Изучение экспрессии прогениторными нейроклетками маркерных протеинов in vitro Л.Д. Любич, Н.И. Лисяный Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев
Изучение экспрессии прогениторными нейроклетками маркерных протеинов in vitro Л.Д. Любич, Н.И. Лисяный Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев
Уникальные свойства стволовых клеток являются основой для разработки методов лечения широкого круга заболеваний человека. Современные методы клеточной и генной терапии патологии нервной системы предусматривают применение нейральных стволовых клеток (НСК) благодаря их способности к дифференцировке во все клеточные типы в ЦНС. В связи с перспективой использования культур НСК для трансплантации при нейродегенеративных заболеваниях возникает необходимость изучения закономерностей их развития и подбора адекватных условий культивирования. Цель нашего исследования заключалась в изучении экспрессии белков маркеров нейральной дифференцировки при культивировании эмбриональных нейроклеток in vitro. Использовали эмбриональные нейроклетки человека из нативного абортивного материала (5–12 недель гестации). Клетки культивировали в бессывороточной среде ДМЕМ/F12 («Sigma», Германия) с добавлением препарата инсулинтрансферринселенит (ІТС) (PanEco Ltd., Россия) и ретинола ацетата (0,2 мг/мл) (Киевский витаминный завод). Каждых 3 дня половину культуральной среды обновляли, а часть клеток из суспензии переносили пипетированием в чашки Петри со стеклами, покрытыми полиэтиленимином. Культуры содержали в CО2 инкубаторе при постоянной tо, влажности и газовом составе. Живые культуры наблюдали под инвертированным микроскопом. По завершению срока культивирования культуры клеток фиксировали формальдегидом. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов на виментин и глиальный фибриллярный кислый протеин проводили с помощью наборов «Sigma». Цитологические препараты исследовали в цитоанализаторе изображения «IBAS!2000» (Германия) с последующей фоторегистрацией. Данные наших исследований в длительной культуре in vitro за динамикой количества эмбриональных нейроклеток предшественников свидетельствуют о том, что к 9м суткам культивирования в бессывороточной среде DMEM/F12 дифференцированные клетки погибают, а остаются, очевидно, стволовые нейральные клетки, преимущественно жизнеспособные переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки (рис. 1). Морфологическое изучение культур эмбриональных нейроклеток показало, что в течение всего периода наблюде
Рис. 1. Динамика суспензионной культуры нативных эмбриональных нейроклеток человека при культивировании в среде DMEM/F12
Рис. 2. Динамика экспрессии виментина и GFAP при культивировании эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12
ния (до 22 сут) такие клетки сохраняли шаровидную форму без видимых признаков дифференцировки. В культурах нейроклеток, культивированных в среде с добавлением ретинола ацетата, а потом перенесенных на подложку, на 15е сутки культивирования наблюдалось формирование многоклеточных шаровидных агрегатов, описанных в литературе как нейросферы. С целью иммуногистохимического изучения экспрессии маркеров прогениторных нейральных клеток и клеток, прошедших определенный этап дифференцировки, на разных стадиях культивирования в суспензии в среде DMEM/F12 клетки отбирали и переносили в чашки Петри. На 2–4е сутки культуры фиксировали 4%ным нейтральным формалином и проводили иммуногистохимическое окрашивание на виментин — маркер стволовых/прогениторных клеток — и глиальный кислый фибриллярный протеин (GFAP) — маркер глиобластов и астроцитов [K. Barami et al., 2000; D.L. Stemple, N.K. Mahanthappa, 1997]. Установлено, что в процессе культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 с увеличением срока культивирования растет доля клеток, экспрессирующих виментин (рис.2). При этом экспрессия виментина достигает максимума к 9!м сутам культивирования. Экспрессия GFAP в процессе культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 практически не изменялась с увеличением срока культивирования (рис.2). Наши данные согласуются с данными других исследователей (О.В. Подгорный и др., 2004; Almazryn G. еt al., 2001), установивших при изучении культур клеток мозга эмбрионов человека 9–10 недель гестации, что при окраске кле! ток антителами на виментин выявляется наибольшее количество положительных клеток, при этом виментин коэкспрессирован в большинстве нестинположительных клеток. Как известно, нестин маркирует нейральные стволовые клетки, а виментин—клетки предшественники. Кроме того, часть GFAP положительных клеток также экспрессирует и виментин, эти клетки имеют астроцитоподобную морфологию с крупными ядрами. Двойная экспрессия эмбриональными нейроклетками GFAP и виментина может объяснять! ся тем, что для НСК характерна определенная астроцитарная мимикрия (A. Alvarez!Buylla et al., 2001; В.І. Цимбалюк, В.В. Медведев, 2003). Таким образом, наши данные, как и данные других авторов, свидетельствуют о том, что культуры эмбриональных нейроклеток состоят из клеток, находящихся на разных стадиях развития: стволовые клетки, прогениторы, нейробласты и глиобласты. Мы считаем, что возрастание количества виментин положительных клеток с увеличением срока культивирования эмбриональных нейроклеток в бессывороточной среде DMEM подтверждает предположение о том, что в процессе длительного культивирования в указанных условиях дифференцированные клетки гибнут, а остаются преимущественно жизнеспособные, переживающие малодифференцированные или недифференцированные клетки, стволовые или прогениторные нейральные клетки. Таким образом, нами установлено, что на 9е сутки культивирования эмбриональных нейроклеток в среде DMEM/F12 можно получить суспензию, обогащенную (на 80–85 %) про! гениторными нейроклетками (виментин положительными).
