загрузка...
 
Л.Ю. Хамнуева, И.В. Малов, Л.Ю. Андреева, О.В. Шагун, В.П. Зудаев Иркутский  государственный медицинский  университет,  г. Иркутск Роль цитокинов в аутоиммунной деструкции ? клеток у больных сахарным диабетом 2 типа, инфицированных HBV и HCV
Повернутись до змісту

Л.Ю. Хамнуева, И.В. Малов, Л.Ю. Андреева, О.В. Шагун, В.П. Зудаев Иркутский  государственный медицинский  университет,  г. Иркутск Роль цитокинов в аутоиммунной деструкции ? клеток у больных сахарным диабетом 2 типа, инфицированных HBV и HCV

Целью исследования было изучение частоты выявления аутоантител к островковым клеткам (ICA) и глутамат декарбоксилазе (GADА), активности цитокинов и их патогенетического значения в аутоиммунной деструкции ? клеток у больных сахарным диабетом (СД) 2 типа, инфицированных вирусами гепатита HBV и HCV. GAD+антитела выявлялись у 39,6 % (44 из 111) HВV инфицированных больных,  ICA у 25 %  (28 из 111) HСV инфицированных больных; у неинфицированных у 9,7 % (6 из 62) и у 1,6 % (1 из 62), соответственно. У 15 больных в сыворотке крови определялись оба вида антител, что составило 13,5 % от всех инфицированных HВV и HСV. У неинфицированных больных не определялись одновременно ICA и GAD антитела. Частота выявления ICA и GAD антител не зависела от фазы репликации вируса. Т. о., HВV и HСV инфекция может выступать инициирующим фактором развития аутоиммунной агрессии, направленной на  ? клетки. У GADA и ICA позитивных больных СД, инфицированных HВV и HСV, определялся высокий уровень сывороточного IL1 ? (100,38 пкг/мл) и IL4 (36,85 пкг/мл) в сравнении с группой GADA и  ICA негативных (35,0 пкг/мл и 13,72 пкг/мл, соответственно) (р = 0,021, р = 0,04). Не найдено  статистически  значимых различий в  содержании  TNF ?,  IL6 и  IFN ?.  Т. о., установлена значимая роль цитокинов  IL1 ? и  IL4 в деструкции  ? клеток у HBV и HCV инфицированных больных СД 2 типа. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. С. 20–24.)

Ключевые слова: сахарный диабет, HBV, HCV, ICA, GAD антитела, IL 1?, TNF?, IFN?.

В патогенезе развития абсолютной инсулиновой недостаточности у больных сахарным диабетом (СД) особое внимание уделяется вирусным инфекциям. Предполагается, что они могут непосредственно поражать ? клетки и приводить к быстрому развитию СД либо выступать в качестве инициирующего фактора аутоиммунного процесса в ? инсулярном аппарате поджелудочной железы. Возможно, к числу инициирующих аутоиммунную агрессию к ? клетке или прямо повреждающих факторов выступают  гепатотропные вирусы, учитывая их способность к внепеченочной репликации и высокий уровень инфицированности больных СД. Так, в развитии внепеченочных поражений обсуждается роль вероятной репликации вируса  гепатита C (HCV) в различных органах и тканях с развитием цитотоксических Т клеточных реакций, направленных как на антигены вируса, так и, возможно, на аутоантигены, образующиеся вследствие непосредственного повреждающего действия вируса на клеточном уровне  [15]. Важную роль в развитии аутоиммунной деструкции ? клеток могут играть цитокины—интерлейкины 1, 2, 4, 6, 10, фактор некроза опухоли, интерферон,— продукция которых существенно изменяется при инфицирования  гепатотропными вирусами. Научных работ, изучающих эту проблему, на данный момент в литературе не найдено.

Материалы и методы

На базе эндокринологического отделения Иркутской государственной областной клинической больницы № 1 в 2001–2004 гг. были обследованы больные сахарным диабетом 2 типа (506 человек): мужчин—111 (21,8 %), женщин— 395  (78,2 %); средний возраст составил 57,0 ± 10,5 лет. Диагноз СД 2  типа устанавливали в  соответствии с клиническими и лабораторными критериями ВОЗ  (1999). Определение антител к декарбоксилазе глутаминовой кислоты  (анти GAD) и антител к островковым клеткам  (цитоплазматическим компонентам  ? клеток; анти IC антител) в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом  с помощью наборов реагентов «Isletest GAD» и «Isletest ICA» (International version, Biomerica Inc. USA). Определение маркеров HВV  и HСV инфекции в сыворотке крови было проведено у всех 506 обследованных больных СД 2 типа иммуноферментным методом с использованием моно  и поликлональных антител производства  ЗАО «Вектор Бест» (г. Новосибирск). Определяли HBs антиген вируса гепатита В (HBsAg), иммуноглобулины класса IgG к core антигену вируса гепатита В (анти HBcIgG), суммарные антитела к вирусу гепатита С. Подтверждение положительных результатов проводили с помощью иммуноферментной тест системы «Рекомби  Бест  анти ВГС подтверждающий  тест». У больных СД 2 типа, в сыворотке крови которых были обнаружены маркеры вирусов  гепатита В или С, полимеразной цепной реакцией (ПЦР) определяли ДНК и РНК вирусов с по  мощью  тест системы «АмплиСенс HBV 470s/ВКО 770» и «Ампли Сенс HCV 240/ВКО 440» производства научно производственной лаборатории Федерального научно методического центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИД Централь  ного НИИ эпидемиологии МЗ РФ. Из 506 обследованных больных СД 2  типа  у 157 больных (31 %) были обнаружены маркеры вирусной инфекции, в т. ч. HBV—у 111 больных (21,9 %); HСV—у 46 (9,1 %). Фаза репликации вирусов выявлялась у 37 из 157 (23,5 %) инфицированных больных. У 349  (69 %) больных СД 2  типа маркеры HВV  и HСV инфекции в сыворотке крови не выявлялись. Антитела к GAD,  IC и  уровни цитокинов в  сыворотке крови исследовались у 111 из 157 HBV  и HCV инфицированных больных СД 2  типа и  у 62 из 349 неинфицированных больных СД 2 типа. Группы были сформированы в зависимости от инфицированности больных HBV или HCV, наличия репликации вируса : 1 я группа (n = 7)—больные СД 2 типа, инфицированные HBV, фаза репликации (HbsAg  aнти HBc, R+); 2 я  группа  (n = 68)—инфицированные HBV, нерепликативная фаза (aнти HBc, R ); 3 я  группа  (n = 23)—инфицированные HСV, фаза репликации (анти HCV, R +); 4 я группа (n = 13)—инфицированные HСV, нерепликативная фаза (анти HCV, R ); 5 я группа (n = 62)—неинфицированные больные СД 2 типа. Определение  уровня цитокинов в  сыворотке крови—интерферона альфа  (IFN?), фактора некроза опухоли альфа (TNF?), интерлейкина 1?  (IL1?), интерлейкина 4  (IL4), интерлейкина 6  (IL6) — проводили  с помощью реагентов «ProCon»  (ООО «Протеиновый контур», Санкт Петербург). Полученные результаты подвергали математической обработке  с использованием пакета  статистических программ «Statistica 6.0». Нормальность распределения проверяли  с помощью критерия Шапиро—Уилка. При сравнении двух не  связанных групп использовали критерий Манна—Уитни. Качественные показатели  сравнивали  с помощью критерия ?2. Анализ  зависимостей проводили  с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования определяли анти GAD и анти IC антитела к островковым клеткам в сыворотке крови иммуноферментным методом у 111 HВV и HСV инфицированных и 62 неинфицированных больных СД 2 типа. Анализ клинического материала показал достоверно более высокую частоту выявления антител к GAD у больных, инфицированных HВV и HСV (в 1-й группе—у 4 из 7 (57,1 %); во 2-й—у 25 из 68 (36,7 %); в 3-й—у 8 из 23 (34,8 %), в 4-й— у 7 из 13 (53,9 %), в сравнении с больными СД 2 типа, не инфицированными HВV и HСV, в группе 5—у 6 из 62 (9,7 %). Частота выявления антител к GAD не зависела от фазы репликации вируса. Так, в группе больных с репликативной фазой она со! ставила 40,0 ± 8,9 %, у больных в нерепликативной фазе—39,5 ± 5,4 % (р < 0,05). Показана высокая частота выявления антител к  IC у больных, инфицированных HВV и HСV. В 1-й группе—у 2 из 7 (28,6 %) пациентов; во 2-й— у 20 из 68 (29,4 %); в 3-й—у 4 из 23 (17,4 %), в сравнении с больными СД 2 типа, не инфицированными HВV и HСV, в  группе 5 — у 1 из 62  (1,6 %) (р < 0,05). В группе 4 антитела к IC выявлялись у 2 из 13 (15,4 %) пациентов, что превышало в 9 раз показатель в группе 5— 1,6 %, однако различия не достигли статистической значимости. Частота выявления антител к IC не зависела от фазы репликации вируса. Так, в  группе больных с репликативной фазой она составила 20,0 ± 1,3 %, в группе с нерепликативной фазой—21,5 ± 4,9 % (р = 0,59). Одновременное определение антител к GAD и ICA у больных СД более полно характеризует аутоиммунные процессы в клетках-мишенях и существенно повышает степень достоверности прогноза их разрушения и соответственно инсулиновой недостаточности, что подтверждает ряд крупных исследований  [1]. У 15 больных в сыворотке крови определялись оба вида антител, что составило 13,5 % от всех инфицированных HВV и HСV. Таким образом, на основании проведенного анализа можно прийти к заключению, что HВV и HСV инфекция может выступать инициирующим фактором развития аутоиммунной агрессии, направленной к ? клеткам поджелудочной железы. Многочисленными исследованиями показано, что контакт с возбудителем является сигналом к секреции моноцитами/макрофагами провоспалительных цитокинов IL1?, IL6, IL8, IL12, TNF? [4, 5, 7]. Поэтому нам представлялось важным изучить значение некоторых цитокинов как центральных медиаторов воспаления в механизмах деструкции ? клеток у больных СД, инфицированных HВV и HСV. Подразделение на  группы осуществлялось на этом втором этапе исследования в зависимости от присутствия в сыворотке крови антител к ?!клеткам (анти IC и анти GAD): 1. ICA и GADА негативные больные СД, инфицированные HВV и HСV (n = 44); 2. GADА позитивные больные СД, инфицированные HВV и HСV (n = 23); 3. ICA!позитивные больные СД, инфицированные HВV и HСV (n = 10); 4. ICA и GADА позитивные больные СД, инфицированные HВV и HСV (n = 12). При оценке уровня IL1? в сыворотке крови больных, подразделенных на  группы в зависимости от присутствия аутоантител, в качестве группы сравнения выступали больные СД, у которых в сыворотке не обнаруживались эти аутоантитела. Характер распределения показателей содержания  IL1? и других цитокинов отличался от нормального во всех группах. Поэтому в расчетах применялись непараметрические методы статистического анализа, и обсуждалась медиана вариационных рядов. В  группе GADA и  ICA позитивных больных СД, инфицированных HВV и HСV, уровень сывороточного IL1? был высоким и составлял 100,38 пкг/мл, что было достоверно выше, чем в группе GADA и ICA негативных больных СД, у которых уровень этого цитокина в сыворотке крови составлял 35,0 пкг/мл (табл. 1). Известно, что с действием IL1? связана селективная цитотоксичность в отношении ? клеток, которую потенцирует TNF?  [14], также выделяемый макрофагами. TNF? оказывает мощное провоспалительное действие и играет важную роль в патогенезе тканевого и клеточного повреждения. Как самостоятельно, так и в содружестве с другими цитокинами, TNF? участвует в цитотоксических процессах в клетках [10]. Нами был изучен уровень сывороточного TNF? в тех же группах, где исследовался уровень IL1?. Наиболее низкое содержание TNF? отмечалось в группе GADA и ICA негативных больных СД, выше оно было в  группах больных СД GADA и/или ICA позитивных. Повышение TNF? наблюдалось в тех же группах, где был обнаружен повышенный уровень IL1?, но различия не достигли статистической значимости  (табл. 1). Для оценки взаимосвязи IL1? и TNF? был проведен корреляционный анализ. Коэффициент ранговой корреляции составил r = 0,46 (р < 0,001), что указывает на наличие статистически значимой корреляции средней степени между этими двумя цитокинами, подтверждающей однонаправленность их действия. К  группе противовоспалительных цитокинов относится  IL4  [7], способный подавлять клеточно-опосредованные иммунные механизмы защиты организма от внутриклеточных патогенов  (в том числе вирусов). Имеются данные о протективной роли IL4 в развитии диабета [11]. Для здоровых людей характерны низкие концентрации этого цитокина, в то время как у половины больных хроническим  гепатитом С отмечается умеренное его повышение [3]. Общепризнано, что IL4 принимает участие в усилении синтеза антител, выступает как фактор пролиферации В и Т лимфоцитов, тучных клеток, подавляет фагоцитарную активность [7]. При изучении уровня сывороточного  IL4 у GADА и ICA позитивных и негативных больных СД, инфицированных HBV и HCV, наименьшая ме! диана данного показателя регистрировалась в группе больных СД, негативных одновременно по антителам к GAD и IC, она составила в этой группе 13,72 пкг/мл. У GADА или  ICA позитивных больных СД медиана IL4 была выше: 15,38 пкг/мл и 34,52 пкг/мл, соответственно. Наиболее высокий уровень IL4 в сыворотке крови (36,85 пкг/мл) отмечен в группе больных СД, позитивных одновременно по антителам к GAD и  IC. Отличие этой группы от  группы GADА и  ICA негативных больных было статистически значимым (р = 0,04) (табл. 1.). Корреляционный анализ показал наличие статистически достоверной корреляции средней степени между уровнями  IL4 и  IL1? (r = 0,66, р < 0,001) и  IL4 и TNF?  (r = 0,54, р < 0,001), что подтверждает единый механизм регуляции и взаимозависимость системного и локального действия данных цитокинов у больных СД, инфицированных HBV и HCV. Повышение уровня  IL4 в  группе GADА и  ICA позитивных больных СД, инфицированных HBV и HCV, свидетельствовало о его участии в механизмах активации  гуморального иммунитета, в  том числе в продукции аутоантител к  ? клеткам поджелудочной железы. Между отдельными провоспалительными цито! кинами, наряду с синергизмом, существуют сложные взаиморегулирующие отношения.

Таблица  1 Уровень cывороточного IL1, TNF? и IL4 у GADA и ICA позитивных и негативных больных СД, инфицированных HBV и HCVПримечание. Здесь и в  табл. 2 p — достоверность различия показателей  (критерий Манна—Уитни).

 

Таблица  2 Уровень cывороточного IFN ? и IL6 у GADA и ICA позитивных и негативных больных СД, инфицированных HBV и HCV

 

В частности, IL6 аутокринно ингибирует продукцию макрофагами  IL1? и TNF?,  которые сами являются активными индукторами синтеза  IL6. Наряду с провоспалительными для IL6 характерны и противовоспалительные эффекты, опосредованные синтезом и секрецией антагонистов провоспалительных цитокинов  [7, 8]. В литературе обсуждается участие IL6 в процессе деструкции ? клеток. В нашем исследовании у больных СД не получено достоверных различий по уровню  IL6 у GADА и ICA позитивных и негативных больных СД 2 типа, инфицированных HBV и HCV (табл. 2). Хотя медиана IL6 была выше в группе GADА и ICA позитивных больных  (18,75 пкг/мл), чем в других обследуемых  группах, в которых она составила 0,0 пкг/мл, это отличие не было достоверным. Отсутствие значимого увеличения уровня сывороточного  IL6 у GADА и  ICA позитивных больных СД, вероятно, объясняется, тем, что у больных СД, инфицированных HBV и HCV, достоверно снижен IL6 (медиана 0,0 пкг/мл) в сравнении с группой неинфицированных больных СД (медиана 25,57 пкг/мл) (р = 0,002). Результаты наших исследований подтверждают отечественные и зарубежные работы, в которых показано отсутствие повышения уровня  IL6 или даже его снижение у HBV и HCV инфицированных лиц по сравнению с не инфицированными [9]. Таким образом, в проведенном нами исследовании не установлено значимой роли IL6 в деструкции ? клеток у HBV и HCV инфицированных больных СД. В механизмах деструкции ? клеток при СД отводится важная роль IFN как одному из основных факторов индукции аутоиммунных процессов, как цитокину, потенцирующему действие  IL1?, как медиатору острой фазы воспаления, тканевой травмы и инфекции  [2]. Значение  IFN при вирусных инфекциях широко освещается в литературе последних лет. Как правило, любая острая вирусная инфекция характеризуется значительным повышением уровня циркулирующего  IFN. Вирусы же гепатитов отличаются слабой способностью индуцировать синтез IFN и поэтому не способны вызвать достаточное повышение уровня циркулирующего IFN для развития антивирусного состояниялимфоцитов и обеспечения необходимой защиты клеток, что может привести в ряде случаев к хронизации процесса [6, 13]. Нами не найдено статистически значимых различий в содержания IFN? в зависимости от присутствия или отсутствия анти IC и анти GAD антител в сыворотке крови у больных. В целом показатели уровня  IFN у обследуемых не превышали нормальных значений, характерных для  группы здоровых лиц  (табл. 2). Необходимо принять во внимание, что ни один из обследуемых больных СД не находился в острой стадии вирусного гепатита, в которой, по данным некоторых исследователей  [6, 12], можно было бы ожидать умеренного повышения уровня  IFN. Вообще, процесс аутоиммунной деструкции клеток значительно пролонгирован во времени после первичной инициации. В нашем исследовании фиксируется факт присутствия аутоиммунной деструкции клеток поджелудочной железы, но не момента запуска сложных патологических процессов. Поэтому представленные результаты не исключают роль IFN? в аутоиммунном разрушении ? клеток. При проведении анализа данных литературы нами не найдено исследований, посвященных изучению значимости различных цитокинов в механизмах деструкции ? клеток у больных СД, инфицированных HBV и HCV. На наш взгляд, действие гепатотропных вирусов на организм инфицированного включает особенности ответа его иммунной системы. Таким образом, в результате проведенного комплексного корреляционного и сравнительного анализа установлены: – значимая роль  IL1? в течении молекулярно-биохимических процессов деструкции ? клеток у HBV и HCV инфицированных больных СД; – участие IL4 в механизмах активации гуморального иммунитета, в том числе в продукции аутоантител к ? клеткам поджелудочной железы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Балаболкин М.И. Диабетология. — М.: Медицина, 2000. — С. 177–187, 190, 212–218.

2. Дедов И.И., Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Щербачева Л.Н. Сахарный диабет у детей и подростков. — М.: Универсум паблишинг, 2002. — С. 31–40.

3. Журкин А.С., Соловьев С.В. Продукция цитокинов и интерферонотерапия у больных хроническими вирусными  гепатитами // Эпидемиол. инфекц. болезни. — 1999. — № 5. — С. 27–29.

4. Ивашкин В.Т., Мамаев С.Н., Лукина Е.А. и др. Система цитокинов у больных хроническими диффузными  заболеваниями печени  // Иммунология. — 2001. — № 1. — С. 46–48.

5. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета // Иммунология. — 1995. — № 3. — С. 30–44.

6. Павлова Л.Е., Макашова В.В., Токмалаев А.К. Система интерферона при вирусных гепатитах // Эпидемиол. инфекц. болезни. — 2000. — № 1. — С. 48–51.

7. Фрейдлин И.С. Паракринные и аутокринные механизмы цитокиновой иммунорегуляции // Иммунология. — 2001. — № 5. — С. 4–7.

8. Черешнев В.А., Гусев Е.Ю. Иммунология воспаления: роль цитокинов // Мед. иммунология. — 2001. — Т. 3, № 3. — С. 361–368.

9. Шульпекова Ю.О., Мамаев С.Н., Лукина Е.А. и др. Цитокиновый профиль сыворотки крови больных хроническим вирусным гепатитом С, ассоциированным с 1–3 ростковой цитопенией в крови // Росс. журн. гепатол., гастроэнтерол. и колопрокт. — 2001. — № 6. — С. 58–64.

10. Ягода А.В., Гейвандова Н.И., Хубиев Ш.М. и др. Фактор некроза опухоли a при хронических вирусных гепатитах: патогенетическая роль, пути фармакологической коррекции // Иммунология. — 2000. — № 2. — С. 36–38.

11. Berman M.A., Sandborg C.I., Wang Z., Imfeld K.L. at al. Decreased IL 4 production  in new onset type I  insulin dependent diabetes mellitus //  J. Im  munol. — 1996. — Vol. 157, № 10. — P. 4690–4696.

12. Levin S., Hahn T.  Interferon  system  in acute  viral hepatitis  //  Lancet. — 1982. — № 8272. — P. 592–594.

13. Levin S., Hahn T.  Interferon deficiency  syndrome  // Clin. Exp.  Immunol. — 1985. — Vol. 60, № 2. — P. 267–273.

14. Mandrup Poulsen T., Bendtzen K., Dinarello C.A., Nerup J. Human tumor necro  sis  factor potentiates human  interleukin 1 mediated  rat pancreatic beta cell cytotoxicity // J. Immunol. — 1987. — Vol. 139. — P. 4077–4082.

15. Yan F., Hao F., Zhao L. Study of expression of hepatitis C virus antigens and viral replication  in extrahepatic  tissues  // Chung Hua Kan Tsang Ping Tsa Chin. — 2000. — Vol. 8, № 1. — P. 40–42.

The impact of cytokines on autoimmune ? cell destruction in HBV and HCV infected patients with type II diabetes mellitus L.Yu. Khamnueva, I.V. Malov, L.Yu. Andreeva, O.V. Shagun, V.P. Zudaev State Medical University, Irkutsk

The aim of the investigation was to study frequency of anti pancreatic islet cells (ICA) and anti glutamic acid decarboxylase  (GADA) antibodies  in  comparison with  cytokines  serum  levels  in order  to elucidate cytokines pathogenic  importance  in autoimmune destruction of ? cells  in HBV and HCV infected patients with  type  II diabetes mellitus  (DM  II). GADA were  revealed  in 39,6 %  (28  from 111) of HBV infected patients, ICA in 25 % (28 from 111) of HCV infected patients compared to 9,7 % (6 from 62) and 1,6 % (1 from 62) in non+infected DM II patients. In non infected patients, ICA and GADA were not revealed simultaneously. Both kinds of antibodies were revealed in 15 (13,5 %) HBV+ and HCV+infected patients. The  frequency of  ICA and GADA did not depend on  the virus  replication phase. Thus, HBV and HCV infection may be an initiating factor for the autoimmune aggression directed to ? cells development. High serum levels of IL1? (100,38 pg/ml) and IL4 (36,85 pg/ml) were detected in GADA and  ICA positive DM II patients infected with HBV and HCV compared to lower levels of these cytokines in the GADA and ICA+negative group (35,0 pg/ml and 13,72 pg/ml, respectively) (p = 0,021, p = 0,04). Statistically insignificant differences were found in the serum contents of TNF? , IL6 and IFN ?. Thus, we have established the considerable role of IL1 ?, IL4 cytokines in ? cells destruction in DM II patients infected with HBV and HCV. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 3. P. 20–24.)

Key words: diabetes mellitus, HBV, HCV, islet cell antibodies (ICA), glutamic acid decarboxylase antibodies (GADA), IL1?, TNF?, IFN?.



загрузка...