загрузка...
 
В.В. Денисова , А.Д. Кулагин , И.А. Лисуков , И.В. Крючкова , С.А. Сизикова , С.В. Сенников , В.А. Козлов  Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск;  Новосибирская  государственная медицинская академия Продукция цитокинов эритрокариоцитами костного мозга больных лимфомами при проведении химиотерапии
Повернутись до змісту

В.В. Денисова , А.Д. Кулагин , И.А. Лисуков , И.В. Крючкова , С.А. Сизикова , С.В. Сенников , В.А. Козлов  Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск;  Новосибирская  государственная медицинская академия Продукция цитокинов эритрокариоцитами костного мозга больных лимфомами при проведении химиотерапии

 Как показано ранее, эритроидные ядросодержащие клетки (ЭЯК) способны продуцировать цитокины, регулирующие гемоиммунопоэз в норме. Нами было проведено сравнительное исследование продукции цитокинов Гликофорин А позитивными ЭЯК костного мозга (КМ) здоровых доноров и пациентов с лимфомами до и после химиотерапии.

Анализ проведен в следующих группах:

1) здоровые доноры;

2) больные с неходжкинскими агрессивными лимфомами и лимфомами Ходжкина до лечения;

3) больные после химиотерапии (СHOP подобные курсы и/или BEAM с аутологичной ТСКК). ЭЯК КМ выделяли методом пеннинга с использованием Гликофорин А специфичных антител. После культивирования клеток оценивали концентрации цитокинов в их кондиционных средах методом мультиплексного анализа на приборе BioPlex (BioRad, USA).

Выявлена способность ЭЯК продуцировать  IL1?,  IL2,  IL4,  IL6,  IL8,  IL10,  IL13,  IL17,  TNF?,  IFN?, GCSF, GMCSF, MCP1, MIP1?, но не  IL5,  IL7,  IL%12(p70). У больных  с лимфомами как до,  так и после лечения, несмотря на достижение ремиссии опухоли, выявлено достоверное снижение уровня продуцируемых ЭЯК  IL1?,  IL4,  IL10,  IL6,  IL8,  IL17, GCSF, MCP1, MIP1?, что может быть  следствием влияния химиотерапии или неадекватной регуляции секреторной функции ЭЯК костномозговым микроокружением. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 4. С. 17–21.)

Ключевые  слова: цитокины,  эритроидные ядросодержащие клетки, лимфома,  химиотерапия.

В результате изучения иммунных и иммунорегуляторных функций эритроидных ядросодержащих клеток  (ЭЯК) было показано, что эритрокариоциты мыши способны к ауторегуляции, подавляют рост малигнизированных клеток и стимулируют естественную противоопухолевую активность клеток костного мозга (КМ) [11]. По крайней мере, часть этих функций эритрокариоциты осуществляют посредством продукции цитокинов. К настоящему времени показана способность ЭЯК различных  гемопоэтических органов млекопитающих продуцировать IL1?, IL2, IL4, IL6, IL10, TGF?1, IFN?, TNF?, VEGF [7, 12]. Эти фундаментальные данные являются объективной основой для изучения роли секреторной функции эритрокариоцитов в патогенезе опухолевых заболеваний, которые часто сопровождаются нарушением эритропоэза и, как следствие, анемией  [5]. Так, ентов с лимфомами и ассоциируются с плохим прогнозом течения заболевания [10]. Несмотря на активную разработку методов иммунотерапии, химиотерапия пока является единственным методом лечения онкогематологических заболеваний, позволяющим достигать длительных ремиссий или даже выздоровления больных [2]. К сожалению, цитостатики действуют не избирательно и являются ятрогенным повреждающим фактором в отношении нормальных клеток при терапии опухолей  [3]. Эритрокариоциты в данном случае не являются исключением, т. к. пост цитостатическая анемия—частое осложнение химиотерапии  [3, 9]. Помимо нарушения пролиферации, цитостатики индуцируют функциональные дефекты нормальных клеток, сохраняющиеся в отдаленный период [7, 13, 14]. Подобного действия цитостатиков нельзя исключить и в отношении эритрокариоцитов. Дефекты эритрокариоцитов, индуцированные цитостатиками, могут быть причиной нарушения их синтезирующей функции и, как следствие—дизгемопоэтических состояний [4]. И если значение иммунокомпетентных клеток при разных патологиях изучается активно, то роль иммунорегуляторных функций эритрокариоцитов практически не исследована. В связи с этим и было предпринято изучение продукции цитокинов эритрокариоцитами КМ больных лимфомами при проведении химиотерапии.

Материалы и методы

Цитокинсин тезирующую активность ЭЯК КМ оценивали  у больных агрессивными крупноклеточными неходжкинскими В диффузными, Т анапластическими лимфомами (НХЛ) и лимфомами Ходжкина (ЛХ). В исследование не включались больные  с лейкемической  трансформацией НХЛ. Все пациенты получали стандартную ПХТ: 1 я линия—CHOP при НХЛ, ABVD при ЛГМ, 2 я линия высокодозной ПХТ—DHAP или BAEM  с аутологичной  трансплантацией СКК  (ауто0ТСКК). Анализ результатов исследований проводили в  трех  группах: 1 я  группа—до лечения, 2 я группа—после 4–8 курсов ПХТ 1 й линии, 3 я  группа — после 2–6 курсов ПХТ 2 й линии и/или ауто ТСКК. Условиями для выборки двух последних групп являлась установленная после рестажирования ремиссия заболевания  (для исключения цитокин продуцирующей активности  опухоли),  а  также  восстановление  показателей периферической крови  (Hb > 100  г/л, нейтрофилы > 500/мкл и  тромбоциты > 50  тыс/мкл). Контрольную  группу  составили 16 практически  здоровых добровольных доноров в возрасте от 18 до 40 лет. Все группы были сопоставимы по полу и возрасту. Все обследованные были информированы о целях и методах исследования, получено их добровольное  согласие. Аспираты КМ в объеме 15–20 мл получали при проведении трепанобиопсии в период диагностики  заболевания и при проведении очередного рестажирования. Мононуклеарные клетки  (МНК) выделяли в  градиенте плотности фиколлаверографина (1,077 г/см3). Позитивная селекция Гликофорин А (ГкА)0позитивных ЭЯК (ГкА+ЭЯК) из популяции МНК КМ производилась методом непрямого пеннинга  с использованием моноклональных антител к человеческому  ГкА  (Harlan Sera Lab, UK Abcam  Ltd., UK, или BD PharMingen, USA). Контроль чистоты выделенной популяции осуществляли  стандартной окраской мазка клеточной взвеси по Романовскому Гимза и окраской внутриклеточного  гемоглобина. Процент  эритроидных  (гемоглобин содержащих) клеток  составлял более 97 %. После  селекции  ГкА+ЭЯК  культивировали в концентрации 1 млн/мл в течение 24 ч в среде RPMI 1640. Образцы кондиционной  среды  хранили при –20°С в аликвотах по 120 мкл до момента определения цитокинов. Количественные значения IL1?, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12(p70), IL13, IL17, TNF?, IFN?, G0GSF, GM0GSF, MCP1, MIP1? в кондиционных средах клеточных культур оценивали методом проточной иммунофлюоресценции на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (BioPlex Protein Assay System, BioRad,  США). Перед исследованием кондиционные  среды размораживали и фильтровали через одноразовые нитроцеллюлозные фильтры  с порами 0,4 мкм в диаметре.

Для исследования концентрации цитокинов в 50 мкл образца использовали коммерческую систему HUMAN 170PLEX  (N171A11171)  и  HUMAN  CYTOKINE  TH1/TH2 (N171A11081  (BioRad, США) в  соответствии  с инструкцией фирмы производителя. Для исключения «эффекта матрикса» при обработке полученных результатов в качестве растворов для рекомбинантных цитокинов использовали идентичные среды с одинаковым содержанием сыворотки. Диапазон измерений—от 2 пкг/мл до 32000 пкг/мл. Концентрацию цитокинов рассчитывали при помощи программного обеспечения, поставляемого фирмой Bio Rad (Bio Plex Manadger 3.0), относительно  стандартных калибровочных разведений. Статистическую обработку полученных результатов проводили непараметрическими методами  (программа «Statistica 5.0»).

Результаты и обсуждение

Учитывая важную роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения КМ в функционировании  гемопоэтических ростков, предварительно была исследована способность общей популяции МНК КМ (из которой впоследствии и были выделены эритрокариоциты в результате селекции) нормальных доноров, а также пациентов с лимфомами, спонтанно продуцировать цитокины in vitro [3]. Следует отметить, что, в отличие от периферической крови, МНК КМ, выделяемые на градиенте плотности (1,077 г/см3), помимо лимфоцитов и моноцитов представлены ЭЯК, а также незначительным количеством созревающих клеток гранулоцитарного ростка (промиелоцитов) и бластных форм [1]. При изучении спонтанной продукции 9 цитокинов в панели HUMAN CYTOKINE TH1/TH2 мононуклеарными клетками КМ условно здоровых доноров методом проточной иммунофлуориметрии было обнаружено, что в супернатантах МНК КМ после 24 ч культивирования содержатся определяемые концентрации только TNF? и IL10  (табл. 1). Присутствие же секреторных форм IL2, IL4, IL5, IL12, IL13, IFN? и GMCSF в кондиционных средах МНК КМ обнаружено не было. Продуцируемые МНК доноров цитокины

Таблица  1 Спонтанная продукция цитокинов МНК костного мозга через 24 ч культивирования

 

Примечание. НД — не детектируются.

относятся к разным группам по отношению к воспалительному процессу: TNF? является мощным провоспалительным агентом, тогда как «антицитокиновый цитокин»  IL10 обладает противовоспалительными функциями.

Таким образом, несмотря на скудность спектра продуцируемых цитокинов МНК КМ при данных культуральных условиях, одновременная продукция детектируемых концентраций цитокинов, обладающих реципрокными функциями, свидетельствует о наличии баланса в цитокиновой сети в этой клеточной фракции. У больных лимфомами, помимо TNF? и  IL10, МНК КМ секретировали в культуральную среду IL2 и IFN?. Наличие в среде МНК больных лимфомами цитокинов Th1 профиля IL2 и IFN? может быть следствием активации противоопухолевого иммунитета. Среди разных пациентов, получивших химиотерапию, а также межнозологических различий в продукции цитокинов выявлено не было, в связи с чем пациенты после химиотерапии  были  объединены  в  общую  группу «больные после лечения». В этой группе выявлялось недостоверное повышение продукции TNF?, IL10 и  IFN? МНК в сравнении с  группой до лечения, а концентрации IL2 находились в пределах ошибки метода. Следует отметить, что ГкА+клетки составляют до 50 % ядросодержащих клеток КМ [15]. Доля эритроидных клеток в МНК после выделения на градиенте плотности составляла в наших исследованиях в среднем 25 %. Часть эритроидных клеток разрушалась, вероятно, вследствие иммунного гемолиза [1]. Принимая во внимание то, что ЭЯК составляли значительную часть МНК, интересным  явилось  отсутствие большинства цитокинов, продуцируемых чистой популяцией ЭЯК в среде, кондиционированной общей популяцией МНК КМ. Тем не менее данные предшествующих исследований свидетельствуют о том, что обогащенная популяция ГкА+ЭЯК здоровых доноров продуцирует при тех же культуральных условиях  (24 часовая  спонтанная продукция)  более  широкий спектр цитокинов:  IL1?,  IL2, IL4,  IL6,  IL10, TGF?,  IFN?, TNF?  [7]. Однако в составе общей популяции МНК эритрокариоциты не проявляют  своей способности продуцировать IL2, IL4 и  IFN?. Учитывая эти данные, в дальнейшем была исследована цитокин продуцирующая активность фракции ГкА+клеток, выделенной из состава МНК аналогичным методом, но с помощью более широкой панели изучаемых белков, для выявления более подробной картины цитокинпродуцирующей активности фракции эритрокариоцитов. При использовании мультиплексной панели HUMAN 17 PLEX для определения цитокинов человека, включающей IL1?, IL2, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL10, IL12, IL13, IL17, IFN?, TNF?, GCSF, GMCSF, MCP1 и MIP1?, нами было подтверждено наличие продукции, ранее показанной для IL1?, IL2, IL4, IL6, IL10, IFN?, TNF? [4], и впервые выявлена способность ГкА+ЭЯК клеток КМ человека продуцировать IL8, IL13, IL17, GCSF, GMCSF, MCP1 и MIP1? (табл. 2). Учитывая то, что  IL5,  IL7 и  IL12 не детектировались или их определяемые концентрации находились на нижней  границе чувствительности метода, было сделано заключение об отсутствии способности ЭЯК КМ секретировать данные белки в используемых культуральных условиях.

Таким образом, эритрокариоциты КМ человека в норме являются одним из источников широчайшего спектра биологически активных веществ: негативных и позитивных регуляторов, участвующих как в аутокринной регуляции эритропоэза, так и в паракринной регуляции  гемоиммунопоэза и иммунных функций  [8]. Так, продуцируя  IL1?,

Таблица  2 Спонтанная продукция цитокинов Гликофорин А позитивными эритрокариоцитами костного мозга через 24 ч культивирования (Bio Plex Analyser)

 

Примечание. * — Достоверное отличие от доноров.

 GCSF и GMCSF, ЭЯК могут стимулировать пролиферацию ранних  гемопоэтических предшественников и дифференцировку клеток миелоидного ростка. Посредством продукции MCP1 и IL8 эритрокариоциты способны регулировать хемотаксис нейтрофилов и моноцитов/макрофагов в КМ. IL2, IFN? эритроидной природы являются потенциальными индукторами Th1 клеточного ответа, а IL4, IL6, IL10, IL13, TNF? могут активировать Th2 зависимый гуморальный иммунитет. Значительный уровень продукции IL6 свидетельствует о возможном прямом влиянии ЭЯК на пролиферацию В лимфоцитов и функцию плазматических клеток. Кроме того, способность к продукции IL10, TGF?1 и MIP1? отражает наличие иммуносупрессорной, а  IFN? и TNF?  — противоопухолевой активности ЭЯК КМ. А учитывая, что ЭЯК экспрессируют рецепторы к некоторым цитокинам, вероятен также механизм аутокринной регуляции эритропоэза. Учитывая эти результаты, а также данные литературы о роли ряда цитокинов в развитии нарушений эритропоэза при развитии опухолей, следующим этапом исследования явилось изучение особенностей продукции цитокинов, секретируемых ЭЯК, у больных лимфомами. Кроме того, химиотерапия опухолей является ятрогенным повреждающим фактором в отношении эритроидного ростка КМ [9]. Поэтому цитокин продуцирующая активность ЭЯК была изучена и в  группе больных, получивших ХТ. После статистической обработки результатов была показана достоверно более низкая продукция цитокинов  IL6,  IL8,  IL17, GCSF, MCP1 и MIP1? эритрокариоцитами КМ у больных лимфомами (см. табл. 2). После проведения программ химиотерапии и достижения ремиссии опухоли продукция вышеуказанных цитокинов оставалась сниженной. ЭЯК больных лимфомами, как и клетки доноров, не продуцировали IL5 и IL7 и IL12.

Таким образом, обогащенная популяция эритроидных ГкА+клеток КМ у больных лимфомами также способна продуцировать широчайший спектр иммуногеморегуляторных цитокинов подобно нормальным эритрокариоцитам доноров. Однако, в целом, цитокин продуцирующая способность данных клеток значительно снижена у больных как до, так и после химиотерапии, несмотря на достижение ремиссии основного заболевания. Принимая во внимание тот факт, что в составе МНК эритрокариоциты не проявляют всей своей цитокин синтезирующей активности, можно предположить наличие негативного контроля со стороны костномозгового микроокружения  [3]. Этот механизм может быть особо патогенетически значимым при патологии, сопровождающейся  гиперактивацией иммунокомпетентного микроокружения, что характерно для опухолевого процесса  [6]. Повреждение микроокружения КМ, а, возможно, и самих эритроидных предшественников, в процессе ПХТ,—важный механизм длительных пост цитостатических дизгемопоэтических состояний  [13]. Учитывая способность ЭЯК к ауторегуляции и наличие рецепторов к цитокинам, можно предположить нарушение аутокринной регуляции эритропоэза в условиях недостаточности секреторной функции эритрокариоцитов при персистенции опухоли или проведении химиотерапии, что может быть причиной канцериндуцированных, постцитостатических анемий. Способность к продукции цитокинов, препятствующих прогрессии опухоли, может являться естественным механизмом эритроопосредованного противоопухолевого надзора. В случае лимфопролиферативных заболеваний этот механизм представляется наиболее вероятным, учитывая конкурентные взаимоотношения эритроидного и лимфоидного ростков в норме, а также при лимфомогенезе. Технология мультиплексного анализа уровня цитокинов с использованием анализатора Bio Plex Protein Assay System (BioRad, USA) позволила нам показать более широкий спектр цитокинов, продуцируемых ГкА+ЭЯК, в норме, и впервые выявить особенности секреторной функции эритрокариоцитов у больных лимфомами при химиотерапии, что предполагает огромный иммуно геморегуляторный потенциал эритрокариоцитов КМ в норме и при патологии. У пациентов с лимфомами до лечения, а также в период цитостатически индуцированной ремиссии выявлен выраженный дефект способности эритрокариоцитов спонтанно продуцировать ряд цитокинов, заключающийся в недостаточной их секреции в сравнении с уровнем продукции у доноров. Понимание особенностей продукции цитокинов всеми клеточными популяциями КМ при различных заболеваниях поможет создать более полную картину внутрикостно мозговой цитокиновой сети, что может быть использовано для разработки более полноценных методов цитокино профилактики, цитокинотерапии и цитокино реабилитации больных после агрессивных методов лечения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Афанасьев Б.В., Алмазов В.А. Родоначальные кроветворные клетки человека.—Л.: Наука.—1985.—204 с.

2. Клиническая онкогематология / Под ред. М.А. Волковой—М.: Медицина, 2001. — 576  с.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях.—Томск: STT, 1999.—128 с.

4. Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Киселев С.В. и др. Взаимосвязь нарушений гемопоэза и иммунных дефектов у больных злокачественными лимфомами с тяжелой цитостатической пpедлеченностью  //  Гематол.  трансфузиол. — 2001.—№ 6.—С. 6–10.

5. Новицкий В.В., Степовая Е.А., Гольдберг В.Е. и др. Эритроциты и злокачественные образования.—Томск: STT, 2000.—288 с.

6. Павлов А.Д., Морщакова Е.Ф. Этиология и патогенез анемии при  злокачественных новообразованиях // Вопр. гематол., онкол. иммунол. в педиатрии.—2004.—Т. 3, № 1.—С. 50–55.

7. Сенников С.В., Козлов В.А. Цитокин синтезирующая активность эритроидных ядросодержащих клеток. В сб.: «Система цитокинов».—Новосибирск: Наука, 2004.—С. 63–79.

8. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в нор0 ме и при патологии // Иммунология.—1997.—№ 5.—P. 7–14.

9. Groopman J.E., Itri L.M. Chemotherapy0induced anemia in adults: incidence and treatment // J. Natl. Cancer Inst.—1999.—Vol. 91, № 19.—P. 1616–1634.

10. Moullet I., Salles G., Ketterer N. et al. Frequency and significance of anemia in non Hodgkin’s lymphoma patients // Ann. Oncol.—1998.—Vol. 9, №10.— P. 1109–1115.

11. Seledtsov V.I., Taraban V.Y. et al. Tumor growth inhibitory and natural suppressor activities of murine bone marrow cells: a comparative study // Cell. Immunol.—1997.—Vol. 182, № 1.—P. 12–19.

12. Majka M., Janowska0Wieczorek A., Ratajczak J. et al. Numerous growth factors, cytokines, and chemokines are secreted by human CD34(+) cells, myeloblasts, erythroblasts, and megakaryoblasts and regulate normal hematopoie0 sis in an autocrine/paracrine manner // Blood.—2001.—Vol. 97, № 10. — P. 3075–3085.

13. Soligo D.A., Lambertenghi Deliliers G., Servida F. et al. Haematopoietic abnormalities after autologous stem cell  transplantation  in  lymphoma patients // Bone Marrow Transplant.—1998.—Vol. 21, № 1.—P. 15–22.

14. Schwartz G.N., Warren M.K., Rothwell S.W. et al. Post chemotherapy and cytokine pretreated marrow stromal cell layers suppress hematopoiesis from normal donor CD34+  cells  // Bone Marrow Transplant.—1998.—Vol. 22, № 5.— P. 457–468.

15. Yurchenco P.D., Furthmayr H. Expression of red cell membrane proteins in eryth0 roid precursor  cells  //  J. Supramol. Struct. — 1980. — Vol. 13, № 2. — P. 255–269.

Cytokine production by erythroid marrow nuclear cells in lymphoma patients after chemotherapy V.V. Denisova , A.D. Kulagin , I.A. Lisukov , I.V. Kruchkova , S.A. Sizikova , S.V. Sennikov , V.A. Kozlov  Institute of Clinical Immunology SB RAMS, Novosibirsk,     Novosibirsk

State Medical Academy Erythroid nuclear cells (ENC) produce a number of cytokines which regulate normal hemopoiesis. Glycophorin A+  (GlA+ ) ENC isolated from bone marrow of normal individuals and lymphoma patients before and after chemotherapy were used to  investigate the comparative  features of cytokine production by the erythroid progenitors.

Analysis was performed in groups:

1) normal individuals,

2)  lymphoma patients (aggressive non Hodgkin’s  lymphoma, Hodgkin’s  lymphoma) before chemotherapy,

3) patients after hematological recovery from chemotherapy (CHOP like, BEAM) or/and followed by autologous peripheral blood  stem  cells  transplantation  (PBSCT). ENC were  isolated  from bone marrow by panning procedure using specific antibodies to GlA. After cultivation, cytokine concentration in the cells’ condition medium was measured by multiplex cytokine array assay (Bio Plex, BioRad, USA) using a Humanplex panels. Spontaneous production of  IL1?,  IL2,  IL4,  IL6,  IL8,  IL10,  IL13,  IL17, TNF?,  IFN?, GCSF, GMCSF, MCP1, MIP1?, but not  IL5,  IL7,  IL12(p70) by bone marrow MNC and ENC  in vitro was  revealed. All  lymphoma patients  showed a  significant decrease of  IL1?,  IL4,  IL10,  IL6,  IL8, IL17, GCSF, MCP1, MIP1? production by ENC compared to healthy donors (p < 0,05). Cytokine synthesizing activity of lymphoma patients’ marrow ENC did not reach normal level in complete remission. Abnormal cytokine synthesizing activity of GlA+  bone marrow cells in lymphoma patients after chemotherapy may be  related  to possible  intrinsic erythroid  cells defect or  inadequate  regulation by haemopoietic microenvironment. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 4. P. 17–21.)

Key words: cytokines, erythroid nuclear cells,  lymphoma, chemotherapy.



загрузка...