в отношении определенных патогенов. При этом субпопуляции Т хелперов играют ключевую роль в регуляции функций иммуноцитов посредством продукции цитокинов, обладающих оппозиционными (про и противовоспалительными) эффектами. Оппозиционные пулы цитокинов — IFN? и IL-4, IL-10 — рассматриваются как маркеры Th1 иTh2лимфоцитов, из которых IFN? усиливает кле$ точно$опосредованный иммунный ответ, а IL-4 и IL-$10 — гуморальный [13, 15]. Определенное количество цитокинов необходимо для адекватного иммунного ответа и защиты при патологии легких [7, 11, 14]. Нарушение продукции, секреции и рецепции противовоспалительных цитокинов приводит к глубоким дефектам антиинфекционной защиты, вплоть до развития «иммунологического паралича», и усугубляет прямое повреждающее действие микроорганизмов и их токсинов на легочную ткань [15]. Также увеличение секреции провоспалительных цитокинов или дисбаланс со$ отношения оппозиционных пулов могут играть важную роль в патогенезе пневмоний за счет уси$ ления агрегации лейкоцитов к сосудистому эндотелию, стимуляции его прокоагулянтной активности, привлечения в очаг воспаления избытка эффекторных клеток, что в конечном итоге усиливает патоиммунологический каскад [7, 8, 13] и приводит к цитокинопосредованному повреждению легких [15]. Однако к настоящему времени имеются лишь фрагментарные исследования патогенетической роли и терапевтической эффективности системы цитокинов при НП. Целью настоящего исследования явилось изучение содержания оппозиционных цитокинов в сыворотке крови больных НП и характеристика их спонтанной и индуцированной продукции клетками крови обследованных. В исследование были включены 198 больных с НП, находившихся на лечении в ОРИТ Краевой клинической больницы г. Владивостока за период 1997–2000 г. Диагноз «пневмония» во всех случаях устанавливали на основании характерных для данного заболевания эпидемиологических, клиникорентгенологических и лабораторных данных.
Рис. 1. Уровень цитокинов в сыворотке крови больных нозокомиальной пневмонией.
По степени тяжести все пациенты с НП были распределены в соответствии с согласованным заявлением Американского торакального общества и медицинского отделения Американской пульмонологической ассоциации [3]. Мы выделили три основные группы: 1ю (52 чел.) составили пациенты со среднетяжелой НП; 2 ю (71чел.) — пациенты с тяжелой НП и самостоятельным дыханием, 3 ю (75 чел.) — с тяжелой НП, находившихся на ИВЛ. Как известно, больные, находящиеся на ИВЛ, подвергаются особой опасности инфицирования нижних дыхательных путей [1, 2]. Такое распределение, по мнению многих пульмонологов, отражает не только степень тяжести пациентов, но и спектр потенциальных возбудителей НП [1, 4]. У большинства — 146 человек (73,7 %) — пневмония развилась после планового или экстренного торакоабдоминального оперативного вмешательства на 4,3 ± 0,4$е сут. Менее чем у трети — у 26,3 % — НП была диагностирована на фоне тяжелой терапевтической патологии на 5,3 ± 0,8$е дни. Лечение проводили в соответствии с общепринятыми стандартами интенсивной терапии данной категории больных. Средние сроки лечения составили 19,6 ± 1,3 дня, летальность — 28,1%. Верификацию возбудителей НП производили общепринятыми микроскопическими и бактериологическими методами. У больных с НП преобладала грамотрицательная флора (56 %), в 32 % случаев обнаружены грамположительные микроорганизмы, а у 12 % обследованных выявлены миксткультуры бактерий, что соответствует результатам, полученным другими исследователями [1, 2, 4, 7]. Среди грамотрицательных бактерий преобладали Ps. аerugi nosa, а среди грамположительных — aureus. Они же чаще встречаются в миксткультурах. Нами не было обнаружено существенной разницы в частоте встречаемости выделенных возбудителей у больных НП среднетяжелого и тяжелого течения со спонтанным дыханием. Однако, у лиц, находящихся на ИВЛ, отмечено значительное преобладание Ps. аeruginosa (78,6 %) как в монокультуре, так и в сочетании с другими грамотрицательными (E. coli, Acinetobacter spp.) и грампо$ ложительными микроорганизмами (чаще . aure us). Причем, в отличие от двух первых анализируемых групп, полимикробный характер возбудителей зарегистрирован практически у половины больных НП, находящихся на ИВЛ (48 %). Для исследования спонтанной и индуцированной продукции цитокинов (TNF?, IL-1?, IL-$4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN?) кровь брали из локтевой вены в две стерильные силиконовые пробирки с гепарином (150 ед/мл, Venoject, Terumo, Belgium), разбавляли (1:5) стерильной средой RPMI 1640 (Flow Laboratories, USA), содержащей 30 мг/мл глутамина и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, USA). Клет$ ки крови инкубировали в течение 24 ч при 37°С при слабом покачивании: в одной пробирке с добавлением липополисахарида (ЛПС) из E. coli (Sigma, USA, серотип 055:В5, 10 мкг/мл), в другой — без него. Пробирки охлаждали, центрифугировали 10 мин при 800 g, супернатант отбирали в стрипповые плоскодонные микропланшеты и замораживали при —186 °С. Количественное определение уровня синтеза цитокинов проводили через 6 и 24 ч от начала инкубации. Определение цитокинов в сыворотке крови и супернатантах проводили специфическим ИФА с использованием реактивов R&D Diagnostics Inc. (USA) согласно прилагаемой инструкции на иммуноферментном анализаторе «Multiscan» (Финлян$ дия). Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл. Индекс стимуляции высчитывали как соотношение показателей индуцированного ЛПС и спонтанного тестов. У пациентов с НП зарегистрирована гиперцитокинемия за счет как про, так и противовоспалительных цитокинов с максимальной концентрацией IL-6, IL-$8, IL-$10 и TNF?. По мнению ряда авторов, IL-1?, IL-6, IL-8, TNF? накапливаются в крови при интенсивных воспалительных процессах и адекватно отражают тяжесть их течения [8, 11, 15]. Установлено закономерное нарастание провоспалительного IL-1? во всех обследованных группах. В то же время увеличение концентрацииTNF? было статистически значимым только в 1 и 2$й группах. Уровень IL-6, IL-8 у пациентов разных групп резко превышал аналогичные показатели контроля, а их количество особенно значительно нарастало при «вентиляторассоциированной» НП. Нами отмечена тенденция к снижению IFN? уже в дебюте заболевания у больных 2 й группы по сравнению с 1 й и выраженный разброс индивидуальных уровней IFN?, вплоть до его полного отсутствия у пациентов с тяжелой «вентиля торассоциированной» НП (от 0 до 193,03 пг/мл при среднем уровне 84,33 ± 26,73 пг/мл). Нами зафиксировано, что при НП происходит увеличение IL-4 в сыворотке крови в 7,5 раза, но еще резче (в 20 раз) возрастает уровень IL-10. IL-10 является самым сильным ингибитором синтеза макрофагами IL-1 и TNF?, а также Th1маркерного цитокина — IFN?. Результатом прямого и опосредованного действия IL-10 в избыточных концентрациях является снижение экспрессии молекул HLADRкласса, подавление антигенпрезентирующей и цитотоксической функции макрофагов/моноцитов, натуральных киллеров и нейтрофилов, имеющих важное значение в антибактериальной защите [13, 15]. Известно, что микроорганизмы и их токсины могут прямо и опосредованно влиять на цитокиновый каскад. Развитие инфекции, ассоциированной с Ps. aeruginosa, характеризуется значительным угнетением клеточного звена иммунитета [5, 8]. При этом установлено, что Ps. aeruginosa способна подавлять фагоцитарную и бактерицидную активность макрофагов, угнетать продукцию IFN? и, вероятно, изменять способность иммунокомпетентных клеток продуцировать другие цитокины. В связи с этим нами изучен цитокиновый профиль пациентов с тяжелой НП, вызванной Ps. aeruginosa. В качестве групп сравнения были выбраны пациенты с тяжелой НП, возбудителем которой был aureus и микстинфекция (Ps. aeruginosa и . aureus) (табл. 1).
Таблица 1 Уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных тяжелой нозокомиальной пневмонией в зависимости от этиологии
Исследования позволили установить повышение IL-1?, IL-6 и IL-8 в крови пациентов с тяжелой пневмонией, ассоциированной с Ps. aeruginosa, тогда как IFN? при этом варианте легочной инфекции был снижен. Подобная закономероность зафиксирована и у больных с тяжелой НП, вызванной микстформа ми. Повидимому, возбудители НП оказывали различное влияние на содержание IL-4 и IL-10. Так, если уровень IL-4 не зависел от вида патогена, то IL-10 был выше при синегнойной инфекции, чем при стафилококковой НП (р < 0,05). Вероятно, это отражает способность Ps. aeruginosa оказывать прямое повреждающее действие на легочную ткань, что в определенной мере связано с высокими адгезивными свойствами этого грамотрицательного микроорганизма и его тропностью к эпителию трахеи и бронхов [4]. В динамике заболевания содержание провоспалительных цитокинов зависело от особенностей клинического течения НП (табл. 2). Так, у больных 1 и 2й групп зафиксирован фазный характер изменений уровня IL-1?: на 5е сут. резко увеличивалась его концентрация в системном кровотоке с последующим падением к 15 му дню. Причем у пациентов со среднетяжелой НП на 15 е сут. его уровень приближался к показателю здоровых людей (р < 0,05). У больных с «вентиляторассоциированной» НП также установлено достоверное снижение IL-1? в динамике заболевания, но его содержание на 15е сут. было существенно выше, чем у пациентов 1 и 2 й групп. Достаточно интересной и, на первый взгляд, парадоксальной оказалась динамика TNF? у пациентов со среднетяжелой НП. Нами зарегистрирован его трехкратный рост на 5 е сут. заболевания с последующим резким снижением на 15е сут. (р < 0,001). Учитывая, что TNF? продуцируется моноцитами/макрофагами и Th1 лимфоцитами, кратковременное повышение его уровня, очевидно, активизирует клеточноопосредованные иммунные реакции, дисфункция которых, как показано нами ранее, часто встречается у больных НП [6]. Это подтверждается динамикой IFN? у данной категории больных: существенный рост иммунного интерферона наблюдался уже к 5 му дню заболевания с последующей тенденцией к увеличению на 15 е сут. болезни. При тяжелой НП динамика IFN? была менее выражена. В то же время у большинства больных с тяжелой НП содержание TNF? в системном кровотоке снижалось, начиная с 5 го дня. Наиболее существенно в начале заболевания увеличивались концентрации IL-6 и IL-8. Уровень этих интерлейкинов увеличивался в 30 и 12 раз соответственно, причем это увеличение было прямо пропорционально тяжести воспалительного процесса в легочной ткани. В динамике заболевания зарегистрировано снижение уровня этих полипептидов. Медленнее этот процесс происходил у больных с тяжелой НП: к 15му днюданные показатели все еще существенно превышали уровень контроля. Это, по нашему мнению, подчеркивает особую роль IL-6 и IL-8 в патогенезе НП. Вероятно, именно эти интерлейкины, и в меньшей степени TNF?, индуцируют цитокинопосредован ное повреждение легочной ткани у больных НП. Обращала на себя внимание динамика IL-4 у больных тяжелой НП, находящихся на спонтанном дыхании. В этой группе зафиксировано резкое повышение IL-4 на 5 й день заболевания с последующим столь же резким (более чем в 3 раза) падением на 15 е сут. болезни. Тогда как при НП средней тяжести уровень IL-4 практически не изменялся в разные дни инфекционного процесса, а его среднее количество не превышало 5,23 ± 0,35 пг/мл. Причем наиболее высокие его показатели зарегистрированы в первый день заболевания. Подобная, но более выраженная закономерность получена при анализе содержания IL-4 в сыворотке крови больных с НП, находящихся на ИВЛ: количество IL-4 было максимальным в первые сутки болезни, снижаясь к 5 му дню более чем в 2 раза, с последующим монотонным уровнем до 15го дня (12,85 ± 2,41; 5,88 ± 0,45; 5,72 ± 0,36 пг/мл соответственно). Динамика IL-10 во всех исследуемых группах была одинакова: его пик определялся в разгаре заболевания с последующим снижением в 1,2–1,8 раз на 5й день болезни с дальнейшим плавным уменьшением. Для оценки прогностической ценности исследования цитокинового профиля у больных НП нами было изучено содержание IL-1?, IL-6, IL-8, TNF?, IFN?, IL-4 и IL-10 в сыворотке крови выживших и умерших пациентов. При этом мы сочли целесообразным провести частотный анализ показателей у больных с тяжелой НП (летальность — 28,1%). Установлено, что для больных с тяжелой НП наиболее характерен рост IL-6. При этом выявлена тесная прямая корреляционная зависимость (r = 0,87, p < 0,01) IL-6 с летальностью и ее обратная зависимость (r = 0,65, p < 0,05) от IFN?. Зарегистрировано также некоторое повышение IL-10 при неблагоприятном прогнозе НП. Однако корреляционный анализ выявил лишь слабую прямую связь (r = 0,31, p > 0,05) между этими показателями. Представления о характере изменений цитокинового статуса у больных НП были существенно дополнены при изучении способности клеток крови обследуемых продуцировать цитокины в условиях in vitro. Нами исследована их продукция — спонтанная и индуцированная ЛПС . Для максимального приближения эксперимента к условиям in vivo изучение продукции цитокинов проводили при культивировании цельной крови. С учетом того, что скорость экспрессии, секреции и продукции различных цитокинов неодинакова, нами предварительно было проведено исследование оптимального времени взаимодействия крови с ЛПС. Как оказалось, для IL-1? и IL-8 оптимальным было культивирование клеток в течение 6 ч, тогда как для исследования IL-6, IL-4, IL-10 и IFN? — 24 ч. В результате исследований установлено, что у пациентов с
Таблица 2 Содержание цитокинов в периферической крови больных нозокомиальной пневмонией в динамике заболевания (М ± m), пг/мл
Таблица 3 Показатели продукции цитокинов in vitro клетками крови обследуемых
НП резко повышается спонтанная способность клеток периферической крови продуцировать большинство цитокинов, за исключением IFN? и IL-1?, что является признаком их активации in vivo (табл. 3). При исследовании спонтанной продукции IL-6 клетками крови больных с НП нами зафиксировано существенное (в десятки раз) его повышение по сравнению с его уровнем у здоровых доноров. Установлены достоверные прямые корреляции между спонтанной продукцией и уровнем циркулирующего в крови IL-6 (r = 0,77; p < 0,001). Однако величина индуцированной продукции IL-6 не зависела от степени тяжести НП. При анализе спонтанной продукции другого воспалительного цитокина — IL-8 установлены изменения, близкие с таковыми для I6: происходило достоверное повышение спонтанной продукции этого цитокина клетками крови больных. Индуцированная ЛПС продукция IL-8 у пациентов с НП, напротив, была снижена. При утяжелении состояния больных с НП зафиксировано нарастание спонтанной секреции IL-8 на фоне снижения способности клеток к его продукции под воздействием дополнительной антигенной стимуляции ЛПС. Анализ спонтанной способности мононуклеаров периферической крови секретировать IL-4 показал, что клеточная активность различна у больных НП и здоровых людей. Так, у пациентов с НП спонтанная продукция IL-4 усиливалась (p < 0,001), а индуцированная не отличалась от показателей контроля (7,07 ± 0,4 против 7,86 ± 0,2 пг/мл, р > 0,05). Мы обратили особое внимание на динамику IL-10, который является продуктом Th2 лимфоцитов и макрофагов и мощно ингибирует клеточноопосредованный иммунный ответ. У больных с НП зафиксировано повышение спонтанной и индуцированной продукции IL-10. Однако индекс ЛПС стимулированной продукции IL-10 был более чем в два раза ниже, чем у здоровых людей (1,5 ± 0,05 против 3,8 ± 0,1, р < 0,01). При этом у больных с НП разной степени тяжести индекс ЛПС индуцированной стимуляции синтеза IL-10 был практически одинаковым. Крайне низкой оказалась и способность клеток больных НП отвечать на стимуляцию продукцией иммунного интерферона (30,0 ± 4,8 против 295,0 ± 24,1 пг/мл у здоровых, р < 0,001). Выявлена прямая корреляционная взаимосвязь между низкой продукцией IFN? клетками крови и сывороточным уровнем IFN? (r = 0,83, p < 0,01). Итак, усиление спонтанной продукции цитокинов и нарушение их соотношения у больных НП свидетельствует об активации Th2 клеток (увеличение продукции IL-6, IL-4, IL-10) [15]. Это, в свою очередь, указывает на дисбаланс регуляторных процессов, ответственных за поддержание оптимального уровня клеточной активности. Последний развивается на фоне снижения спонтанной продукции IFN?, что усугубляет иммунопатологические нарушения. Отсутствие адекватного ответа клеток на стимуляцию ЛПС позволяет судить об истощении их резервных возможностей и «иммунологическом параличе». Указанные изменения являются основанием для использования в комплексном лечении тяжелых форм НП иммунокорригирующих препаратов с заместительно инициирующим действием.
Выводы 1.
У больных НП регистрируется выраженная гиперцитокинемия с дисбалансом провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, что способствует активации Th2 лимфоцитов. Указанные сдвиги свидетельствуют о развитии иммуннодефицитного состояния клеточного типа у данной категории больных.
2. Исследование спонтанной и индуцированной продукции цитокинов клетками крови больных НП показало, что нарушается способность лей коцитов к адекватному ответу на дополнительный стимул, что свидетельствует об истощении их резервных возможностей.
3. Прогностическими признаками неблагоприятного исхода заболевания служат увеличение вдинамике патологического процесса уровней IL-6, IL-8, IL-10 с резким падением уровня IFN?.
4. При НП, вызванных Ps. aeruginosa, выявлены наиболее глубокие иммунные нарушения, которые проявились резким увеличением концентрации в крови IL-6, IL-10, IL-8 на фоне недостаточности IFN?, что предопределяло глубокий дефект клеточноопосредованного иммунитета.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белобородов В.Б. Вентиляторассоциированная пневмония: диагностика, профилактика и лечение // ConsIL-ium Medicum. — 2000.— Т.
2, № 10. — С. 405–410. 2. Гельфанд Б.Р., Гологорский В.А., Белоцерковский Б.З. и др. Нозокомиальная пневмония в отделениях интенсивной терапии // Анестезиол. Реаниматол. — 1999.— № 3.— С. 38–46.
3. Госпитальная пневмония у взрослых: диагностика, оценка тяжести заболевания, начальное антимикробное лечение и стратегии профилактики // Рус. мед. журн.— 1998. — Т. 2, № 5 (спец. прилож.).
4. Зубков М.Н., Зубков М.М. Госпитальные пневмонии: этилогия, патогенез, диагностика, профилактика и лечение // ConsIL-ium Medicum. — 2000.— Т. 2, № 1. — С. 32–38.
5. Иммунодефицитные состояния / Под ред. В.С. Смирнова и И.С. Фрейдли на.— СПб.: «Фолиант», 2000.— 568 с.
6. Маркелова Е.В. Система цитокинов у больных с острыми повреждениями легких и клиникоиммунологическое обоснование терапии лейкинфероном: Автореф. дис. дра мед. наук.— Владивосток, 2000.
7. Путов Н.В., Симбирцев С.А. Клинические и экспериментальные аспекты пульмонологии // Вестн. РАМН.— 1998.— № 1.— С. 34–38.
8. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2000.— 231 с. 9. Чучалин А.Г. Пневмония — актуальная проблема медицины // Тер. арх.— 1995.— № 3.— С. 3–7.
10. Чучалин А.Г. Пульмонология в России и пути ее развития // Пульмонология.— 1998.— № 4.— С. 6–22.
11. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник.— М.: Медицина, 1999.— 608 с.
12. Яковлев С.В. Госпитальная пневмония: вопросы диагностики и антибактериальной терапии // ConsIL-ium Medicum.— 2000.— Т. 2, № 10.— С. 400–404.
13. Abbas A., Lichtman A., Rober J. Cellular and molecular immunology.— New York: W.B. Saunder Company, 1991.— 420 p.
14. Bona C., BonIL-la F. Textbook of immunology (Second ed.). — Amsterdam: Har word Acod. Publ, 1996.— 406 p. 15. Thomson A. (Ed.) The Cytokine Handbook.— London: Acad. Press., 1992.— 418 p.
Cytokine system in nosocomial pneumonia patients E.V. Markelova, B.I. Geltser, I.V. Koryavchencova, A.V. Kostushko Vladivostok State Medical University, Vladivostok
The article presents the results of cytokine system investigation in patients with different clinical and etiological forms of nosocomial pneumonia. Prevalent activation of Th2 lymphocytes, revealed in pa tients, can be related to cellular immune deficiency in nosocomial pneumonia. The increase of IL- 6, IL- 8 and IL- 10 levels, associated with significant fall of IFNg was found to be prognostically unfavour able. Obtained data enlarge preconceived idea of cytokine mediated mechanisms of lungs injury. The obtained data elucidate cytokine mediated mechanisms of lungs injury. Key words: nosocomial pneumonias, cytokines, Th2 lymphocytes.
