загрузка...
 
А.Ю. Громова, В.И. Кабанова, А.А. Казаков, А.В. Демьянов,Н.И. Кузнецов,  А.С. Симбирцев ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт Петербург; Санкт Петербургская медицинская академия последипломного образования МЗ РФВлияние полиморфизма генов IL1? и IL1R aна эффективность терапии рекомбинантным IL1 (Беталейкин) больных хроническим вирусным гепатитом С
Повернутись до змісту

А.Ю. Громова, В.И. Кабанова, А.А. Казаков, А.В. Демьянов,Н.И. Кузнецов,  А.С. Симбирцев ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт Петербург; Санкт Петербургская медицинская академия последипломного образования МЗ РФВлияние полиморфизма генов IL1? и IL1R aна эффективность терапии рекомбинантным IL1 (Беталейкин) больных хроническим вирусным гепатитом С

У 60 пациентов с хроническим гепатитом С (ХГС) анализировали распределение аллельных вариантов генов семейства IL1 и взаимосвязи между их присутствием и уровнями репликации вируса гепатита С в сыворотке крови больных, выраженностью цитолитического синдрома до и в течение 1,5 лет после системной терапии рекомбинантным IL1 (68 нг/кг, 10 инъекций через день), уровнем лихорадки и индукцией  экспрессии  генов  IL1 и  IL1Ra в мононуклеарах периферической крови после первой инъекции этого препарата. Полиморфизм генов тестировали методами ПЦРиПДРФПЦР, экспрессию генов на уровне мРНК определяли методом ОТПЦР. У больных присутствие гомозиготного полиморфного варианта  гена  IL1(–511) определялось в 5 раз чаще, чем у доноров (96 человек). Кроме того, в 3 раза чаще встречался гомозиготный высокопродуцирующий вариант  гена  IL1(+3953) и в 2 раза чаще гомозиготный  вариант  гена  IL1?(–889). Наблюдалась  тенденция к увеличению  среди больных числа носителей варианта  гена  IL1Ra2  (VNTR).Носители  гомозиготного высокопродуцирующего варианта  гена  IL1(+3953) наряду  с относительно низкими показателями АЛТ до лечения, как правило, отвечали высокой и обязательной температурной реакцией (> 38 °C) на первое введение рекомбинантного IL1, сопровождающейся индукцией в мононуклеарах крови экспрессии эндогенного IL1. Однако эффективность терапии экзогенным IL1? у таких лиц была незначительна. У больных с гомозиготным нормальным вариантом гена IL1, а также у носителей высокопродуцирующего варианта гена  IL1Ra2 прослеживалась обратная  тенденция: более высокие показатели цитолитического  синдрома долечения ассоциировались с низкими значениями лихорадки вплоть до ее отсутствия при введении пациентам рекомбинантного IL1; первое введение препарата вызывало у этих лиц снижение интенсивности  экспрессии  гена  IL1 и повышение  экспрессии  IL1Ra.  Терапия рекомбинантным IL1 для носителей гомозиготного нормального варианта гена IL1?  и высокопродуцирующего варианта гена IL1Ra2 является высоко эффективной, так как позволяет значительно снизить показатели цитолитического синдрома и уровень репликации вируса гепатита С в сыворотке крови не&зависимо от варианта  генотипа вируса  гепатита С. Согласно полученным результатам,  генетический полиморфизм IL1  и IL1Ra может оказывать существенное влияние на характер протекания хронического гепатита С и восприимчивость больных к терапии рекомбинантным аналогом IL1. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 3. С. 17–25.)

Ключевые слова: хронический  гепатит С, рекомбинантный  IL1?, Беталейкин,генетический полиморфизм, лихорадка, АЛТ.

Результаты цитокиновой терапии оказались столь обнадеживающими, что это направление активно развивается в России и за рубежом. Однако опыт клинического применения рекомбинантных аналогов цитокинов показал, что действуют эти препараты выборочно. Многим пациентам такая терапия существенно помогает, удругих терапевтический эффект выражен слабееили отсутствует, в ряде случаев наблюдаютсявыраженные побочные реакции. Среди исследователей и клиницистов все большую поддержкуполучает мнение о том, что терапия должна быть индивидуальной. Поиск факторов, определяющих индивидуальную чувствительность к цитокиновой терапии, позволит применять ее более обоснованно и результативно.Рекомбинантный интерлейкин 1 (IL1?) под коммерческим названием Беталейкин  (БЛ) разрешен МЗ РФ к клиническому применению. Биологические свойства этого медиатора, такие как стимуляция костномозгового кроветворения, перестройка иммунопоэза, активация метаболизма соединительной ткани, усиление пролиферации фибробластов и эпителиальных клеток  (рано заживляющее действие), в настоящее время с успехом используются в клинической практике для лечения онкологических, инфекционных, хирургических, ЛОР и др. заболеваний  [5]. Комплексным клинико лабораторным исследованием установлен высокий лечебный эффект препарата БЛ у больных хроническим вирусным  гепатитом С(ХГС) [2–4]. Однако эффективность лечения и степень выраженности побочных реакций при системном введении этого препарата, в частности лихорадки, у отдельных больных существенно различаются. Причины индивидуальной восприимчивости определяются рядом факторов. Одним изних может являться полиморфизм генов, кодирующих белки семейства IL1, в частности, наличие в них небольших мутационных изменений—точечных замен нуклеотидов, тандемных повторов частей  гена. Кластер  генов  IL1 находится на хромосоме 2q13 и содержит гены IL1? и IL1?, рецептора IL1 и рецепторного антагониста IL1 (IL1Ra),строение которых консервативно. Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков этого семейства играет одну из ключевых ролей в развитии  воспалительного процесса  [5]. Установлена ассоциация носительства отдельных аллелей  генов семейства  IL1 с рядом аутоиммунных, инфекционных и воспалительных заболеваний  [11–13, 15, 19]. Выявлены аллельные ассоциации этих генов, ответственные за измененный характер экспрессии и продукции кодируемых белков, характер протекания, исход воспалительных реакций и восприимчивость к ним. Относительно продукции IL1Ra при ряде заболеваний существуют противоположные результаты: в нескольких более ранних источниках сообщается о сниженном или неизмененном уровне выработки этого белка у носителей  IL1Ra2(VNTR). Однако в большинстве литературных работ убедительно доказывается, что этот вариант  гена ответствен за повышенную выработку IL1Ra [7, 10, 12, 19]. Причем носительство варианта  IL1Ra2 связано с повышенной активность гена IL1Ra как в ходе воспаления, так и у здоро!вых лиц, а также с редуцированной продукцией IL1?  [7, 12]. В то же время моноциты лиц, гомои гетерозиготных по аллелю IL1?(+3953), продуцируют, соответственно, в 4 и 2 раза большее количество  IL1, чем моноциты лиц,  гомозиготных по нормальному аллелю этого гена [13]. Таким  образом, присутствие в  геноме сочетаний IL1(+3953)+IL1Ra2– и IL1(+3953)–IL1Ra2+может оказывать существенное влияние на соотношение экспрессии IL1? и IL1Ra. Введение в организм с терапевтической целью рекомбинантного IL1 также может влиять на этот баланс и, как упоминалось выше, переносится больными индивидуально. Согласно данным литературы, введение в организм экзогенного IL1 индуцирует увеличение продукции мононуклеарами периферической крови эндогенного IL1 [8].Определение взаимосвязей полиморфизма  генов семейства IL1 с балансом экспрессии и продукции соответствующих белков, температурной реакцией организма на введение рекомбинантного аналога IL1?, дозой препарата, биохимическими, иммунологическими показателями и его клинической эффективностью позволит приблизиться к пониманию индивидуального характера воспалительного ответа. В данной работе анализировалась взаимосвязь присутствия у пациентов с ХГС аллельных вариантов генов семейства IL1 с уровнями репликации вируса  гепатита С в сывротке крови, выраженностью цитолитического синдрома до и в течение 1,5 лет после терапии БЛ, уровнем лихорадки и индукцией экспрессии генов IL1? и  IL1Ra в лимфоцитах периферической крови после первой инъекции препарата.

Материалы и методы

Курс лечения БЛ был проведен 60 пациентам с ХГС. В группу включали  только больных  с  уровнем аланиновой  трансаминазы  (АЛТ), не более чем в 5 раз превышающим значения нормы. Контрольную группу составили 96 доноров. Препарат БЛ назначали в дозе 6–8 нг/кг в течение 20 дней (10 инъекций через день). Во время лечения  у ряда больных отмечались ожидаемые  умеренно выраженные побочные  эффекты (головная боль, боль в  суставах, повышение  температуры тела), которые появлялись непосредственно после инъекции препарата и держались в течение 2–3 ч. Ни у одного из больных не наблюдалось осложнений, вызвавших отмену препарата.  Температурную реакцию организма в ответ на первое введение БЛ, не превышающую 36,9 °С, классифицировали  как нормальную, как субфебрильную— в интервале 37–37,9 °С, и как фебрильную— свыше 38 °С [1].Материалом для молекулярно генетического анализа полиморфизма  генов семейства  IL1 служили образцы высокомолекулярной ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови больных и здоровых лиц с использованием реагента для выделения ДНК  (TriReagent, «Sigma»). Варианты  генов,несущие точечные замены нуклеотидов: IL1?(–889) в промоторном регионе;  IL1?(–511) в промоторном регионе иIL1?(+3953) в районе 5 го экзона, определяли методом ПДР Фанализа продуктов ПЦР амплификации  специфических  участков генома с использованием праймеров, синтезированныхв НПФ «Литех»,  соответствующих параметров  температурных циклов и ферментов рестрикции  («Sigma»)  (табл. 1). ПЦРеакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси с использованием TET aq ДНК полимеразы и  соответствующего  готового буфера  («Сибэнзим»). Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 2–3% ном агарозном  геле, окрашивали бромистым  эти дием и визуализировали в У Ф свете. В качестве маркера размера фрагментов ДНК использовали набор  маркеров  молекулярного  веса  с  шагом  100  п.о.(«Сибэнзим»). При отсутствии  замены нуклеотидов детектировались

Таблица  1 Исследованные аллельные варианты генов IL-1

 

Таблица  2 Условные сокращения, принятые для обозначениясочетаний генов  IL1 и  IL1Ra

 

Примечание.  сочетания не встречались.

два фрагмента, при мутации продукт амплификации оставался целым,  у  гетерозиготных индивидов определялись три фрагмента ДНК. Генотипирование IL1Ra проводили в тех же  условиях методом ПЦР: амплифицировали  участок ДНК, содержащий  тандемные повторы по 86 п.о.  (VNTR)  в районе интрона 2, аллельный  тип определяли по длине получаемого продукта амплификации при  электрофоретическом разделении. Нормальный, более часто встречающийся вариант  гена IL1Ra  содержит четыре  таких повтора, наиболее  значимый из полиморфных вариантов, аллель  IL1Ra2, — два повтора, остальные варианты  этого  гена встречаются крайне редко—суммарно менее, чем у 1 % популяции [19], и в данной работе не рассматривались. Для краткого обозначения аллелей были приняты следующие сокращения: нормальный, не несущий мутацию аллель обозначали цифрой 1, полиморфный—цифрой 2,  ген,  гомозиготный по нормальному варианту аллеля —«1/1», ген, гомозиготный по полиморфному варианту—«2/2»,гетерозиготный ген—«1/2». Варианты «2» генов IL1? (+3953)и  IL1Ra2 в дальнейшем именуются  как высоко продуцирующие, варианты «1» генов IL1? и  IL1Ra —как низкопродуцирующие. «Провоспалительные»  IL1?(+3953)+/IL1Ra2–,«противовоспалительные»  IL1?(+3953)–/IL1Ra2+ и относительно «нейтральные» варианты генотипов обозначали, как указано в  табл. 2.Экспрессию генов  IL1? и  IL1Ra на уровне мРНК тестировали до начала терапии БЛ методом ОТПЦР с конечной электрофоретической детекцией количества полученного амплификата. Образцы  тотальной РНК выделяли из 3–5?106 лимфоцитов, полученных из крови больных, с использованием TRI Reagent  («Sigma»). кДНК  синтезировали в реакции обратной  транскрипции при инкубации 1 мкг  тотальной РНК вмкл реакционной  смеси,  содержащей 100 Е обратной  транскриптазы MMuLV, по 1 мМ каждого  dNTP,  готовый реакционный  буфер  («Сибэнзим»),  10  Е  ингибитора  РНКаз(«Fermentas») и 0,1 мкг гексануклеотидных праймеров («Литех»). Инкубация продолжалась 1 ч  (10 мин —  при  94  °С,45 мин — при 42 °С, 5 мин — при 95 °С). ПЦР с кДНК проводили в 10 мкл реакционной смеси в присутствии специфических праймеров: для  IL1? — 5'CG (величина  фрагмента 204 п.о.); для  IL1Rа — 5'GG 3'  (424 п.о.), фермента GAPDH5' (176 п.о.), синтезированных в НПФ «Литех». Режим амплификации  составлял 30 циклов  (1 мин—94 °С, 1 мин—61 °С,1 мин—72 °С) с финальной инкубацией 10 мин при 72°С. Пластины с гелем помещали на стекло трансил люминатора и фотографировали видеокамерой («Литех»), полученные результаты обрабатывали с помощью пакета программ Gel Imager иGel Analysis  («Литех»). В качестве позитивного контроля для каждой пробы определялась экспрессия фермента GAPDH, постоянно  экспрессирующегося в клетке. Индекс  экспрессии генов цитокинов на  уровне мРНК рассчитывали для каждой пробы как соотношение интенсивности флуоресценции в гелеполосы цитокина и GAPDH. Спонтанную и индуцированную продукцию IL8 клетками крови больных определяли с помощью тест системы ООО «Цитокин»  (СПб.). Количественное ПЦР определение РНК вируса гепатита С и его генотипов выполнено в  городском диагностическом вирусологическом центре С.Петербурга с помощью тест систем Amplicor (Швейцария).Статистическую обработку результатов осуществляли  с использованием  точного метода Фишера, критериев Манна —Уитни и Крускала — Уоллеса. Влияние на эффективность  терапии БЛ оценивали при помощи регрессии Кокса, где в качестве события принималось достижение нулевого уровня репликации вируса  гепатита С в  сыворотке крови. Численные данные приведены в виде M ± SE, медиан  значений.

Результаты и обсуждение

Было проанализировано распределение аллельных вариантов  генов семейства  IL1 и их сочетаний у больных и доноров. У пациентов с ХГС присутствие гомозиготного гена IL1?(–511) определялось в 5 раз чаще, чем у доноров. Кроме того, в  3  раза  чаще  встречался  гомозиготный  ген IL1?(+3953) и в 2 раза чаще— гомозиготный ген IL1?(–889). Наблюдалась тенденция к увеличению среди  больных  числа  носителей  варианта IL1Ra2, а также лиц с генотипом RA+. Согласно данным литературы, вариант  IL1Ra2 чаще встречается в ассоциации с вариантом IL1?(–511)и редко присутствует совместно с вариантом IL1?(+3953)  [10]. Эта закономерность обнаружена и в наших исследованиях. В остальных случаях не было выявлено каких либо различий в частоте встречаемости вариантов аллелей генов семейства IL1, их сочетаний и распределения внутри групп (табл. 3 и 4). Согласно нашим данным, среди больных и доноров ни разу не встречалось совместное носительство гомозиготных вариантов «2/2»  генов IL1?(+3953) и IL1Ra2 и сочетаний гомозиготного  гена IL1? (+3953) и гетерозиготного IL1Ra2. Также изучалось влияние полиморфизма генов семейства IL1 на появление побочного эффекта—повышения температуры тела после внутривенного введения БЛ. Известно, что IL1 является основным медиатором в механизме развития лихорадки, благодаря чему в литературе он часто обозначается как эндогенный, или лейкоцитарный, пироген. В нормальных условиях он не проникает через  гематоэнцефалический барьер. Однако при нарушении иммунного гомеостаза IL1 достигает пре оптической области передней части  гипоталамуса и взаимодействует с рецепторами нейронов центра терморегуляции. Посредством активации циклооксигеназы, синтеза простагландинов, повышения внутриклеточного уровня ц АМФ происходит перестройка активности центров теплопродукции и теплоотдачи  с повышением образования тепловой энергии и снижением тепловыделения, что и обусловливает повышение температуры тела  [9, 14]. Носительство вариантов  генов  IL1?(–889) и IL1?(–511) не коррелировало со встречаемостью лихорадки после введения БЛ. Однако носительство генетических вариантов IL1? (+3953)и IL1Ra2, ответственных за повышенную выработку соответствующих белков при воспалительном ответе, существенно влияло на этот показатель. Согласно полученным результатам  (табл. 5), фебрильные температурные значения наблюдались более чем у 70 % носителей  гомозиготного по высоко продуцирующему варианту гена IL1? (+3953).Среди лиц с таким аллельным типом не встречались пациенты с отсутствием лихорадки после введения БЛ. С другой стороны, у носителей гомозиготного по высоко продуцирующему варианту  гена  IL1Ra2 температурный скачок после инъекции БЛ всегда отсутствовал. При рассмотрении полученных данных, с точки зрения носительства сочетаний этих генов  (рис. 1), наблюдалась та же тенденция: лица, имеющие генотип В+,в 85,7 % случаев имели высокие температурные значения после введения экзогенного IL1?, у носителей  генотипа RA+ фебрильная температурав 100 % случаев отсутствовала. При тестировании интенсивности экспрессии

Таблица  3 Частота носительства (%) вариантовгенов IL1 и IL1Ra у больных ХГС и доноров

 

Таблица  4 Частота носительства сочетаний вариантов генов IL1 и IL1Ra у больных и доноров

 

Таблица  5 Частота встречаемости лихорадки у пациентов с ХГСпосле первой инъекции БЛ (%)

 

генов IL1? и IL1Rа на уровне мРНК в мононуклеарах периферической крови  (рис. 2, б) у носителей генотипа RA+ через сутки после начала лечения БЛ наблюдались достоверное снижение индекса экспрессии эндогенного IL1? и тенденция к повышению индекса экспрессии  гена  IL1Ra, а у носителей  генотипа В+, напротив, достоверное повышение индекса экспрессии IL1? и тенденция к снижению IL1Ra по сравнению с соответствующими значениями до введения БЛ. Наиболее различались уровни  экспрессии  гена  IL1? после первой инъекции БЛ у носителей наиболее полярных сочетаний генов IL1? и IL1Ra —«2/2» IL1?(+3953)+/«1/1» IL1Ra2– и«1/1»IL1?(+3953)/«2/2»IL1Ra2+ (рис. 2,  а). После  окончания курса инъекций БЛ у всех больных снижалась экспрессия IL1? и повышалась экспрессия  IL1Ra. Таким образом, у лиц сХГС, имеющих генотип  В+, после первого введения экзогенного IL1? индуцировалась экспрессия эндогенного  IL1?, что сопровождалось высоким температурным ответом организма. У носителей генотипов RA+ отмечалась обратная  тенденция—экспрессия  гена  IL1? снижалась и температура тела практически не повышалась. Следует отметить, что данные, полученные нами при тестировании интенсивности экспрессии генов IL1? и IL1Rа ,согласуются с результатами Е.С. Романовой  [4]:при тестировании спонтанной продукции  IL1? мононуклеарами периферической крови все пациенты с ХГС также разделялись на две группы. У больных с низким уровнем спонтанной продукции этого цитокина до лечения наблюдалось увеличение этого показателя после терапии БЛ, в группе больных с высоким значением продукции IL1? до  лечения—снижение. При тестировании этим автором уровня IL1Ra в сыворотке крови после курса терапии БЛ отмечалось его повышение у всех больных. С другой стороны, по данным C.A. Dinarello, введение в организм экзогенного IL1?, как правило, индуцирует увеличение продукции мононуклеарами периферической крови эндогенного IL1?  [8]. У больных с ХГС, обследованных нами, после инъекции БЛ экспрессия гена IL1? как повышалась, так и снижалась, что определялось носительством перевесных сочетаний  генов  IL1? иIL1Ra и соотношением экспрессии соответствующих белков до начала терапии. Согласно данным литературы, уровень продукции клетками крови IL8 при ХГС повышен; кроме того, наиболее адекватно и выраженно при введении БЛ изменяются показатели продукции именно этого цитокина [2]. В настоящей работе мы также определяли влияние полиморфизма изучаемых генов на характер спонтанной и индуцированной продукции  IL8  in vitro клетками крови больных. До терапии БЛ у всех пациентов эти показатели были выше значений нормы (спонтанная продукция  IL8—0–500 пг, индуцированная—2000–10000 пг), кроме пациентов с генотипом «2/2»IL1?(+3953), у которых показатели продукции  IL8 были сравнимы с параметрами здоровых лиц (табл. 6). Достоверно более высокий уровень спонтанной  (p < 0,01) и индуцированной (p < 0,05) продукции  IL8 выявляли у пациентов

 

Рис. 1. Проявление  температурной реакции на введение БЛу больных ХГС  с различными  сочетаниям и аллелей  генов  IL1? и  IL1Ra Распределение температурных реакций достоверно при р <  0,05.

 

Рис. 2. Уровни  экспрессии  генов  IL1? и  IL1Ra в  клетках  крови  у больных ХГС до  терапии и через сутки после  первой инъекции Беталейкина. а) фотография агарозного геля, показывающая  интенсивность  флюоресценции  полос  цитокинов  у носителей  сочетаний «2/2»IL1?(+3953)/«1/1»IL1Ra  и«1/1»IL1?/«2/2»IL1Ra2,  1 —  за  1  сутки  до  началатерапии БЛ, 2 — через 1  сутки после первой инъекции БЛ;б)  средние  значения индексов  экспрессии  у пациентов  сгенотипами B+ и RA+

с вариантом «1/1» гена IL1?(+3953) по сравнению с носителями варианта «2/2». При оценке влияния IL1Ra2 на эти показатели установлено, что носителей варианта «2/2»IL1Ra2 уровень индуцированной продукции достоверно ниже(p < 0,05), чем у лиц с вариантом «1/1» этого гена; та же тенденция наблюдалась при оценке спонтанной продукции  IL8. На 1 сут после инъекции БЛ уровень спонтанной продукции достоверно увеличивался у носителей варианта «1/1» гена IL1?(+3953),однако на 7 сут этот показатель практически не отличался

Таблица  6 Показатели продукции IL8  in vitro клеткамикрови обследуемых больных до терапии (пг/мл)

 

Примечание. Достоверность  различий:  —  p < 0,05, p < 0,01.

Таблица  7 Количество частиц вируса гепатита Св сыворотке крови больных до и через месяцпосле терапии БЛ (медианы значений)

 

Примечание.  различия достоверны при p < 0,025.

от значения до применения БЛ. У носителей варианта «2/2»IL1Ra2 наблюдалась тенденция к небольшому повышению уровня индуцированной продукции IL8 на 1 е сут и снижению через 7е сут после начала лечения; через месяц после введения БЛ этот показатель достоверно снижался в сравнении с его значением до терапии БЛ. Мы проанализировали также связь носительства разных аллельных вариантов генов семейства IL1 с показателями эффективности терапии БЛ. Носительство  генов  IL1? (–889) и  IL1? (–511) не оказывало достоверного влияния на уровень АЛТ как до, так и после лечения. У носителей высоко продуцирующего варианта «2/2» гена IL1? (+3953)уровень АЛТ до терапии БЛ был в 1,7–2 раза ниже, чем у лиц с нормальным вариантом этого  гена (рис. 3). Таким образом, носительство  гомозиготного варианта гена IL1? (+3953), ответственного за повышенную выработку  IL1?, ассоциируется с более низкими значениями АЛТ при ХГС. У пациентов с генотипами RA+ наблюдался достоверно более высокий уровень АЛТ до лечения, чем у больных с генотипами В+ и B=RA. Значительное (в 1,5–2,5 раза) снижение уровня АЛТ через месяц после терапии БЛ отмечалось у носителей генотипов «1/1»IL1?/«1/1»IL1Ra и RA+. Зависимость появления температурной реакции на введение БЛ и уровня АЛТ до и через месяц после начала терапии представлена на рис. 4: наблюдалась обратная корреляция показателей лихорадки на введение БЛ и уровня АЛТ через месяц после начала лечения (r = –0,32, p < 0,05). Наиболее значимо эта разница проявлялась у носителей полярных  генотипов. При носительстве  гомозиготного высоко продуцирующего варианта  гена  IL1Ra2 введение экзогенного I1? приводило к наибольшему уменьшению уровня АЛТ. У носителей гомозиготного по высоко продуцирующему варианту гена IL1?(+3953) уровень АЛТ до терапии БЛ был в 2,5 раза ниже, чем у лиц с  гомозиготным высоко продуцирующим вариантом  IL1Ra2 (рис. 5). При ретроспективном наблюдении в течение 1,5 лет после курса инъекций БЛ у носителей варианта «2/2»IL1Ra2, ассоциированного с более высоким уровнем цитолитического синдрома, введение БЛ приводило к значительному уменьшению уровня АЛТ через 1–3 мес. после терапии. Кроме того, этот показатель не увеличивался в течение всего срока наблюдения. До лечения у носителей «2/2»IL1Ra2 уровень репликации вируса в сыворотке крови был значительно (p < 0,025) ниже, чем у носителей варианта «1/1»IL1Ra  (табл. 7). Согласно данным литературы, та же тенденция отмечается у лиц, гомозиготных по варианту «2/2»IL1RaL1Ra2 может являться протективным фактором, ограничивающим репликативную активность вируса  гепатита С. Однако у носителей нормального и гетерозиготного варианта этого  гена наблюдалось значительное снижение уровня репликации вируса, а у носителей варианта «2/2»IL1Ra2 этот показатель (до лечения наиболее низкий) через месяц после курса БЛ практически не изменялся. С другой стороны, при анализе влияния носительства  

 

Рис. 3. Уровни АЛТ  у больных ХГС  с  различными  сочетаниями генов  IL1? и  IL1Ra до и  через месяц после введения БЛ

 

Рис. 4. Уровни АЛТ до и через 1 месяц после  терапии БЛу пациентов  с ХГС и  значения лихорадки при введении препарата

 

Рис. 5. Динамика изменения  уровней АЛТ  (медианы  значений)в  течение 1,5 лет после  курса инъекций БЛ

 

IL1Ra2 и сочетаний  генов  IL1? и  IL1Ra, определяющих перевес в сторону выработки  IL1Ra,ассоциируется с более высоким уровнем АЛТ и,таким образом, является одним из прогностически неблагоприятных условий для течения ХГС. Сдругой стороны,  гомозиготность по высокопродуцирующему варианту  гена  IL1?(+3953) может являться протективным фактором, уменьшающим поражение печени при этом заболевании. Тем неменее, у носителей гомозиготного высокопродуцирующего варианта  гена  IL1?(+3953) терапия БЛ не оказывает достоверного влияния на уровни АЛТи репликации вируса гепатита С в сыворотке крови в течение всего срока наблюдения.В целом, носители гомозиготного высокопродуцирующего варианта гена IL1? (+3953) наряду сотносительно низкими показателями АЛТ и более высоким уровнем репликации вируса гепатита Св сыворотке крови отвечают высокой и обязательной температурной реакцией на первое введение рекомбинантного  IL1, сопровождающееся индукцией в лимфоцитах крови экспрессии эндогенного IL1?. Однако эффективность терапии БЛв указанных дозах у таких лиц, в общем, незначительна. У больных, имеющих гомозиготный низкопродуцирующий вариант этого гена, а также у пациентов с  генотипами RA+, прослеживается обратная тенденция: более высокие показатели АЛТи более низкие показатели репликативной активности вируса в сыворотке крови до лечения ассоциируются с низкими значениями лихорадки вплоть до ее отсутствия при введении  пациентам БЛ. Первое введение препарата вызывает у этих лиц снижение интенсивности экспрессии гена IL1? и повышение экспрессии IL1Ra. Терапия БЛ для носителей этих вариантов генов высокоэффективна, так как позволяет значительно снизить уровень АЛТ и репликацию вируса гепатита С в сыворотке крови. Присутствие в  геноме больных с ХГС сочетаний генов  IL1?(+3953)+IL1Ra2– и  IL1?(+3953)–/IL1Ra2+, оказывающих влияние на соотношение экспрессии кодируемых белков как до лечения, таки после введения экзогенного IL1?, от части объясняет индивидуальную восприимчивость больных к терапии БЛ и характер побочных реакций. Выявление аллелей IL1?  (+3953)+, IL1Ra2 и генотипов В+ и RA+ позволяет со значительной долей вероятности предсказать  развитие лихорадки при введении препарата БЛ, и, вероятно, поможет скорректировать схему его введения.M. Hurme с соавторами высказано следующее положение: уровень  IL1Ra в плазме крови скоординированно и совместно регулируется генами IL1? и  IL1Ra, а носительство  IL1Ra2 ответственно за повышенный уровень как циркулирующего  IL1Ra, так и  IL1?, увеличенная активация экспрессии и продукции которого является следствием сверх выработки  IL1Ra  [10]. Согласно этой версии, при реализации воспалительного ответа у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки IL1Ra количество этого белка больше, чем необходимо для адекватного хода воспаления, что вызывает компенсаторное образование еще большего количества IL1?. Но и IL1Ra в ответ вырабатывается тоже больше. Таким образом, носительство сочетаний генов  IL1? и  IL1Ra, определяющих перевес в сторону выработки IL1Ra, приводит к более продолжительному воспалительному ответу и является одной из причин хронизации воспаления [10,19]. У пациентов, имеющих высокие значения АЛТи продукции IL8, ХГС протекает более агрессивно [2–4], однако именно эти больные являются носителями  генотипа  IL1R2. А носительство  генотипа  IL1?(+3953) ассоциируется с более мягким вариантом течения ХГС, так как связано с низкими значениями АЛТ и уровнем продукции IL8. Известно, что поражение печени при ХГС может являться результатом  не  только прямого цитопатического действия вируса  гепатита С, но и иммуноопосредованных реакций [2–4]. Дисрегуляция воспаления, ассоциированная с генотипом  IL1Ra2, возможно, является одним из ключевых факторов иммунологически опосредованного поражения печени при ХГС, тогда как генотип IL1? (+3953), связанный с высокой продукцией  IL1?, способствует большей защите печени при этом заболевании.Как известно, терапия рекомбинантным IL1? (БЛ) наиболее эффективна при хроническом протекании воспаления  [5]. С другой  стороны, при носительстве высоко продуцирующего варианта  гена IL1? (+3953) и сочетаний  генов  IL1? и  IL1Ra, определяющих перевес в сторону выработки IL1?, воспаление протекает более бурно и скоротечно [10,19]. Но этот вариант  гена  IL1? также встречается у лиц с ХГС и ассоциируется с более низкими значениями АЛТ у обследованных пациентов, несмотря на высокие значения репликативной активности вируса гепатита С в сыворотке крови. Анализ представленных данных позволяет предположить, что введение экзогенного IL1?, регулирует описанный дисбаланс воспалительного ответа у носителей сочетаний  генов  IL1? и  IL1Ra, определяющих перевес в сторону выработки IL1Ra, и, несмотря на характер генотипа вируса гепатита С, эффективно при ХГС, так как способствует адекватной реализации и завершению воспаления. Возможно, с целью повышения эффективности терапии БЛ для носителей высоко продуцирующего варианта гена IL1?(+3953) необходимо применять препарат в меньшей дозе—до возникновения фебрильных значений температурного ответа организма и повышения уровня экспрессии  IL1? в клетках крови. Однако этот вопрос требует дальнейшего изучения. Механизм хронизации гепатита С до сих пор не вполне  ясен. Помимо прямого цитопатического вирусного эффекта большое значение имеют механизмы, опосредованные состоянием внутренней среды («факторы хозяина»). В литературе существуют разные точки зрения на удельный вес и преобладание каждого из патогенетических факторов в общей картине этой патологии. К «факторам хозяина», оказывающим влияние на характер течения гепатита С и степень его хронизации,относят характер иммунного ответа на вирусные белки, профиль HLA антигенов [16, 17]. Согласно полученным нами результатам, генетический полиморфизм семейства IL1 также ассоциируетсяс ХГС и может оказывать существенное влияние на характер протекания этого заболевания и восприимчивость к терапии рекомбинантным аналогом IL1?.

Выводы

1. Носительство аллелей IL1?(+3953) и IL1Ra2 достоверно влияет на эффективность иммуномодулирующей  терапии  рекомбинантным IL1? больных с ХГС.2. Наиболее эффективна при ХГС терапия Беталейкином для носителей  гомозиготного низко продуцирующего варианта гена  IL1?и сочетаний генов IL1? и IL1Ra, определяющих перевес в сторону выработки  IL1Ra; наименее  эффективна—для носителей гомозиготного высоко продуцирующего вариантагена

ЛИТЕРАТУРА

1. Виноградов А.В. Дифференциальный диагноз внутренних болезней. — М.:Медицина, 1988. — 592 с.

2. Конусова В.Г, Романова Е.С., Чурилова И.В. и др. Изменение показателей оксидантного и цитокинового статуса больных хроническим вирусным  гепатитом В и С при лечении препаратом рекомбинантного интерлейкина 1? человека // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 20–27.

3. Романова Е.С. Рахманова А.Г., Симбирцев А.С. и др. Результаты лечения больных гепатитами В и С рекомбинантным интерлейкином  // Эпидемиол. инфекцион. болезни. — 2000. — № 3. — С. 29–32.

4. Романова Е.С. Клиникоиммунологическое обоснование применения Беталейкина в комплексной терапии вирусных гепатитов В и С: Автореф. дис. …канд. мед. наук. — СПб., 2000. — 23 с.

5. Симбирцев А.С. Биология семейства интерлейкина человека // Иммунология. — 1998. — № 2. — С. 9–17.

6. Arend W.P. The balance between IL1 and IL1Ra in disease // Cytokine GrowthFactor Rev. — 2002. — Vol. 13. — P. 323–340.

7. Danis V.A, Millington M., Hyland V.J., Grennan D. Cytokine production by normal human monocytes:  intersubject  variation and  relationship  to an  IL1 receptor antagonist gene polymorphism // Clin. Exp. Immunol. — 1995. —Vol. 99. — P. 303–310.

8. Dinarello C.A. Biologic basis  for  IL1  in disease  // Blood. — 1996. —Vol. 87, № 6. — P. 2095–2147.

9. Foreman J. C. Pyrogenesis / Textbook of Immunopharmacology. — Blackwel Scientific Publications, 1989. — P. 199–206.

10. Hurme M., Santtila S. IL1 receptor antagonist (IL1Ra) plasma levels are coordinately regulated by both IL1Ra and IL1beta genes // Eur. J. Immunol. —1998. — Vol. 28. — P. 2598–2602.

11. Hurme M., Lahdenpohja N., Santtila S. Gene polymorphisms of interleukins 1and 10  in  infectious and autoimmune diseases  // Ann. Med. — 1998. —Vol. 30. — P. 469–473.

12. Perrier S., Coussediere C., Dubost J.J. et al. IL1 receptor antagonist (IL1RA)gene polymorphism  in Sjogren’s  syndrome and  rheumatoid arthritis  //  Clin.Immunol. Immunopathol. — 1998. — Vol. 87. — P. 309–313.

13. Pociot F., Molvig J., Wogensen L. et al. A TaqI polymorphism  in  the humaninterleukin1 beta (IL1 beta) gene correlates with IL1 beta secretion in vitro// Eur. J. Clin. Invest. — 1992. — Vol. 22. — P. 396–402.

14. Saper C.B., Breder C.D. Endogenous pyrogens  in  the CNS:  role  in  the  febrileresponse // Prog. Brain Res. — 1992. — Vol. 93. — P. 419–428.

15. Sehouli J., Mustea A., Konsgen D. et al. Polymorphism of IL1 receptor antagonistgene: role in cancer // Anticancer Res. — 2002. — Vol. 22. — P. 3421–3424.

16. Tassopoulos N.C., Papatheodoridis G.V., Katsoulidou A. at al.  Factors  associated with severity and disease progression  in chronic hepatitis C // Hepatogastroenterology. — 1998. — Vol. 45. — P. 1678–1683.

17. Thursz M., Yallop R., Goldin R. et al. Influence of MHC class II genotype on outcome of infection with hepatitis C virus. The HENCORE group. Hepatitis C European Network for Cooperative Research // Lancet. — 1999. — Vol. 354. —P. 2119–2124.

18. Tsukuma H., Hiyama T., Tanaka S. et al. Risk factors for hepatocellular carcinoma among patients with chronic liver disease // N. Engl. J. Med. — 1993. —Vol. 328. — P. 1797–1801.

19. Witkin S.S., Gerber S., Ledger W.J.  Influence of  interleukin1  receptor antagonist gene polymorphism on disease // Clin. Infect. Dis. — 2002. — Vol. 15. —P. 204–209.

20. Witkin  Linhares I.M., Gerber S. et al. Interleukin1 receptor antagonistgene polymorphism and circulating levels of HIV1 RNA in Brazilian women// J. Virol. — 2001. — Vol. 75. — P. 6242–6244.

The influence of IL1? and IL1Ra genes polymorphism on efficacy of treatment withrecombinant IL1? (Betaleukin) in chronic hepatitis C patientsA.Yu. Gromova1, V.I. Kabanova2, A.A. Kazakov1, A.V. Demyanov1, N.I. Kuznetsov2, A.S. Simbirtsev11State Research Institute of Highly Pure Biopreparations;2Medical Academy of Postgraduate Education, St. PetersburgWe studied the distribution of IL1 gene family allelic variants  in 60 chronic hepatitis C (CHC) patientsand  their  relation  to hepatitis C virus (HCV)  replication  rate, cytolysis syndrome before and during 1.5years after  systemic  therapy with  recombinant  IL1  (68 ng/kg, 10  injections every  second day),  thelevel of  fever,  and  changes of  IL1 and  IL1Ra genes expression  in peripheral blood mononuclear  cells(PBMC) after the first injection of this drug. Genetic polymorphism and gene expression were studied by PCR,RFLPPCR and  semiquantitative RTPCR,  respectively.  In CHC patients  the homozygous  IL1(–511) genotype was  found  five  times more  frequently, homozygous  IL1(+3953) —  three  times, and homozygous IL1(–889) — two times more frequently than in normal controls (n = 96). The incidence of ILRa2 (VNTR)allele was also slightly higher  in CHC patients. The homozygous carriers of highly&producing IL1? (+3953)allele had  relatively  low pre&treatment  serum ALT  levels and developed higher  fever  (> 38 °C) upon  thefirst  injection of  recombinant  IL1, accompanied by elevated endogenous  IL1 expression  in PBMC. Butthe efficacy of therapy with exogenous IL1 was  low  in such patients. In contrast, patients with homozygous wildtype IL1 as well as homozygous carriers of highly&producing ILRa2 allele had more  intensivecytolysis syndrome before treatment and  lower fever or  lack of  fever after recombinant IL1 administration; the first injection of the drug was followed by a decrease of IL1 gene expression and an increase ofILRa gene expression. Recombinant  IL1  therapy was highly effective  in homozygous wildtype  IL1 ?and homozygous ILRa2 carriers as  it caused significant attenuation of cytolysis syndrome and reducedserum HCV replication rate independent of HCV genotype. According to our results, the polymorphism ofIL1? and IL1Ra genes considerably influence the natural course of chronic hepatitis C and the responseto recombinant IL&1? ?  therapy. (Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, No. 3. P. 17–25.)

Key words: chronic hepatitis C, human recombinant IL1, Betaleukin, gene polymorphism, fever, ALT.



загрузка...