загрузка...
 
Е.Ю. Златник, Л.Ю. Голотина Научно исследовательский онкологический институт,  г. Ростов на Дону Изучение возможности применения Ронколейкина для LАК терапии рака яичника
Повернутись до змісту

Е.Ю. Златник, Л.Ю. Голотина Научно исследовательский онкологический институт,  г. Ростов на Дону Изучение возможности применения Ронколейкина для LАК терапии рака яичника

Исследовали возможность применения в LAKтерапии больных раком яичника Ронколейкина — препарата рекомбинантного  IL2. В качестве источника лимфоцитов использовали лимфу  грудного протока больных, получавших  также аутолимфохимиотерапию. Изучение иммунобиологических  свойств лимфоцитов лимфы после кратковременной инкубации  (30 мин) и более длительного культивирования  (24 и 48 ч)  с Ронколейкином показало, что под действием  этого препарата происходит усиление пролиферации Т лимфоцитов, аутокринной стимуляции продукции  IL2, повышение  эффекторных  свойств NКклеток, а  также установлено прямое цитотоксическое действие Ронколейкина на культуру клеток линии К562 и сенсибилизирующий эффект  способность повышать ее чувствительность к лизису NКклетками. LAKтерапия  с Ронколейкином была применена в комплексном лечении больных раком яичника. Достигнутый эффект дает основание считать метод перспективным для лечения этого заболевания. (Цитокины и воспаление. 2005.  Т. 4, № 2. С. 54–58.)

Ключевые  слова: Ронколейкин, рак яичников, лимфа,  LAK терапия.

Цитокинотерапия онкологических заболеваний является одним из наиболее современных и перспективных направлений в онкоиммунологии. Несмотря на то, что идея адаптивной иммунотерапии  (LAKтерапии) с применением  IL2 была высказана еще в 80х  годах ХХ века  [16], ее потенциал далеко не исчерпан, и в настоящее время определяется, прежде всего, возможностью использования рекомбинантных цитокинов, их различных сочетаний, а также расширением спектра тех заболеваний, при которых такое лечение представляется целесообразным. Ронколейкин как препарат рекомбинантного IL2 нашел применение в лечении различных заболеваний, в том числе онкологических [2, 4, 5, 7]. Он используется как для внутривенного капельного введения, так и для культивирования с ним лимфоцитов, в ходе которого происходит генерация естественных цитотоксических клеток и LАК клеток  [1,16]; описаны также варианты, сочетающие оба подхода  [2]. При этом стимулируются не только NKклетки, но, видимо, и макрофаги, поскольку  IL2 при действии  in vitro усиливает продукцию монокинов TNF? и  IL8, которые, в свою очередь, потенциируют эффекты  IL2  [9]. Введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с IL2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цитокина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными  [2, 11]. Следует отметить, что первоначально применение IL2, в том числе в виде LАК терапии, считалось эффективным не при всех опухолях, а преимущественно при меланоме, почечноклеточном раке, некоторых лимфопролиферативных заболеваниях  [7, 18], особенно при использовании в рамках монотерапии. Однако в последние  годы появились сообщения об успешном применении данного препарата при раке легкого [4], эндометриозе [6] в качестве одного из компонентов комплексного лечения этих заболеваний. Было проведено исследование влияния совместной инкубации Ронколейкина с клетками лимфы  грудного протока больных раком яичника наиммунобиологическое состояние лимфоцитов, а также предпринято использование LAКтерапии в комплексном лечении этих больных. Материалы и методы Учитывая данные литературы о дозовой и временной зависимости эффекта, известной для многих цитокинов  [11], при постановке опытов были применены различные концентрации препарата и  сроки инкубации. Лимфу  грудного протока больных местнораспространенным и генерализованным раком яичника (350–400 мл) инкубировали в присутствии 2 ? 106 МЕ Ронколейкина. При  этом в  зависимости от цитоза приходилось 0,4–2,0 МЕ препарата на каждый лимфоцит. Проводили инкубацию лимфы с Ронколейкином в течение 30 мин при 37 °С, а также культивирование в полной культуральной  среде,  содержащей среду RPMI1640 с 10 % инактивированной эмбриональной  телячьей  сыворотки  (Flow  Lab.), 5 ? 10–5 М 2меркапто этанола (Serva), 2 мМ L глютамина, 10 мМ буфера HEPES (Flow Lab.), 50 мкг/мл гентамицина, в присутствии 5 % СО2 в течение 24 и 48 ч. До и после культивирования изучали иммунофенотип лимфоцитов в непрямом иммунофлюоресцентном тесте  с моноклональными антителами  (Сорбент) и функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с ФГА, КонА и ЛПС [10]. С целью изучения действия препарата на естественную цитотоксичность были проведены опыты по раздельной оценке его влияния на гибель клеток мишеней К562 (клетки эритромиелолейкоза человека) и на функцию клеток эффекторов  (NКклеток). Для  этого Ронколейкин в концентрации 5, 50 и 5000 МЕ/мл инкубировали в течение 30 мин при 37 °С: – с клеткамимишенями без клеток эффекторов  (контроль); – с клетками мишенями, к которым  затем добавляли интактные клетки эффекторы  (опыт № 1); – с клетками эффекторами, к которым  затем добавляли интактные клетки мишени  (опыт № 2). Во всех  случаях клетки  трехкратно отмывали и  ставили цитотоксический  тест  (ЦТТ), включающий культивирование проб в течение 24 ч при 37 °С с последующим определением процента  гибели клеток мишеней и расчетом индекса цитотоксичности  (ИЦ) по формуле: ИЦ = (О – К)/К, где О  (опыт) — % погибших клеток мишеней в присутствии клеток эффекторов, К  (контроль) — % погибших  клеток мишеней в присутствии среды. Определение продукции  IL2 проводили в опытах с культурами клеток продуцентов  этого цитокина  (Тлимфобластной линии Jurkat). Оценивали их пролиферацию при культивировании с добавлением Ронколейкина (опыт), среды RРMI1640 (контроль) и альбумина (контроль). Кроме того, супернатанты опытных и контрольных 48часовых культур  Jurkat добавляли к культивируемым  спленоцитам мышей линии СВА и изучали их пролиферацию по результатам  спонтанной 72часовой РБТЛ. Статистическую обработку результатов проводили  с использованием метода непрямых разностей и критерия Уилкоксона — Манна — Уитни. Результаты и обсуждение Результаты представлены в табл. 1 и 2. Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что кратковременная инкубация (30 мин) с Ронколейкином вызывает выраженное повышение экспрессии маркера СD8+ (р < 0,05). Экспрессия других субпопуляционных и активационных маркеров не имела статистически достоверных отличий ни через 30 мин, ни через 24 ч после инкубации.

Анализ результатов

РБТЛ показал, что 30минутная инкубация не отражается на функциональной активности лимфоцитов, тогда как 24 и 48часовое культивирование приводит к статистически значимому усилению как спонтанной, так и митогениндуцированной РБТЛ  (см. табл. 1). Стимуляция достигает максимума на 1 е сутки в случае спонтанной и ЛПС индуцированной (В клеточной) пролиферации и на 2е—в случае индуцированной ФГА и КонА (Т клеточной). Наиболее интересными представляются результаты оценки изменения функциональной активности NКклеток под действием Ронколейкина (см. табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность Ронколейкина по отношению к культуре клеток мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту  гибели клеток мишеней 32,1 ± 5,8 % и по ИЦ 2,26 ± 0,44, то постановка ЦТТ с лимфоцитами, обработанными Ронколейкином в различных концентрациях (5, 50 и 5000 МЕ/мл), привела  к  повышению этих показателей,  статистически достоверному при 5 и 5000 МЕ/мл (50,0 ± 4,5 и 51,5 ± 4,8 %, соответственно); аналогичная динамика наблюдается по ИЦ  (см. табл. 2). В этой таблице также представлены  результаты оценки сенсибилизирующего действия Ронколейкина на  тест культуру (см. табл. 2). Увеличение процента  гибели клеток мишеней, обработанных  Ронколейкином, в присутствии интактных лимфоцитов  (с 27,8 ± 3,09 до 33,8–41,5 %)  говорит  о  возможности такого действия, хотя различия статистически недостоверны из-за широкого разброса индивидуальных данных. По ИЦ выявлено статистически значимое возрастание  цитотоксичности  (с 2,0 ± 0,29 до 3,23 ± 0,5) при обработке клетокми шеней минимальной из использованныхконцентраций Ронколейкина (5 МЕ/мл), различия статистически достоверны (р < 0,05). Учитывая, что Ронколейкин является препаратом  IL2, представлялo интерес определение его влияния на продукцию этого цитокина, поскольку известна способность многих интерлейкинов к аутокринной регуляции. Для этого проводили культивирование клеток продуцентов  IL2  (Тлимфобластной линии Jurkat) с Ронколейкином в течение 24 и 48 ч. Изучение пролиферативной активности клеток Jurkat показало, что она возрастает под влиянием Ронколейкина через 48 ч культивирования и демонстрирует тенденцию к угнетению при культивировании в присутствии альбумина (рис. 1). При этом супернатанты той же культуры, стимулированной Ронколейкином, обладают способностью повышать пролиферацию культивируемых спленоцитов мыши, что статистически достоверно

Таблица  1 Влияние Ронколейкина на иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника

 

Примечание.  статистически достоверные отличия от исходных данных  (p < 0,05);  статистически достоверные различия между  сроками исследования.

Таблица  2 Влияние различных концентраций Ронколейкина на функциональную активность NКклеток (n = 7) Примечание. статистически достоверные отличия от фона  (p < 0,05); статистически достоверные отличия от  контроля  (p < 0,05).

 

Рис. 1. Влияние  культивирования  с Ронколейкином и  альбумином на продукцию  IL21 — действие на пролиферацию культуры Jurkat (% от исходного фона); 2 — действие супернатантов культуры Jurkat после инкубации с Ронколейкином и альбумином на пролиферацию спленоцитов мышей (индексы стимуляции, % от исходного фона).

превышает стимулирующую активность супернатантов клеток Jurkat, культивированных  без Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейкином вызывает усиление продукции IL2 клетками продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых  активированными  клетками Jurkat, среди которых преобладает IL2. На рис. 2 представлена возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейкина после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных. Полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования LАК терапии c использованием аутологичной лимфы в клинике для лечения 8 больных раком яичника. Мы использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу, поскольку она содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл), а дренирование грудного лимфатического протока позволяет получить ее в значительном объеме и дает возможность сочетать LАК терапию с аутолимфохимиотерапией (АЛХТ), т. е. с введением цитостатиков после инкубации с аутологичной лимфой  [8]. Результаты клинического применения АЛХТ+LАК свидетельствуют о том, что у больных на 25–30 % повышалась исходно низкая функциональная активность Т и В лимфоцитов. Кроме того, отмечалось снижение числа клеток, экспрессирующих маркеры СD8 и СD16, что на фоне  отмеченной  регрессии  опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических клеток из периферической крови в очаг. Использование сочетания аутолимфохимиотерапии и LАКтерапии с использованием лимфы в предоперационном периоде у больных распространенным раком яичника позволило улучшить их  состояние, уменьшить степень распространенности опухолевого процесса и количество метастазов, перевести больных из неоперабельного в операбельное состояние. Несмотря на то, что полученные данные еще малочисленны, они демонстрируют перспективу такого варианта использования Ронколейкина в лечении больных раком яичника. Итак, приведенные результаты свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка лимфы больных раком яичника с помощью Ронколейкина приводит к повышению экспрессии СD8, увеличению спонтанной и митогениндуцированной РБТЛ, стимуляции функциональной активности NКклеток, а также увеличению чувствительности клеток мишеней к действию эффекторов естественной цитотоксичности и продукцииIL2. Нами не было получено дозозависимого эффекта, т. е. Ронколейкин после обработки им лимфоцитов в концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал одинаковую гибель клеток мишеней, что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата в достаточно широких пределах, включая область низких доз, об эффективности которых для  генерации LАК при лечении, например, рака легкого имеются  сообщения в литературе  [3]. Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что успешная LАКтерапия при раке яичника возможна, т. к. лимфоциты больных активируются в присутствии  IL2, повышая продукцию таких цитокинов, как IL2 и  IFN?  [15], обладающих противоопухолевым эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК клетки, способные лизировать даже линии опухолей яичника, эксп

 

Рис. 2. Возможная  схема реализации противоопухолевого действия Ронколейкина после культивирования  с ним  аутологичных лимфоцитов больных

рессирующие факторы лекарственной устойчивости, такие как pgР и mdr  [17]. Важным аспектом предлагаемого метода лечения является сочетание АЛХТ с LАК терапией с применением аутолимфы. Одной из сторон потенциирования их эффекта может быть стимуляция апоптоза опухолевых клеток. Известно, что многие цитостатики, помимо прямого действия на неопластические клетки, способны повышать экспрессию на них FasR [14], а важным механизмом, через которые LАКклетки проявляют свою цитотоксичность, является индукция Fas зависимого апоптоза клеток мишеней [13]. Кроме того, в эксперименте показано, что LАК клетки более интенсивно поступают в опухолевую ткань после введения цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение цитостатиков и LАК клеток способно улучшать противоопухолевый эффект, что показано на примере рака почки, легкого [4], а в рамках нашего исследования— на примере рака яичника.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бережная Н.М., Ковальчук Е.В. ЛАК феномен (фенотип клеток, механизм действия и условия его реализации) // Иммунология. — 1995. — № 2. — С. 12–16.

2. Гершанович М.Л. Применение интерлейкина2 (пролейкина, алдеслейкина) в онкологической практике // Вопр. онкологии. — 2003. — Т. 49, № 6. — С. 776–782.

3. Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В. Влияние адоптивной иммунотерапии на эффективность хирургического лечения больных раком легкого // Эксперим. онкол. — 2000. — Приложение. — С. 66.

4. Кадагидзе  З.Г. Цитокины и их использование в онкологии  //  Int.  J. Immunorehab. — 1997. — № 6. — P. 47–56.

5. Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Ронколейкин в онкологической практике. — СПб., 2003. — С. 6–18.

6. Крамарева Н.Л., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли цитокинов в патогенезе эндометриоза и выборе иммунокорригирующей терапии // Мед. иммунол. — 2002. — Т. 4, № 2. — С. 278–279.

7. Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. — М., 1999. — 135 с.

8. Сидоренко Ю.С. Лимфохимиотерапия. — Ростов на Дону: Изд. РГМУ, 2003. — 320 с.

9. Тотолян А.А. Иммунологические эффекты Ронколейкина in vitro и in vivo // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 45.

10. Фримель Х. Иммунологические методы. — М., 1987. — 456 с.

11. Ярилин А.А. Принципы и пути использования цитокинов в противоопухолевой терапии // Аллергия, астма, клин. иммунол. — 1999. — № 10. — С. 3–16.

12. Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced accumulation of transferred LAK cells into tumor sites after chemotherahy // Hokkaido Igaku Zasshi. — 1995. — Vol. 70, № 3. — P. 507–517.

13. Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al. Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis  factor are  the major cytotoxic molecules used by  lymphokineactivated killer cells // J. Immunol. — 1996. — Vol. 157, № 5. — P. 1919–1925.

14. Micheau O., Solary E., Hammann A. et al. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs  to Fasmediated сytotoxicity // J. Natl Cancer Inst. — 1997. — Vol. 89, № 11. — P. 783–789.

15. Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al. Differential expression of cytokine transcripts  in human epithelial ovarian  carcinoma by  solid  tumour  specimens, peritoneal exudate cells containing tumour, tumourinfiltrating  lymphocyte (TIL)derived T cell lines and established tumour cell lines // Clin. Exp. Immunol. — 1998. — Vol. 112, № 2. — P. 172–180.

16. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on  the  systemic administration of autologous lymphokinectivated killer cells and recombinant IL2 to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. — 1985. — Vol. 313, № 23. — Р. 1485–1492.

17. Savas B., Cole  S.P.,  Tsuruo T., Pross H.F. Pglycoproteinmediated multidrug resistance and  lymphokineactivated killer cell  susceptibility  in ovarian carcinoma // J. Clin. Immunol. — 1996. — Vol. 16, № 6. — P. 348–357.

18. Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Аdoptive  immunotherapy of patients with metastatic renal cell cancer using lymphokineactivated killer cells, interleukin 2 and cyclophosphamide:  longterm results // Int. J. Urol. — 1998. — Vol. 5, № 1. — P. 16–21.

Possible application of Roncoleukin for LAKtherapy in ovarian cancer E.Y. Zlatnik, L.Y. Golotina Cancer Research Institute, Rostovon Don, Russia Roncoleukin, a recombinant IL2, was studied for the possibility of application by method of LAKther apy. The lymph of ductus thoracicus of ovarian cancer patients receiving also autolymphochemotherapy was used as a source of lymphocytes. The immunobiologic activity of lymphocytes was studied after a 30min incubation with Roncoleukin and also after cultivation during 24 and 48 hours. The increase of  T  cell proliferation, autocrine  stimulation of  IL2 production, and  increase of NK  cell  cytotoxicity were observed. A sensitizing effect of Roncoleukin on K562 target cells was shown as well: Roncoleukin increased the K562 cell sensitivity to NKlysis. LAKtherapy with Roncoleukintreated lymph cells was applied to ovarian cancer patients as a part of their complex treatment. The achieved effect allows considering the method to be perspective for therapy of ovarian cancer. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 54–58.)

Key words: Roncoleukin, ovarian cancer, lymph, LAKtherapy.



загрузка...