загрузка...
 
С.В. Сенников, А.Н. Силков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск Методы определения цитокинов
Повернутись до змісту

С.В. Сенников, А.Н. Силков ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск Методы определения цитокинов

Обзор посвящен основным методам исследования цитокинов, используемым в настоящее время. Кратко охарактеризованы возможности и назначение методов. Приведены достоинства и недостатки различных методик подходов к анализу экспрессии генов цитокинов на уровне нуклеиновых кислот и на уровне продукции белка. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 22–27.)

Ключевые слова: обзор, цитокины, методы определения.

Введение

Цитокины — это регуляторные белки, которые образуют универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток. Эффекты каждого цитокина на клетки характеризуются плейотропностью, спектр эффектов разных медиаторов перекрывается и, в основном, конечное функциональное состояние клетки зависит от влияния нескольких цитокинов, действующих синергично. Таким образом, система цитокинов представляет собой универсальную, полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов пролиферации, дифференцировки, апоптоза и функциональной активности клеточных элементов в кроветворной, иммунной и других гомеостатических системах организма. С момента описания первых цитокинов прошло немного времени. Однако их исследование привело к выделению обширного раздела знаний—цитокинологии, являющейся неотъемлемой частью различных областей знания и, в первую очередь, иммунологии, давшей мощнейший толчок к изучению этих медиаторов. Цитокинология пронизывает все клинические дисциплины, начиная от этиологии и патогенеза заболеваний и заканчивая профилактикой и лечением различных патологических состояний. Следовательно, научным исследователям и клиницистам необходимо ориентироваться в разнообразии регуляторных молекул и иметь ясное представление о роли каждого из цитокинов в изучаемых процессах. Методы определения цитокинов за 20 лет их интенсивного изучения прошли  очень быструю эволюцию и сегодня представляют целую область научного знания. Перед исследователями в цитокинологии в начале работы стоит вопрос о выборе метода. И здесь исследователь должен точно знать, какую информацию ему нужно получить для достижения поставленной цели. В настоящее время разработаны сотни различных методов оценки системы цитокинов, которые дают разноплановую информацию об этой системе. Оценивать цитокины в различных биологических средах можно по специфической биологической активности. Можно определять их количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, использующих поли и моноклональные антитела. Кроме изучения секреторных форм цитокинов можно изучать их внутриклеточное содержание и продукцию в тканях методами проточной цитофлюориметрии, вестернблотинга и иммуногистохимии in situ. Очень важную информацию можно получать, изучая экспрессию мРНК цитокинов, стабильность мРНК, наличие изоформ мРНК цитокинов, естественных антисмысловых нуклеотидных последовательностей. Изучение аллельных вариантов  генов цитокинов может дать важную информацию о  генетически запрограммированной высокой или низкой продукции того или иного медиатора. У каждого метода есть свои недостатки и свои достоинства, своя разрешающая способность и точность определения. Незнание и непонимание исследователем этих нюансов может привести его к ложным выводам. Определение биологической активности цитокинов История обнаружения и первых шагов в изучении цитокинов была тесно связана с культивированием иммунокомпетентных клеток и клеточных линий. Тогда были показаны регуляторные эффекты  (биологическая активность) ряда растворимых факторов белковой природы на пролиферативную активность лимфоцитов, на синтез иммуноглобулинов, на развитие иммунных реакций в моделях in vitro. Одна из первых методик определения биологической активности медиаторов—определение фактора миграции человеческих лимфоцитов и фактора ее ингибиции [1]. По мере изучения биологических эффектов цитокинов появлялись и различные методы оценки их биологической активности. Так, IL1 определяли по оценке пролиферации мышиных тимоцитов  in vitro, IL2 — по способности стимулировать пролиферативную активность лимфобластов, IL3 — по росту гемопоэтических колоний in vitro, IL4 — по комитогенному эффекту, по усилению экспрессии  Ia белков, по индукции образования IgG1 и IgE и т.д. [4]. Список этих методов можно продолжать, он постоянно пополняется по мере обнаружения новых биологических активностей растворимых факторов. Главный их недостаток—нестандартность методик, невозможность их унификации. Дальнейшее развитие приемов определения биологической активности цитокинов привело к созданию большого числа клеточных линий, чувствительных к тому или иному цитокину, или мультичувствительных линий. Сейчас большинство этих цитокинчувствительных клеток можно обнаружить в списках коммерчески распространяемых клеточных линий. Например, для тестирования IL1? и ? используют клеточную линию D10S [18], для IL2 и IL15— клеточную линию CTLL2  [9], для IL3, IL4, IL5, IL9, IL13, GMCSF—клеточную линию TF1 [13, 16], для IL6—клеточную линию B9  [5], для IL7—клеточную линию 2Е8  [11], для TNF? и TNF?—клеточную линиюL929 [8], для IFN?— клеточную линию WiDr [19], для IL18—клеточную линию KG1 [14]. Однако, подобный подход в изучении иммуноактивных белков, наряду с хорошо известными преимуществами, такими как измерение реальной биологической активности зрелых и активных белков, высокой воспроизводимостью при стандартизированных условиях, имеет и свои недостатки. К ним можно отнести, в первую очередь, чувствительность клеточных линий не к одному цитокину, а к нескольким родственным цитокинам, биологические эффекты которых перекрываются. Кроме того, нельзя исключить возможность индукции продукции других цитокинов клетками мишенями, которые могут искажать тестируемый параметр (как правило, это пролиферация, цитотоксичность, хемотаксис). Мы знаем еще не все цитокины и не все их эффекты, поэтому оцениваем не сам цитокин, а суммарную специфическую биологическую активность. Таким образом, оценка биологической активности как суммарной активности разных медиаторов  (недостаточная специфичность), является одним из недостатков этого метода. Кроме того, используя цитокин чувствительные линии, невозможно выявить неактивированные молекулы и связанные белки. Значит, подобные методики не отражают реальной продукции для ряда цитокинов. Еще один немаловажный недостаток использования клеточных линий — необходимость лаборатории для культуры клеток. Кроме того, все процедуры по наращиванию клеток, инкубированию их с исследуемыми белками и средами требуют больших временных затрат. Также нужно отметить, что клеточные линии при длительном их применении требуют обновления или повторной сертификации, так как в результате культивирования они могут мутировать и модифицироваться, что может приводить к изменению их чувствительности к медиаторам и снижению точности определения биологической активности. Тем не менее, этот метод идеален для тестирования специфической биологической активности рекомбинантных медиаторов. Количественное определение цитокинов с помощью антител Продуцируемые иммунокомпетентными и другими типами клеток цитокины выделяются в межклеточное пространство для осуществления паракринных и аутокринных сигнальных взаимодействий. По концентрации этих белков в сыворотке крови или в кондиционной среде можно судить о характере патологического процесса и обизбытке или недостатке определенных функций клеток у больного. Методы определения цитокинов с помощью специфических антител являются сегодня самыми распространенными системами детекции этих белков. Данные методы прошли через целую серию модификаций с использованием разных меток  (радиоизотопных, флюоресцентных, электрохемилюминесцентных, ферментных и т.д.). Если радиоизотопные методы имеют ряд недостатков, связанных с использованием радиоактивной метки и ограниченной по времени возможностью использования меченых реагентов (период полураспада), то иммуноферментные методы нашли самое широкое распространение. Они основаны на визуализации нерастворимых продуктов ферментативной реакции, поглощающих свет с известной длиной волны, в количествах, эквивалентных концентрации определяемого вещества. Для связывания измеряемых веществ используются антитела, нанесенные на твердую полимерную основу, а для визуализации—антитела, конъюгированные с ферментами, как правило, щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена [2, 3]. Достоинства метода очевидны: это высокая точность определения при стандартизованных условиях хранения реактивов и выполнения процедур, количественный анализ, воспроизводимость. К недостаткам можно отнести ограниченный диапазон определяемых концентраций, в результате чего все концентрации, превышающие определенный порог, считаются равными ему. Необходимо отметить, что затраты времени на выполнение метода варьируют в зависимости от рекомендаций производителя. Однако в любом случае речь идет о нескольких часах, необходимых для инкубаций и отмывок реагентов. Кроме того, определяются латентные и связанные формы цитокинов, которые по своей концентрации могут значительно превышать свободные формы, в основном, ответственные за биологическую активность медиатора. Поэтому данный метод желательно использовать вместе с методами оценки биологической активности медиатора. Другая модификация метода иммуноанализа, которая нашла широкое применение—электрохемилюминесцентный метод (ЭХЛ) определения белков антителами, меченными рутением и биотином. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с радиоизотопными и иммуноферментными: простота выполнения, небольшое  время выполнения методики, отсутствие процедур отмывок, малый объем пробы, большой диапазон определяемых концентраций цитокинов в сыворотке и в кондиционной среде, высокая чувствительность метода и его воспроизводимость  [17, 7, 21]. Рассматриваемый методприемлем для использования как в научных исследованиях, так и в клинических. Следующий метод оценки цитокинов в биологических средах разработан на основе технологии проточной флюориметрии. Он позволяет одновременно оценивать в образце до сотни белков. В настоящее время созданы коммерческие наборы для определения до 17 цитокинов [12]. Тем не менее, преимущества этого метода определяют и его недостатки. Воервых, это трудоемкость подбора оптимальных условий для определения нескольких белков, воторых, продукция цитокинов носит каскадный характер с пиками продукции в разное время. Поэтому определение большого количества белков одномоментно не всегда информативно. Общим требованием методов иммуноанализа, использующих т.н. «сэндвич», является тщательный подбор пары антител, позволяющий определять либо свободную, либо связанную форму анализируемого белка, что накладывает на этот метод ограничения, и что всегда нужно учитывать при интерпретации полученных данных. Этими методами определяется суммарная продукция цитокинов разными клетками, в то же время об антигенспецифической продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками судить можно только предположительно. В настоящее время разработана система ELISpot (Enzyme Liked  ImmunoSpot), которая в значительной степени устраняет эти недостатки. Метод позволяет полуколичественно оценивать продукцию цитокинов на уровне отдельных клеток  [6]. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антигенстимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа. Следующий, широко используемый в научных целях, метод—это внутриклеточное определение цитокинов методом проточной цитофлюориметрии [20]. Преимущества его очевидны. Мы можем фенотипически охарактеризовать популяцию клеток продуцентов цитокина и/или определить спектр продуцируемых цитокинов отдельными клетками, при этом имеется возможность относительной количественной характеристики этой продукции. Вместе с тем, описываемый метод достаточно сложен и требует дорогостоящего оборудования. Следующая серия методов, которая используется в основном в научных целях — это иммуногистохимические методы с использованием меченых моноклональных антител. Преимущества очевидны определение продукции цитокинов непосредственно в тканях (in situ), где происходят различные иммунологические реакции. Однако рассматриваемые методы очень трудоемки и не дают точных количественных данных. Определение экспрессии генов цитокинов на уровне мРНК Экспрессия генов цитокинов, как и других белков, осуществляется в несколько этапов: транскрипция, процессинг мРНК, трансляция, процессинг белка и секреция белка. Каждый этап экспрессии генов цитокинов может регулироваться, поэтому в ряде случаев важно знать не только уровень продукции медиатора, но и характеристики других этапов экспрессии гена. Например, на каком этапе происходит ингибирование экспрессии  гена медиатора, какова стабильность специфической мРНК, имеются ли изоформы мРНК, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга и т.д. Оценку содержания мРНК можно проводить разными способами. Распространенным подходом является гибридизация специфических зондов с пробами РНК, однако чувствительность методики может ограничиваться типом используемых зондов и меток и количеством анализируемой РНК. В качестве специфических зондов используют различные векторы, включающие всю последовательность гена (без интронов) или его часть, или олигонуклеотидные зонды к уникальным участкам мРНК, а также комплементарные РНК  зонды. При этом специфичность метода значительно возрастает, и уровень мРНК можно оценить количественно. Гибридизация in situ относится к наиболее прямым и чувствительным подходам к оценке наличия мРНК цитокинов в тканях и отдельных клетках. Важное место при этом занимает доказательство специфичности полученных сигналов. Кроме того, метод сложен в выполнении и обладает недостаточно высокой воспроизводимостью. Один из самых современных методов определения экспрессии генов на уровне мРНК—метод обратного реверсирования и полимеразной цепной реакции  (RTPCR). Он обладает рядом преимуществ: во первых, высокой чувствительностью, позволяющей  определить  единичные  молекулы мРНК в отдельных клетках за счет получения множества копий с кДНК; воторых, высокой специфичностью и возможностью анализа целого спектра мРНК за счет использования в реакции амплификации специфических комплементарных олигонуклеотидных праймеров к различным участкам кДНК известных цитокинов; в третьих, высокой воспроизводимостью и быстротой получения результатов, что особенно важно в условиях клинической лаборатории и при проведении научного исследования; в четвертых, после проведения реакции амплификации количество ДНК достаточно для проведения рестрикционного анализа, секвенирования, клонирования и т.д., что позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов цитокинов [22]. Нужно отметить, что только с появлением технологии RTPCR стало возможным более подробно изучать альтернативный сплайсинг  генов цитокинов. Дело в том, что разрешающая способность и чувствительность методов, основанных на использовании моноклональных антител, не позволяла изучать этот механизм формирования полиморфной структуры системы цитокинов. В настоящее время существуют десятки модификаций метода RTPCR для полуколичественной и количественной оценки специфической мРНК. Это конкурентная RTPCR, realtime технология и др. Сочетание технологий гибридизации и RTPCR позволило создать технологию Array анализа, когда в одном эксперименте можно оценить экспрессию сотен и тысяч  генов. Эти технологии используются в основном в научных исследованиях. Методы оценки аллельного полиморфизма генов цитокинов Гены цитокинов имеют аллельные варианты, характеризующиеся большей или меньшей активностью белка либо различным уровнем его экспрессии. Исследования связи аллельного варианта с уровнем экспрессии гена либо с участием аллеля в развитии патологического процесса раскрывают фундаментальные основы функционирования генетической системы цитокиновой сети. Методы исследования генетического полиморфизма также достаточно разнообразны. Они делятся на методы анализа известных вариантов и методы поиска новых вариантов. Наиболее распространены подходы, основанные на технологии PCR, и методы Array анализа. Достаточно разнообразны PCR методы: это сайт специфическая амплификация, SSCP анализ, рестрикционный анализ, высокоэффективный капиллярный электрофорез, секвенирование и т.д. Каждый из них имеет свои особенности применения и разрешающую способность, но все весьма трудоемки и занимают много времени при исследовании больших популяционных выборок. В этой связи все шире применяются автоматизированные лаборатории  генетического анализа, и несомненным лидером, имеющим большую перспективу, является метод Array анализа, сочетающий высокую чувствительность, широкий диапазон применения и практически полную автоматизацию [15].

Заключение

Таким образом, система цитокинов может изучаться с помощью разных методов, и выбор метода зависит от поставленной задачи. Для определения содержания цитокина в биологической пробе используются методы оценки биологической активности цитокина, в основном на клеточных линиях, или методы иммуноанализа с применениемспецифических антител. При оценке внутриклеточного содержания цитокина в определенных популяциях клеток используются методы проточной цитофлюориметрии, а для оценки продукции цитокинов in situ—иммуногистохимические методы. Для оценки экспрессии  генов цитокинов на уровне мРНК используют  гибридизацию мРНКсо специфическими  нуклеотидными зондами или технологию RTPCR. Метод PCR в сочетании с рестрикционным или гибридизационным анализом используют для оценки аллельного полиморфизма генов цитокинов. Все эти методы обладают и достоинствами и недостатками. Только сочетание различных методик

Таблица Преимущества и недостатки методов исследования системы цитокинов

 

подходов позволяет получать более достоверную информацию о системе цитокинов  (см. таблицу). Тем не менее, каждый раз при появлении новых технологий исследования появляется необходимость пересматривать научные взгляды. Например, с появлением данных о способности клеток продуцировать растворимые формы рецепторов и их высокой концентрации в сыворотке крови, которая на порядок и более может превышать концентрацию самого цитокина, перед исследователями встал вопрос: какую форму цитокина, свободную или связанную, мы определяем с помощью моноклональных антител Оказалось, что свободная форма практически для всех цитокинов в сыворотке крови варьирует в пределах 0–50 пг/мл, а связанная может достигать больших концентраций. Понятно, что при иммунопатологическом процессе в сыворотку крови из тканей будут выходить свободные цитокины и связываться с растворимой формой рецептора. Таким образом, на наличие патологического процесса будет указывать, в основном, связанная форма цитокина. Другой пример: альтернативный сплайсинг  генов цитокинов распространен и среди медиаторов, и среди рецепторов. Его широкое изучение стало возможным с внедрением в научную практику технологии RTPCR. Нужно отметить, что наши знания о специфическом вкладе и количестве медиаторов и рецепторов, вовлеченных в регуляцию различных физиологических и патологических процессов в организме, постоянно увеличивается. Уникальные технологии геномного и протеомного анализа, разработанные в последнее время, делают возможной одновременную оценку сотен и тысяч регуляторных молекул. Поэтому следующие методы в цитокинологии, которые требуются и без которых невозможно перейти на более высокий уровень понимания того, как функционирует система цитокинов,—компьютерный анализ и математическое моделирование сетевых взаимодействий и функционирования системы цитокиновой регуляции. Именно они обеспечат новый уровень знания в цитокинологии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бендиксен Дж., Бендцен К., Клаузен Ж.Е. и др. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика / Ред. Дж. Б. Натвиг, П. Перлманн, Х. Вигзел. — М.: Медицина, 1980. — С. 2643277.

2. Иммуноферментный анализ  / Под ред.  Т.Т. Нго,  Г. Ленхофа. — М.: Мир, 1988. — 446  с. 3. Торнтон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа / Ред. У.П. Коллинз. — Пер с англ. — М.: Мир, 1991. — 280 с.

4. Хамблин А., O Гарра А. Лимфоциты. Методы  / Ред. Дж. Клаус. — М.: Мир, 1990. — С. 3103338.

5. Braciak T.A., Mittal S.K., Graham F.L. et al. Construction of  recombinant human  type 5 adenoviruses expressing  rodent  IL6 genes. An approach  to  investigate  in vivo cytokine  function // J. Immunol. — 1993. — Vol. 151. — P. 5145–5153.

6. Czerkinsky C.C., Tarkowski A., Nilsson L.A. et al. Reverse enzyme linked immunospot assay (RELISPOT) for the detection of cells secreting immunoreactive substances // J. Immunol. Meth. — 1984. — Vol. 72. — P. 489–496.

7. Deaver D.R. A new nonisotopic detection system for immunoassays // Nature. — 1995. — Vol. 377. — P. 758–760.

8. Flick D.A., Gifford G.E. Comparison of  in vitro cell cytotoxic assays  for tumor necrosis factor // J. Immunol. Meth. — 1984. — Vol. 68. — P. 167–175.

9. Giglia J.S., Ovak G.M., Yoshida M.A. et al. Isolation of mouse T3cell lympho3 ma lines from different longterm interleukin 2 dependent cultures // Cancer Res. — 1985. — Vol. 45. — P. 5027–5034.

10. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D. et al. An overview of real3time quantita3 tive PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. — 2001. — Vol. 25. — P. 386–401.

11. Ishihara K., Medina K., Hayashi S. et al. Stromal3cell and cytokinedependent lymphocyte clones which span the preB3 to Bcell transition // Dev. Immunol. — 1991. — Vol. 1. — P. 149–161.

12. Kellar K.L., Douglass J.P. Multiplexed microsphere3based flow cytometric immunoassays  for human cytokines // J.  Immunol. Meth. — 2003. — Vol. 279. — P. 277–285.

13. Kitamura T., Tange T., Terasawa T. et al. Establishment and characterization of a unique human  cell  line  that proliferates dependently on GM3CSF,  IL3, or erythropoietin // J. Cell. Physiol. — 1989. — Vol. 140. — P. 323–334.

14. Konishi K., Tanabe F., Taniguchi M. et al. A simple and sensitive bioassay  for the detection of human interleukin318/interferongammainducing factor us ing human myelomonocytic KG31  cells  //  J.  Immunol. Meth. — 1997. — Vol. 209. — P. 187–191.

15. Landegren U., Nilsson M., Kwok P.Y. Reading bits of genetic information: meth ods for singlenucleotide polymorphism analysis // Genome Res. — 1998. — Vol. 8. — P. 769–776.

16. McKenzie A.N., Culpepper J.A., de Waal Malefyt R. et al. Interleukin 13, a T3cellderived cytokine that regulates human monocyte and B3cell function // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. — 1993. — Vol. 90. — P. 3735–3739.

17. Obenauer Kutner L.J., Jacobs S.J., Kolz K. et al. A highly sensitive electrochem iluminescence  immunoassay  for  interferon alfa32b  in human serum // J. Immunol. Meth. — 1997. — Vol. 206. — P. 25–33.

18. Orencole S.F., Dinarello C.A. Characterization of a subclone (D10S) of the D10.G4.1 helper Tcell line which proliferates to attomolar concentrations of interleukin 1 in the absence of mitogens // Cytokine. — 1989. — Vol. 1. — P. 14–22.

19. Pfizenmaier K., Bartsch H., Scheurich P. et al. Differential gamma3interferon response of human colon carcinoma cells:  inhibition of proliferation and modulation of immunogenicity as independent effects of gammainterferon on tumor cell growth // Cancer Res. — 1985. — Vol. 45. — P. 3503–3509.

20. Sander B., Hoiden I., Andersson U. et al. Similar frequencies and kinetics of cytokine producing  cells  in murine peripheral blood and  spleen. Cytokine detection by immunoassay and intracellular immunostaining // J. Immunol. Meth. — 1993. — Vol. 166. — P. 201–214.

21. Sennikov S.V., Krysov S.V., Injelevskaya T.V. et al. Quantitative analysis of hu3 man immunoregulatory cytokines by electrochemiluminescence method // J. Immunol. Meth. — 2003. — Vol. 275. — P. 81–88.

22. Stirling D. Qualitative and quantitative PCR: a technical overview //Methods Mol. Biol. — 2003. — Vol. 226. — P. 181–184.

Methods for cytokine detection S.V. Sennikov, A.N. Silkov Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk The review is devoted to the basic methods used for cytokine research. The purposes and capability of methods are briefly  characterized.  The advantages and disadvantages of  the various methodical ap% proaches  for  the analysis of  cytokine genes expression at a  level of nucleic acids and at a  level of protein are given. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 1. P. 22–27.)

Key words: review, cytokines, methods of detection.



загрузка...