загрузка...
 
Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск Интерлейкин 6 и отягощение исходов комбинированных радиационнотермических поражений
Повернутись до змісту

Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск Интерлейкин 6 и отягощение исходов комбинированных радиационнотермических поражений

 Изучена роль повышения содержания сывороточного интерлейкина 6 (IL6) в патогенезе отягощающего действия ожога на исходы лучевого поражения при комбинированном радиационно термическом поражении (КРТП). Мышей самцов (СВА ? С57Bl/6)F1 подвергали общему однократному облучению в дозе 7 Гр и  затем наносили  термический ожог на 10 % поверхности  тела. Установлено повышение концентрации IL6 в первые 6–24 ч и на 8 е  сут после КРТП. Введение моноклональных антител к IL6 за 1 ч до КРТП и в сроки через 1, 2, 3 сут после КРТП обеспечивало 30 суточную выживаемость 60 % животных каждой из  этих двух  групп, а при введении через 6, 7, 8  сут после КРТП выжило 90 % животных при 100% й гибели нелеченых мышей. Исследовано влияние пентоксифиллина (ПФ), известного ингибитора продукции провоспалительных цитокинов, на уровень IL6 в сыворотке крови и выживаемость животных. Показано, что однократное введение ПФ за 1 ч до КРТП и через 1–3 сут после КРТП не влияет на накопление  IL6 в сыворотке крови; умеренная ингибиция  IL6 выявлена при введении ПФ через 6–8  сут после КРТП. Независимо от условий введения ПФ, 30 суточная выживаемость выросла всего на 10 % по  сравнению  с КРТП без введения ПФ. (Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 4. С. 25–28.)

Ключевые слова: лучевое поражение, ожоги, интерлейкин , пентоксифиллин.

Согласно ретроспективным оценкам развития патологии у жертв атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, а также по результатам экспериментальных исследований на животных, комбинации острых лучевых и термических поражений (комбинированные радиационнотермические поражения—КРТП) характеризуются тяжелым прогнозом для жизни. Даже небольшие по площади глубокие ожоги существенно отягощают проявления острой лучевой болезни и повышают вероятность летальных исходов. Пострадавшие с КРТП прогрессивно теряют в весе, большинство из них погибает при нарастающих явлениях аутоинтоксикации и сепсиса. Клеточные основы отягощающего влияния термических ожогов изучены недостаточно. На основании результатов ранее выполненных исследований было высказано предположение о ключевой роли тканевых макрофагов в патогенезе КРТП  [1, 3]. События, приводящие в конечном счете к увеличению гибели животных с КРТП, по нашему мнению, могут выглядеть следующим об разом. Так, из литературы известно, что активация макрофагов в первые часы/сутки после ожога, сопровождающаяся продукцией провоспалительных цитокинов (TNF?, IL1, IL6 и др.), относится к важнейшим механизмам дисфункции иммунитета и повышения чувствительности к сепсису при термическом повреждении  [13, 14]. При КРТП реакции острой фазы осложняются в последующие сроки развитием т. н. асептической, а затем и бактериальной фазы энтероэндотоксемии, свойственной острому радиационному поражению организма  [15]. К 6–8 м суткам после облучения резко снижается количество анаэробных бактерий, обеспечивающих колонизационную резистентность. Как следствие, нарастает содержание микробов семейства Enterobacteriaceae, что сопровождается высевом кишечной палочки и протея из крови, селезенки и печени облученных животных, а также повышением уровня бактериальных эндотоксинов в системном кровотоке. Развитию кишечной инфекции при КРТП способтвует снижение IgA в слизистой оболочке кишки, что, в свою очередь, связано с угнетением экспрессии IL4 и снижением IgA синтезирующей активности В лимфоцитов  [6]. Макрофаги, пережившие своего рода «прайминг» в первые трое суток после комбинированной травмы, отвечают неадекватной (чрезмерной) реакцией на пострадиационную транслокацию эндогенной кишечной инфекции и эндотоксинов из кишечника в портальный кровоток и в печень. Так системная воспалительная реакция трансформируется в сепсис, как правило, с летальным исходом.

Настоящая работа посвящена экспериментальному подтверждению основных положений высказанной рабочей гипотезы. В частности, в работе предпринята попытка изучения роли реакции повышения содержания  IL6 в патогенезе отягощающего действия ожога на исходы лучевого поражения при КРТП. Материалы и методы Эксперименты были выполнены на мышах)самцах (СВА ? С57Bl)F1 массой тела 22–24 г. Животных подвергали общему однократному облучению в дозе 7 Гр на гамма)установке «ЛУЧ» с источником  60 Со (мощность дозы составляла 0,45 Гр/мин). При моделировании КРТП глубокий термический ожог 10 % общей площади поверхности тела наносили  с помощью мощной вспышки  света. Шесть  галогеновых ламп  устанавливали параллельно обжигаемой поверхности кожи на расстоянии 10 мм от нее. Длительность  световой вспышки  составляла 2 с,  термический ожог наносили сразу после облучения. Ранее было установлено, что из трех основных цитокинов воспалительного каскада (TNF?, IL)1, IL)6) в ранней реакции мышей на КРТП выявляются изменения только одного из них, а именно IL6 [2].

В настоящей работе изучены изменения концентрации IL6 в сыворотке крови в сроки через 3–6–24 ч (реакция острой фазы), через 3 сут  (период асептической эндотоксемии—токсемии без бактериемии) и через 8  сут  (период бактериальной  эндотоксемии—токсемии  с бактериемией) после КРТП. Здоровые мыши использовались в качестве контрольной  группы. Было изучено модифицирующее действие предварительного введения мышам фармакологического ингибитора продукции провоспалительных цитокинов — пентоксифиллина (ПФ) на уровень IL6 и на 30 суточную выживаемость мышей при КРТП. Производное метилксантина, неспецифический ингибитор фосфодиэстеразы 4 го  типа—ПФ относят к числу препаратов, воспалительный потенциал моноцитов/макрофагов. Преобладающим  эффектом ПФ является ингибирующая активность в отношении продукции провоспалительных цито кинов, в частности IL6 [5, 10]. ПФ вводили  трем  группам мышей  соответственно  каждому из  трех вышеуказанных периодов: однократно  за 1 ч до КРТП (ожидаемая ингибиция наработки  IL6 в период острофазной реакции), трехкратно через 1, 2 и 3 сут после КРТП (ожидаемая ингибиция периода асептической  эндотоксемии) и  трехкратно через 6, 7 и 8  сут после КРТП  (ожидаемая ингибиция периода бактериальной  эндотоксемии). ПФ растворяли в физиологическом растворе NaCL в  концентрации 5 мг/кг, вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл [авторы искренне благодарят  сотрудников московского пред) ставительства компании «Sun Pharmaceutical  Industries  Ltd» (India), предоставивших субстанцию пентоксифиллина для вы) полнения данной работы]. В опытах по изучению влияния ПФ на уровень IL)6 в сыво) ротке крови животных  умерщвляли через 3, 6, 24 ч, 3 и 8  сут после КРТП (забор материала через 3 и 8 сут проводили спустя 3 ч после третьей инъекции ПФ). На каждую точку наблюдения брали по 5 мышей. Кровь оставляли на 2 ч при комнатной температуре для  свертывания. Сыворотку отделяли центрифугированием,  замораживали и  хранили до проведения иммуноферментной  реакции.  Для  определения  концентрации  IL6 использовали реагенты «Opteia Mouse  IL6 ELISA Kit» производства фирмы «Pharmingen»  (San Diego, USA). Был проведен  эксперимент по оценке влияния моноклональных антител мАТ к  IL6 на выживаемость животных при КРТП  (реакция нейтрализации  in  vivo). Моноклональные  антитела к IL6 [Mouse IL6 MAb (Clone MP520F3), «R&D», USA] вводили в различные сроки до и после КРТП (аналогично схеме введения ПФ), внутрибрюшинно, из расчета 10 мкг/мышь, в 0,2 мл физиологического раствора. Полученный цифровой материал обработан  с помощью общепринятых методов вариационной  статистики. Различия между сравниваемыми группами оценивали с помощью критерия Стьюдента и метода «one)way ANOVA» (пакет про грамм MicroCal Origin, версия 3.0). Достоверность различий по 30)суточной выживаемости мышей в сравниваемых группах выявляли  с помощью критерия Фишера. Значения р < 0,05 рассматривались как  статистически  значимые.

Результаты и обсуждение

Содержание  IL6 в сыворотке крови животных с КРТП существенно повышалось через 6 ч и далее заметно увеличивалось, достигая максимальных значений к исходу первых суток наблюдения (таблица). Через 3 сут после КРТП уровень IL6, по существу, нормализовывался,  а  к  8 м  сут вновь поднимался втрое выше нормы. IL6 относят к интегральным медиаторам, выделяющимся во время реакции острой фазы на повреждение и инфекцию. Однако длительное ичрезмерное  повышение уровня циркулирующего IL6 у пациентов с ожогами коррелирует с осложнениями и смертельными исходами. Более того, отмечается корреляция степени выраженности ранней реакции  IL6  (в  первые часы/сутки после ожога) с

Таблица Изменения концентрации IL6 (пг/мл) в сыворотке крови мышей после КРТП и воздействия пентоксифиллина

 

тяжестью травмы, частотой последующих осложнений и вероятностью наступления неблагоприятных, в том числе летальных исходов [7]. Многолетний опыт изучения комбинирован ных поражений свидетельствует о том, что при моделировании КРТП  (облучение в дозе 7 Гр + ожог)  гибель наступает, в среднем, в 70–80 % случаев. Такой неблагоприятный исход выживаемости при КРТП коррелирует с выраженностью ранней реакции повышения сывороточного IL6 и с повторным подъемом уровня цитокина за время, соответствующее фазе бактериальной энтероэндотоксемии. Применение мАТ для нейтрализации эндогенного IL6  in vivo  (рис. 1) способствовало существенному повышению выживаемости животных с КРТП—до 30 х сут выжило по 60 % мышей при назначении антител за 1 ч до КРТП и через 1, 2 и 3 сут после КРТП. Введение мАТ через 6, 7 и 8 сут после КРТП обеспечило наибольшую выживаемость—90 %, тогда как среди не леченных мышей с КРТП к исходу второй недели гибель составила 100 % (р < 0,01). Введение ПФ за 1 ч до КРТП не ингибировало продукцию IL в период реакции острой фазы (таблица). Напротив, в  группе мышей, которым вводили ПФ, реакция развивалась быстрее—уже через 3 ч после КРТП уровень IL6 статистически достоверно превышал значение нормы, хотя абсолютные значения максимума реакции не различались у животных с КРТП без введения ПФ и с введением препарата (2022 ± 347 и 2450 ± 627 пг/мл). При назначении ПФ через 1–3 сут после КРТП уровень IL6 в сыворотке не отличался от контроля (КРТП без введения ПФ). Трехразовое введение ПФ с 6 х по 8 е сут  (период бактериальной энтероэндотоксемии)  привело  к  умеренному  снижению IL6 через 8 сут по сравнению с контролем (р < 0,05) . На рис. 2 приведены обобщенные данные нескольких повторов опыта по оценке влияния ПФ на выживаемость мышей. Как видно, использование ингибитора продукции  IL6  (ради последующего повышения резистентности к сепсису и улучшения исходов при КРТП) привело к увеличению 30 суточной выживаемости всего на 10 %— с 28 до 38 % (рис. 1, а и б) и с 25 до 35 % (рис. 1, в), что статистически не значимо (р > 0,3). По данным литературы, угнетающее действие ПФ на продукцию провоспалительных цитокинов, в частности IL6, проявляется эффективно при применении в качестве цитокининдуцирующего фактора бактериального липополисахарида  (ЛПС)  [11, 12]. При ожогах и, следовательно, при КРТП наряду с бактериальными ЛПС на роль пусковых молекул гипервоспаления могут претендовать и другие токсические субстраты. В частности, сразу после ожога из клеточной оболочки эритроцитов и клеток обожженной кожи высвобождаются токсические аминофосфолипиды. Попадая в системнуюциркуляцию, аминофосфолипиды могут запускать ключевые механизмы воспаления и сепсиса, включая активацию NF ?B и экспрессию цитокиновых генов [8]. Можно предположить, что в наших опытах  in vivo на модели радиационно термического поражения, аминофосфолипиды успевают «запустить» экспрессию генов и секрецию  IL6 до того,

 

Рис. 1. Выживаемость мышей  с КРТП  (1) при введении  антител против  IL6  за 1 ч до КРТП  (2), через 1–3  сут  (3) и на 6–8 е  сут после КРТП  (4)

 

Рис. 2. Выживаемость мышей при введении пентоксифиллина  (ПФ): а)  за 1 ч до КРТП;  б) через 1–3  сут после КРТП; в) через 6–8  сут после КРТП

как в системный кровоток начнут поступать бактериальные ЛПС и тем самым будут созданы условия для действия ПФ как гасителя IL6. Такими «конкурентами» для бактериальных ЛПС на протяжении первых дней— первой недели после ожога и КРТП могут стать макромолекулярные  глико и липопротеиды  (гистиогенные ожоговые токсины). Внутрисосудистый клиренс и обезвреживание ожоговых токсинов осуществляют тканевые макрофаги, которые при этом отвечают повышенной продукцией  гуморальных медиаторов воспаления [4]. По-видимому, ПФ не оказывает ингибирующего влияния на продукцию провоспалительных цитокинов под действием аминофосфолипидов, макромолекулярных ожоговых токсинов и других постожоговых токсических субстратов, конкурирующих с бактериальными ЛПС. Вследствие того что ПФ не модифицировал уровень  IL6, не изменялась и выживаемость мышей с КРТП под влиянием ПФ. Ранее об отсутствии терапевтического эффекта ПФ сообщалось по результатам исследований на модели термического ожога с дополнительным экзогенным инфицированием [9]. Т. о., приведенные данные позволяют сделать следующее заключение. Уровень провоспалительного цитокина  IL6 повышается в ответ на КРТП, что может стать одним из механизмов «прайминга» макрофагов и причиной последующей трансформации реакции острой фазы в системную воспалительную реакцию и сепсис. Результаты опытов с мАТ к  IL6 убедительно подтверждают предположение об отягощающем влиянии провоспалительного цитокина  IL6 на 30 суточную выживаемость при КРТП. В работе также показано, что применение пентоксифиллина—фармакологического средства ингибиции ЛПС индуцированного повышения уровня IL6— неэффективно при КРТП. Авторы выражают благодарность лаборантам-исследователям  Т.Н. Клячиной,  Т.А. Ереминой и С.В. Андреевой  за постоянную помощь в проведении  экспериментов и первичной обработке материала.

ЛИТЕРАТУРА

1. Будагов Р.С., Ульянова Л.П. Новые данные о закономерностях развития комбинированных радиационных поражений // Материалы Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности», Санкт Петербург, 2001, 11–12 окт. —  СПб., 2001. — С. 453–458.

2. Будагов Р.С., Ульянова Л.П. Сравнительный анализ уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке мышей после облучения и комбинированных радиационных поражений // Радиац. биол. радиоэкология. — 2000. — Т. 40, Вып. 2. — С. 188–191.

3. Будагов Р.С., Ульянова Л.П., Нестеренко В.С. и др. Системные проявления реакции острой фазы при комбинированных радиационнотермических поражениях // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 2. — С. 85–86.

4. Ожоговая аутоинтоксикация. Пути иммунологического преодоления  / Н.А. Федоров, Б.Е. Мовшев, Р.В. Недошивина, И.К. Корякина; АМН СССР. — М.: Медицина, 1985. — 256 с.

5. Alkharfy K.M., Kellum J.A., Matzke G.R. Unintended immunomodulation: part II. Effects of pharmacological agents on  cytokine activity  // Shock. — 2000. — Vol. 13, № 5. — P. 346–360.

6. Cheng T., Chen Z., Yan Y. et al. Experimental studies on the treatment and patho

logical basis of combined radiation and burn injury // Chin. Med. J. (Engl). — 2002. — Vol. 115, № 12. — P. 1763–1766. 7. Gebhard F., Pfetsch H., Steinbach G. et al. Is interleukin 6 an early marker of injury severity following major trauma in humans? // Arch. Surg. — 2000. — Vol. 135, № 3. — P. 291–295.

8. Hardaway R.M. A review of septic shock // Am. Surg. — 2000. — Vol. 66, № 1. — P. 22–29.

9. Holzheimer R.G., Molloy R.G., O’Riordain D.S. et al. Long)term  immunotherapeutic intervention with pentoxifylline in a mouse model of thermal injury and infection // J. Trauma. — 1995. — Vol. 38, № 5. — P. 757–762.

10. Koj A. Termination of acute)phase response: role of some cytokines and antiinflammatory drugs // Gen. Pharmac. — 1998. — Vol. 31, № 1. — P. 9–18.

11. LeMay  L.G., Vander A.J., Kluger M.J. The effects of pentoxifylline on  lipopolysaccharide fever, plasma interleukin 6, and tumor necrosis factor in the rat // Cytokine. — 1990. — Vol. 2, № 4. — P. 300–306.

12. Nelson J.L., Alexander J.W., Mao J.X. et al. Effect of pentoxifylline on survival and intestinal cytokine messenger RNA transcription in a rat model of ongoing peritoneal sepsis // Crit. Care Med. — 1999. — Vol. 27, № 1. — P. 113–119.

13.Pallua N., von Heimburg D. Pathogenic role of interleukin in the development of sepsis. Part I: Study in a standardized contact burn murine mod) el // Crit. Care Med. — 2003. — Vol. 31, № 5. — P. 1490–1494.

14. Schwacha M.G. Macrophages and post)burn immune dysfunction // Burns. — 2003. — Vol. 29, № 1. — P. 1–14.

15. Walker R.I. The contribution of intestinal endotoxin to mortality in hosts with compromised resistance: a review // Exp. Hematol. — 1978. — № 6. — P. 1172–181.

 Interleukin and outcome burdening after combined radiation/thermal injuries R.S. Budagov, L.P. Ulianova Medical Radiological Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Obninsk, Russia

The role of elevated serum levels of IL6 in radiation injuries outcome burdening by thermal burns under combined  radiation/thermal  injury was evaluated. Combined  injury was  inflicted  to  (CBA ?C57Bl/6)F1 mice with a whole body ? irradiation at a dose of 7 Gray plus 10 % body surface  fullthickness  thermal burn. Elevated level of IL6 in sera at 6–24 h and 8 days following combined injury was found. Anti IL6 monoclonal antibody administration 1 h prior and 1, 2 or 3 days after combined injury increased the 30 day animal survival up to 60 % in each group and up to 90 % if antibody were injected in 6, 7, 8 days after combined injuries; 100 % lethality was registered in untreated mice. The effect of pentoxifylline (POF) on  IL6  level and 30 day animal  survival has been evaluated.  It was established,  that  single POF injection 1 h prior and 1, 2 and 3 days after combined injury didn’t influence the IL6 production; a moderate  inhibition of  IL6 was only noted  if POF was administered  in 6, 7 and 8 days after  combined  injury. Survival  increased  insignificantly  (up  to 10 %)  in  spite of different  schedules of POF administration. (Cytokines and Inflammation. 2004. Vol. 3, № 4. P. 25–28.)

Key words: ?)irradiation, thermal injury, interleukin)6, pentoxifylline.



загрузка...