загрузка...
 
А.Н. Восканьянц, В.А. Нагорнев ГУ Научно исследовательский институт  экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург Пролиферация клеток стенки артерий человека при атерогенезе как фактор проявления иммунного воспаления
Повернутись до змісту

А.Н. Восканьянц, В.А. Нагорнев ГУ Научно исследовательский институт  экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург Пролиферация клеток стенки артерий человека при атерогенезе как фактор проявления иммунного воспаления

В статье обсуждается проблема иммунного воспаления в стенке артерий при атерогенезе. Основное внимание уделено пролиферации мононуклеаров (макрофагов и лимфоцитов) и  гладкомышечных клеток — клеточным популяциям, экспрессирующим цитокины и факторы роста.  (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 4. С. 10–13.)

Ключевые  слова: иммунное воспаление, пролиферация, мононуклеары,  гладкомышечные  клетки.

К концу 70 х годов А.Н. Климовым и В.А. Нагорневым [13] была окончательно обоснована концепция, позволяющая рассматривать атеросклероз с позиции иммунного ответа на модифицированные липопротеиды низкой плотности (мЛПНП). В настоящее время атерогенез оценивается как вариант развития иммунного воспаления в стенке артерий [2, 11, 12]. При этом большое значение придается не только мЛПНП, но и ряду других факторов, например, облигатным паразитам и, в первую очередь, Chlamydia pneumoniae [4, 7]. Оценка атерогенеза с позиций иммунного воспаления позволила рассматривать кинетику клеток стенки артерий с учетом экспрессии цитокинов и межклеточной кооперации: макрофаг—Т лимфоцит—гладкомышечная клетка  (ГМК). Экспрессия негранулярными лейкоцитами  (моноцитами/макрофагами, лимфоцитами) провоспалительных цитокинов и факторов роста сопровождается пролиферацией клеток. Однако при атеросклерозе этот процесс остается неизученным. В то же время известно, что мЛПНП стимулируют экспрессию клетками сосудистой стенки IL1?, TNF?, IFN?, обеспечивающими каскадный цитокиновый ответ [2, 3, 11]. Среди цитокинов, экспрессируемых активированными макрофагами, эндотелиальными клетка  ми и ГМК, при атерогенезе большое внимание уделяется MCP 1 и M CSF  [6]. Моноцитарное/ макрофагальное дифференцирование в пенистые клетки осуществляется при участии M CSF, который также стимулирует пролиферацию макрофагов и играет ключевую роль в последующих стадиях их дифференцирования, поддерживая функциональную способность клеток в атероматозном ядре атеросклеротических бляшек [5]. В отличие от ранее существовавшей точки зрения, было показано, что моноциты/макрофаги, мигрирующие в сосудистую стенку, не только трансформируются в пенистые клетки, но также включаются в реакции иммунного воспаления. Это позволило выделить популяции макрофагов секреторного и цитотоксического фенотипов, не участвующие в скевенджер захвате мЛПНП, но экспрессирующие провоспалительные цитокины  [15]. Возникает вопрос: какова природа макрофагов, продуцирующих цитокины? Высказано предположение, что, по видимому, источником популяции макрофагов секреторного и цитотоксического фенотипов являются клетки, пролиферирующие в субэндотелиальном слое и находящиеся в контакте с Т лимфоцитами [2]. С другой стороны, макрофаги—высокодетерминированные клетки, и, чтобы вызвать их пролиферацию, необходимы особые условия. Происходит ли действительно, наряду с ГМК, и пролиферация макрофагов в стенке артерий при атерогенезе — остается не  известным. Это обусловлено тем, что секционный материал не позволял проследить динамику пролиферации клеток; известно только о пролиферации клеток в интиме аорты кроликов  (использовали  3Н тимидиновую метку с последующей гисторадиоавтографией) при экспериментальной гиперхолестеринемии  [1]. При этом было показа  но, что включение  3Н тимидина в моноциты возможно уже на стадии фиксации клеток на эндотелиальной поверхности. Поэтому, для более полно  го изучения особенностей развития очагового иммунного воспаления в стенке артерий при атерогенезе было оправдано проведение специального исследования, направленного на качественный и количественный анализ пролиферирующих клеток в стенке артерий, с использованием современных иммуноцитохимических методов. Материалы и методы Работа была выполнена на  секционном материале, полученном во время вскрытия лиц, погибших от острой сердечно  сосудистой недостаточности. Для исследования использовали  аорту  и  левую  коронарную  артерию  с  различными атеросклеротическими проявлениями, включая липидные пят  на, липидные и фиброзные бляшки. Макроскопически неизмененные сегменты аорты были приняты за относительную норму. В работе был использован материал, полученный от 24 случаев (возраст от 49 до 70 лет, средний—61 год), исследовано 120  сегментов артерий. Материал фиксировали в 4% м параформальдегиде на фосфатном буфере (рН 7,4). Парафиновые срезы наносили на предметные стекла, покрытые адгезивным раствором  (Novocastra Lab. Ltd, England). Для иммуногистохимического исследования использовали мышиные моноклональные антитела против ядерного антигена пролиферирующих  клеток  [Anti Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), Clone: PC 10, «DAKO», Denmark], меченные пероксидазой  хрена  (HRP). Данные антитела реагируют  с  эпитопами ядерных антигенов в пролиферирующих клетках. Максимальная экспрессия PCNA характерна для клеток, находящихся в S фазе. В работе также использовали мышиные антитела к антигену Ki 67 (Ki 67 Antigen, Clone: Ki 67 серия М 7187, «DAKO», Denmark), меченные HRP. Эти моноклональные антитела связываются с ядерным белком Ki 67, который экспрессируется в пролиферирующих клетках, находящихся в G1, S, G2 и М фазах клеточного цикла. Сопоставление двух вышеприведенных методов показало практически идентичный результат  (длительный период полужизни белка PCNA в клетках, находящихся в S фазе). С  учетом  того, что использование антител к Ki 67 не всегда дает стабильный положи  тельный результат, основной раздел работы  с количественным анализом пролиферирующих клеток был выполнен с использованием антител к PCNA. При постановке иммуноцитохими  ческой реакции была использована  система визуализации EPOS  («DAKO»), «проявку» антигена осуществляли  хромогеном 3,3 диаминобензидином, докраску ядер непролиферирую  щих клеток осуществляли метиленовым  зеленым. При морфометрическом исследовании в каждом  случае подсчету подвергали 100 клеток при увеличении ? 500 в микроскопе «Opton», не используя морфометрическую сетку, численность изучаемых клеточных форм выражали в процентах. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли  с помощью  t критерия Стьюдента. С  учетом  того, что после иммуногистохимической окраски можно выявить два пула клеток: веретенообразновытянутые, среди которых пре  обладают ГМК, и округлой формы, среди которых присутствуют как макрофаги, так и лимфоциты, эти клетки были обозначены как мононуклеарные. Наибольший интерес представляли именно мононуклеары, поскольку наличие данных клеток свидетельствует о клеточных реакциях,  характеризующих, в первую очередь, развитие иммунного воспаления. Результаты и обсуждение В интиме макроскопически неизмененных сегментов артерий, отдаленных от атеросклеротических поражений, преобладают ГМК, количество которых более чем в 2 раза превышает число мононуклеарных клеток  (рис. 1). Причем 46 % ГМК находятся в функционально активном состоянии и участвуют в пролиферации. Однако при этом следует учитывать, что в данных случаях речь идет только о стенке неизмененных сегментов артерий на фоне прогрессирующего атеросклероза, что, конечно, отличает данный материал от истинной «нормы». Оце  нивать пролиферацию клеток в данной возрастной группе в стенке артерии при полном отсутствии атеросклеротических поражений не представляется возможным, т. к. в этой возрастной группе (средний возраст — 61 год) невозможно получить аорты или коронарные артерии без проявлений атеросклероза. Только в случаях смерти от алкоголизма с выраженным циррозом печени на секции можно наблюдать «чистые» артерии без каких либо про  явлений атеросклероза. Однако исследование такого материала не входило в задачу данной работы. В формирующихся липидных пятнах число ГМК в среднем в 3 раза меньше, чем при относи  тельной норме, но в то же время в 2,5 раза возрастает число мононуклеарных клеток  (см. рис. 1). Полученные данные указывают на то, что уже на самых ранних стадиях атерогенеза в стенке артерий происходит формирование очагов иммунного воспаления. Дело в том, что отложение или образование мЛПНП  insitu в субэндотелиальном

 

Рис.1. Индекс  количества мононуклеаров и  ГМК в интиме артерий человека при  атерогенезе

н. — относительная норма; л.п. — липидное пятно; л.б. — липидная бляшка; ф.б. — фиброзная бляшка (степени поражения сосудистой стенки астерогенезом).

слое интимы артерий сопровождается экспрессией клетками интимы IL 1? и TNF?, стимулирующих продукцию эндотелиоцитами ряда хемоадгезивных молекул и хемоаттрактантов.

В начальных стадиях атерогенеза над зоной отложения мЛПНП или иммунных комплексов, включающих мЛПНП, происходит очаговая экспрессия Е селектина, VCAM 1, ICAM 1, CC хемокина, M CSF, IL 8, иммунорегуляторного сигнала (CD40 CD40L), костимуляторных молекул В7.1, В7.2  [6, 10, 14, 18]. Именно эти реакции характеризуют «завязку» воспалительного процесса, поскольку обеспечивают адгезию и миграцию в стенку артерий не  гранулярных лейкоцитов  (мононуклеаров), что совпадает и по полученным данными, в которых отмечается резкое увеличение в липидных пятнах мононуклеарных клеток  (см. рис. 1). Это подтверждается и данными Xu Q. et al. [19], показавшими, что в липидных пятнах лиц старше 60 лет макро  фаги и Т лимфоциты составляют суммарно 39 % (28,8 ± 5,2 % и 10,3 ± 1,0 % соответственно) от общего числа клеток, а ГМК—15,8 ± 3,3 %. Важно отметить, что впервые проведенный количественный анализ пролиферирующих клеток при атерогенезе у человека показал возможность пролиферации мононуклеаров в интиме артерий (рис. 2 а, б). В среднем, в липидных пятнах индекс пролиферации мононуклеаров составил 30 % с положительной окраской на PCNA  (рис. 3). Эта тенденция сохраняется в липидных и фиброзных (краевые отделы) бляшках (см. рис. 3). Полученные данные подтверждают ранее высказанное предположение, что, по видимому, источником макрофагов, включающихся в реакции иммунного воспаления и участвующих в презентации антигенов Т клеткам, являются макрофаги, мигрирующие в стенку артерий и пролиферирующие  in situ  [15]. Полученные данные также совпадают с результатами исследований, показавших, что часть макрофагов (не содержащих в цитоплазме липидные вакуоли), присутствующих в очагах атерогенеза, экспрессирует белки II класса (HLA DR,  DQ), также как и TNF?, и продуцируют металлопротеиназу, т. е. оказывают цитотоксический эффект на окружающие клетки, эластические и коллагеновые волокна [9]. Эти же данные указывают на экспрессию Т клетками в интиме артерий  IFN?, ответственного за продукцию макрофагами MHCII  [16]. Такой анализ роли макрофагов в атерогенезе существенно отличается от ранее установившейся точки зрения, что моноциты/макрофаги, мигрирующие в стенку артерий, только участвуют в скевенджер захвате мЛПНП и трансформируются в пенистые клетки, что является ключевым моментом формирования атеросклеротических бляшек. Пенистые клетки, цитоплазма которых полностью заполнена липидными вакуолями, не в состоянии экспрессировать какие либо провоспалительные цитокины, поскольку все цитоплазматические структуры в них разрушены. Что касается ГМК (см. рис. 2 в, г), то индекс их пролиферации в липидных пятнах и липидных бляшках, в целом, совпадает с данными, отражающими пролиферацию мононуклеаров, однако в фиброзных бляшках данный показатель резко возрастает (см. рис. 3). Это объясняет причину образования фиброзной покрышки бляшек, т. к. увеличение пула активированных ГМК сопровождается синтезом волокнистых структур и, в первую очередь, соединительнотканных волокон.

 

Рис. 2. Пролиферация  клеток в  стенке  аорты человека при атерогенезе. Иммуногистохимия, использование моноклональных  антител  к PCNA, меченных пероксидазой  хрена

а — пролиферация мононуклеарных клеток в липидном пятне, ? 1000; б — в атеросклеротической бляшке (указано стрелками), ? 1000; в, г — пролиферация ГМК в липидной атеросклеротической бляшке (указано стрелками), ? 500, ? 1000.

 

Рис. 3. Индекс пролиферации  клеток в интиме  артерий человека при  атеросклерозе

Использованные в рисунке обозначения расшифрованы в примечании к рис. 1. О присутствии в атеросклеротических бляшках активированных ГМК также свидетельствуют данные, показывающие, что треть ГМК в интиме при атерогенезе экспрессируют HLA DR и, значит, мо  гут участвовать в презентации антигенов [16]. Большой процент клеток  (включая и ранее отмеченные мононуклеары) в очагах атерогенеза, экспрессирующих HLA DR, рассматривается как объективный признак выраженной активации клеток и их включения в реакции иммунного воспаления [17]. E. Filonzi et al. [8] показали, что ГМК, стимулированные IL1, TNF?, IFN? увеличивают экспрессию M CSF и GM CSF в атеросклеротических бляшках и, таким образом, также включаются в воспалительные реакции. Отсюда возможно, что пролиферация ГМК не только вызывает образование фиброзной ткани в бляшках, но также и стимулирует пролиферацию мононуклеаров и, в первую очередь, макрофагов. Снижение в фиброзных бляшках индекса пролиферации мононуклеаров  (см. рис. 3) связано с тем, что плотная фиброзная покрышка бляшек не «пропускает» негранулярные лимфоциты в интиму. Однако в краевых отделах фиброзных бляшек, имеющих рыхлое расположение волокнистых структур, число пролиферирующих мононуклеаров сохраняется на том же уровне, что и в липидных бляшках.

Заключение

Результаты проведенного исследования показали, что при атерогенезе в стенке артерий происходит активная пролиферация мононуклеарных клеток, наблюдающаяся на всех стадиях формирования атеросклеротических поражений. Именно пролиферирующие в стенке артерий клетки включаются в реакции иммунного воспаления, т. к. макрофаги гематогенного происхождения преимущественно участвуют в скевенджер  захвате мЛПНП и трансформируются в пенистые клетки, составляющие основу бляшек. Вероятно, клетки, выходящие из деления, составляют пул активированных клеток, участвующих в пара  и аутокринной  регуляции экспрессии цитокинов и поддерживающих иммунное воспаление по принципу замкнутой реакции с саморегуляцией.

ЛИТЕРАТУРА

1. Нагорнев В.А., Бабушкина Т.Г. Гисторадио автографический количественный анализ особенностей пролиферации клеток стенки аорты кроликов при экспериментальном атеросклерозе // Бюл. экспер. биол. — 1987. — № 1. — С. 104–106.

2. Нагорнев В., Анестиади В., Зота Е. Атерогенез. — Кишинев Санкт Петербург: Tipogr. Centrala, 2001. — 330 с.

3. Нагорнев В.А., Мальцева С.В., Восканьянц А.Н. Эволюция взглядов на роль макрофагов в атерогенезе: от Н.Н. Аничкова до наших дней // Арх. пат. — 2003. — Т. 65, № 2. — С. 8–12.

4. Нагорнев В.А., Мальцева С.В., Селиверстова В.Г. и др. Chlamydia pneumoniae как патогенетический фактор риска в развитии атеросклероза и его осложнений // Там же. — 2004. — Т. 66, № 2. — С.52–59.

5. Clinton S.K., Libby P. Cytokines and growth  factor  in atherogenesis // Arch. Pathol. Lab. Med. — 1992. — Vol. 116. — P. 1292–1300.

6. Clinton S.K., Underwood R., Hayes L. et al. Macrophage colony stimulating fac  tor gene expression in vascular cells and in experimental and human athero  sclerosis // Am. J. Pathol. — 1992. — Vol. 140. — P. 301–316.

7. Coombes B.K., Mahony J.B. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis: does the evidence  support a  causal or  contributory  role?  //  FEMS Microbiol.  Lett. — 2001. — Vol. 197. — P. 1–9.

8. Filonzi E.L., Zoellner H., Stanton H., Hamilton J.A. Cytokine regulation of gran  ulocyte macrophage colony stimulating factor and macrophage colony stimu  lating factor production in human arterial smooth muscle cells // Atheroscle  rosis. — 1993. — Vol. 99. — P. 241–252.

9. Galis Z.S., Sukhova G.K., Lark M.W., Libby P. Increased expression of matrix matalloproteinases and matrix degrading activity  in  vulnerable  regions of human atherosclerosis plaques  //  J. Clin.  Invest. — 1994. — Vol. 94. — P. 2493–2503.

10. Gimbrone M.A., Kume Jr.N., Cybulsky M.I. Vascular endothelial dysfunction and the pathogenesis of atherosclerosis // Atheroscler. Rev. — 1993. — Vol. 25. — P. 1–9.

11. Hansson G.K. Immune and inflammatory mechanisms in the development of ath  erosclerosis // Br. Heart. J. — 1993. — Vol. 69, Suppl. 1. — P. 38–41.

12. Hansson G.K., Jonasson L., Seifert P.S., Stemme S. Immune mechanisms in ath  erosclerosis // Arteriosclerosis. — 1989. — Vol. 9. — P. 567–578.

13. Klimov A.N., Zubzhitsky Yu.N., Nagornev V.A. Mechanisms of  lipoprotein pen  etration into the arterial wall leading to development of atherosclerosis // Ath  eroscler. Rev. — 1983. — Vol. 11. — P. 107–156.

14. Libby P. Li. H., Cybulsky M.I. Adhesion molecules in recruitment of mononuclear cells to the arterial intima // Atherosclerosis X: Elsevier Scien., 1995. — P. 582–585.

15. Nagornev V.A., Maltseva S. The phenotype of macrophages which are not trans  formed  into  foam  cells  in atherogenesis  // Atherosclerosis. — 1996. — Vol. 121. — P. 246–251.

16. Stemme S., Fager G., Hansson G.K. MHC class II antigen expression in human vascu  lar smooth muscle cells is induced by interferon gamma and modulated by tumor ne  crosis factor and lymphotoxin // Immunology. — 1990. — Vol. 69. — P. 243–249.

17. Stemme S., Holm J., Hansson G. T lymphocytes in human atherosclerotic plaques and memory  cells expressing CD4+ R and  the  integrin VLA 1  // Arterioscler. Thromb. — 1992. — Vol. 12. — P. 206–211.

18. Wick G., Schett G., Amberger A. et al. Is atherosclerosis an immunologically me  diated disease? // Immunol. Today. — 1995. — Vol. 16. — P. 27–33.

19. Xu Q., Obethuber G., Gruschwitz M. et al. Immunology of atherosclerosis: cel  lular composition and major histocompatibility complex class II antigen ex  pression in aortic intima, fatty streaks, and atherosclerotic plaques in young and aged human  specimens  // Clin.  Immunol.  Immunopathol. — 1990. — Vol. 56. — P. 344–359.

Human arterial wall cell proliferation in atherogenesis as a risk factor for immune inflammation A.N. Voskanyants, V.A. Nagornev Institute of Experimental Medicine RAMS, St. Petersburg

Problem of immune inflammation in the arterial wall during atherogenesis is discussed in this article. The most attention has been focused on proliferation of mononuclear cells (macrophages and lympho! cytes) and smooth muscle cells — cell populations expressing cytokines and growth factors. (Cytokines and  Inflammation. 2004. Vol. 3, № 4. P. 10–13.)

Key words:  immune  inflammation, proliferation, mononuclear phagocytes, smooth muscle cells.



загрузка...