загрузка...
 
Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова, Н.В. Крошкина, И.А. Панова, М.В. Веденеева, Ю.В. Гагаева ГУ «Ивановский научноисследовательский институт материнства и детства им. В.Н.  Городкова МЗ РФ» Продукция цитокинов децидуальными макрофагами при физиологической беременности и синдроме  задержки внутриутробного развития плода
Повернутись до змісту

Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова, Н.В. Крошкина, И.А. Панова, М.В. Веденеева, Ю.В. Гагаева ГУ «Ивановский научноисследовательский институт материнства и детства им. В.Н.  Городкова МЗ РФ» Продукция цитокинов децидуальными макрофагами при физиологической беременности и синдроме  задержки внутриутробного развития плода

Методом проточной цитометрии выявлено снижение внутриклеточного синтеза IL1?, IL10, IL12 в макрофагах децидуальной оболочки плаценты женщин  с  синдромом  задержки развития плода (СЗРП). В экстрактах децидуальной ткани при СЗРП были снижены уровни IL1? и IL10 и повышено содержание IL12. Децидуальные макрофаги при СЗРП характеризовались сниженной экспрессией антигенов MHC II и увеличением пула CD11b клеток.

Таким образом, при СЗРП в децидуальной оболочке плаценты наблюдается неадекватная активация децидуальных макрофагов, сопровождающаяся нарушением их  синтетической и антиген презентирующей функции.  (Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5, № 1. С. 16–20.)

Ключевые слова: синдром задержки развития плода, цитокины, децидуальные макрофаги.

Беременность — физиологический процесс, во время которого действуют особые механизмы, регулирующие взаимоотношения между аллогенными организмами. Основные события, определяющие процессы формирования и роста плаценты, а также выполнения ее барьерной и трофической функций происходят в зоне разделения кровотока матери и плода — в децидуальной оболочке плаценты  (ДО)  [7]. Как показывают многочисленные исследования, главными действующими лицами во всех этих процессах выступают клетки иммунной системы, инфильтрирующие децидуальную ткань  [8]. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что нарушение процессов активации и дифференцировки клеток, продукции и рецепции цитокинов способствует развитию акушерской и перинатальной патологии  [18]. На экспериментальной модели синдрома задержки развития плода  (СЗРП) было показано наличие аккумуляции лейкоцитов в ткани матки  [14]. Данные ряда исследователей свидетельствуют об изменении продукции ряда ростовых и  провоспалительных цитокинов при СЗРП [10, 15]. Активными продуцентами цитокинов, регулирующих направленность иммунного ответа, являются макро  фаги  [5], однако данные о продукции цитокинов макрофагами ДО немногочисленны. В то же время децидуальные макрофаги не только обеспечивают барьерную функцию плаценты, но и продуцируют широкий спектр ростовых факторов, регулирующих процессы роста трофобласта, ангиогенеза и децидуализации эндо  метрия [6]. Целью проведенного исследования было определить особенности функциональной активности децидуальных макрофагов при СЗРП. Материалы и методы Материалом для исследования  служили плаценты, полученные в результате своевременных родов в сроке 38–40 недель гестации. Группу с физиологическим течением беременности (ФБ) составили 32 женщины с неосложненным течением беременности, родившие детей без перинатальной патологии, группу с СЗРП — 25 женщин, беременность которых не сопровождалась выраженной угрозой невынашивания и гестозом. Однако на момент обследования в  группе женщин с СЗРП в 36 % случаев отмечались признаки экстрагенитальной патологии в виде анемии I и II степени, в 68 % случаев — признаки  хронической внутриутробной  гипоксии плода, в 44 % — признаки фетоплацентарной недостаточности. Дети, родившиеся в данной  группе, имели признаки СЗРП I и II степени асимметричного типа (76 % и 24 %, соответственно). Плаценту получали в течение 10–15 мин после родов. Поверхность плаценты со стороны базальной пластинки омывали от крови большим количеством физиологического раствора  (ФР).  Децидуальная  ткань  срезалась  ножницами небольшими пластинами площадью до 3 см2, причем толщина срезаемого слоя не превышала 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержавшие 200 мл ФР, отмывали от крови и от клеток  трофобласта, перемешивая на магнитной мешалке в  течение 15 мин. Для получения экстрактов отмытые кусочки децидуальной ткани слегка подсушивали на фильтровальной бумаге и взвешивали. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному  гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани—1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали  замораживанию при –20 °С в  течение  суток.  Затем гомогенат размораживали и  ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об./мин при температуре +4 °С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и  хранили при –20 °С до проведения ИФА. Мононуклеарные клетки из ДО выделяли бесферментативным методом, путем  механического измельчения кусочков ткани ножницами до кашеобразного  состояния на часовом стекле. Затем полученную массу гомогенизировали в фарфоровой  ступке и помещали в  химические  стаканы  с 50–100 мл среды 199. Взвесь клеток перемешивали в  течение 15–20 мин при комнатной температуре на магнитной мешалке. При  этом большинство клеток лейкоцитарного инфильтрата вымывались из измельченной  ткани в  среду 199. Далее клетки фильтровали через 8  слоев плотной марли и осаждали центрифугированием при 1500 об./мин. Все выделенные клетки ресуспендировали в 6 мл среды 199, наслаивали на  градиент плотности фиколлаурографина  (d = 1,114  г/см3) и центрифугировали при 1500 об./мин 30 минут. Кольцо клеток на  границе фаз  среды 199 и фиколлаурографина  содержало чистую фракцию мононуклеарных  клеток децидуальной оболочки плаценты,  содержащую 25–35 % лимфоцитов, 60–70 % макрофагов и менее 5 % детрита. Полученные клетки отмывали центрифугированием при 1500 об./мин 10 минут и доводили средой 199 до концентрации 2 ? 106 в 1 мл. При помощи данного бесферментативного метода были получены 0,2–0,5 ? 106 клеток из 1 г децидуальной ткани. Внутриклеточную  экспрессию цитокинов оценивали методом проточной цитофлюориметрии на приборе  FACScan  (Becton Dickinson, USA)  с  использованием моноклональных  антител  ICO1 (антиHLADR),  ICO46  (антиCD45), ICO116  (антиCD16),  ICO174  (антиCD14),  ICOGM1  (антиCD11b) производства НПЦ «МедБиоСпектр» (Москва); анти IL1?, анти IL6, анти IL10, анти IL12  и  анти IFN?  фирмы «CALTAG  Laboratories»  (USA). Макрофагальный гейт строили по экспрессии антигенов CD14 и CD45. ИФА проводили на микропланшетном  ридере  Multiscan  EX, Labsystems  (Finland). Использовали тест-системы следующих фирм: IL1? и IFN? производства ООО «Цитокин» (С.Петербург); IL6, VEGF и EGF фирмы «CYTIMMUNE» (USA); IL10 и IL12р70 фирмы «DIACLONE» (France); PLGF фирмы «R&D Systems»  (USA); TGF?2  компании «Bender MedSystems»  (Austria);  эндотелин производства «BIOMEDICA»  (Austria). Статистическая обработка данных включала определение среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий рассчитывали по t критерию  Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Результаты исследований внутриклеточной эк  спрессии цитокинов макрофагами лейкоцитарного инфильтрата ДО и содержания цитокинов в экст  рактах децидуальной ткани представлены в табл. 1. Анализ данных внутриклеточной экспрессии цитокинов децидуальными макрофагами при ФБ показал, что большинство клеток продуцировали IL1?, IL6, IL12 и IFN?. Наименьшую популяцию составили IL10 позитивные макрофаги. При СЗРП мажорную популяцию составляли IL 6+ макрофаги, однако данный показатель не отличался от такового в контрольной  группе (p > 0,05). Внутриклеточная экспрессия  IL12 и IFN? децидуальными макрофагами при СЗРП была сопоставима друг с другом. Наименьший процент макрофагов при СЗРП составили IL10+  и IL1?+ клетки. Сравнительный анализ внутримакрофагальной экспрессии цитокинов в ДО при ФБ и при СЗРП показал, что характерной особенностью децидуальных макрофагов при СЗРП было достоверное снижение внутриклеточного синтеза  IL1?,  IL10,  IL12 (p < 0,001; p < 0,01; p < 0,05; p < 0,001, соответственно). Уровень  IFN?+ макрофагов в децидуальной оболочке плаценты при СЗРП не имел достоверных различий с показателем группы ФБ (p > 0,05).

Таким образом, при СЗРП нарушалась продукция децидуальными макрофагами основных провоспалительных цитокинов, кроме IL6. Одним из регуляторных цитокинов, способных подавлять

Таблица  1 Сравнительный анализ продукции цитокинов в ДО при ФБ и при СЗРП, по данным внутриклеточной экспрессии цитокинов макрофагами и по содержанию цитокинов в децидуальной ткани

 

Примечание. Достоверность различий между  группами ФБ и СЗРП: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** — p < 0,001.

синтез большинства провоспалительных цитокинов, является IL10  [2]. Однако ингибиция про  дукции цитокинов при СЗРП не может определяться высоким уровнем  IL10, т. к. продукция IL 10 макрофагами ДО была достоверно ниже, чем при ФБ. Отмеченное снижение продукции провоспалительных цитокинов макрофагами не может в полной мере определять общий характер изменений цитокинового профиля в децидуальной оболочке при СЗРП, т. к. известно, что продуцентами цитокинов могут быть и сами децидуальные клетки [6]. В связи с этим нами было проведено исследование содержания аналогичных цитокинов в экстрактах децидуальной ткани. Результаты сравнительного анализа показали, что изменения в содержании цитокинов в экстрактах децидуальной ткани в большинстве своем соответствовали таковым во внутриклеточном содержании цитокинов в макрофагах ДО. Для СЗРП было характерно достоверное снижение уровня  IL1?,  IL10 в экстрактах децидуальной ткани (p < 0,001; p < 0,01, соответственно) при одновременном повышении в них содер  жания IL 12 (p < 0,05) и отсутствии достоверных изменений в содержании IL6 и IFN? (p > 0,05 в обоих случаях), по сравнению с показателями при ФБ.

Таким образом, однонаправленность изменений внутриклеточного синтеза цитоки  нов макрофагами и содержания их в децидуальных экстрактах позволяет предположить, что уровень провоспалительных цитокинов и IL10 в ДО определяется сниженной синтетической активностью самих макрофагов лейкоцитарного инфильтрата. Некоторые из полученных нами результатов согласуются с данными других исследователей. Так, ранее было показано, что при СЗРП в децидуальной ткани снижается экспрессия мРНК IL10  [10]. Потомство мышей с дефектом локальной продукции  IL10 рождалось с признаками СЗРП [12]. Кроме того, задержка развития плода ассоциировалась со сниженной продукцией IL 10 моноцитами периферической крови [13], а введение мышам с неосложненной беременностью моноклональных антител к  IL10 приводило к раз  витию транзиторного СЗРП [16]. Отсутствие достоверных изменений в продукции  IL6, установленное нами при исследовании внутриклеточного содержания макрофагами ДО, и уровня цитокина в экстрактах децидуальной ткани хорошо согласуется с аналогичными данными по экспрессии мРНК IL6 в децидуальной ткани при СЗРП [10]. С другой стороны, в литературе имеются сведения об усилении экспрессии мРНК IL 6 в трофобласте плацент при СЗРП [10]. Наиболее высокие концентрации  IL 6 выявлены в зоне синцитиотрофобласта  [11]. В то же время, наши исследования показали, что при СЗРП клетки, продуцирующие  IL6, представляют самую многочисленную популяцию децидуальных макрофагов. Известно, что высокий уровень IL6 способствует поликлональной активации В лимфоцитов и развитию аутоиммунных реакций, способных приводить к повреждению тканей плаценты и плода [5]. Отсутствие достоверных различий в содержании IL6 в ДО при ФБ и при СЗРП может определяться необходимостью стабильной регуляции процессов созревания антителопродуцирующих клеток и самой продукции иммуноглобулинов, способствуя выполнению плацентой барьерной функции. Возможно, перераспределение относительного содержания макрофагов в сторону преобладания  IL6+ клеток в децидуальной ткани и высокий уровень цитокина в плодовой части плаценты являются одними из пусковых факторов аутоиммунных реакций отмечаемых различными авторами при СЗРП [9]. В работе Н.В. Астраух  [1] имеются данные об усилении системной и локальной продукции IL 1? при гестозе беременных. В работе M. Hahn Zoric et al.  [10] было отмечено, что уровень мРНК  IL 1? и IL1? в децидуальной оболочке значительно повышается в том случае, когда СЗРП развивается на фоне преэклампсии. Данных о корреляции между сниженным синтезом  IL 1? и состоянием плода при рождении в доступной нам литературе найдено не было. Однако известно, что IL1 оказывает непосредственное стимулирующее действие на процессы репликации клеток трофобласта [6]. В то же время, IL1 является основным цитокином, осуществляющим дистантное взаимодействие между иммунной и эндокринной системами. Среди метаболических изменений, наблюдающихся при СЗРП, наиболее важными являются нарушения углеводного и липидного обмена [4]. На экспериментальной модели было показано опосредованное через PGE2  стимулирующее действие IL1 на синтез глюкокортикоидных гормонов [4]. Особый интерес представляют противоречивые данные о содержании IL12 в экстрактах децидуальной ткани и во внутриклеточном содержании цитокина в макрофагах ДО. Можно предположить, что основная часть IL12 в децидуальной ткани синтезируется не макрофагами. Одна  ко в ДО плаценты нет иной значительной попу  ляции клеток, продуцирующих  IL12. Возможно, меньшая при СЗРП, по сравнению с показателями при ФБ, популяция IL12+ макрофагов осуществляет более интенсивный синтез данного цитокина. Кроме того, моноклональные антитела к IL12 позволяли нам определить IL12+ макрофаги, содер  жащие субъединицы  IL12p40 и  IL12р70, но не клетки, содержащие свободные IL12p35 структуры. В ИФА нами была установлена концентрация субъединицы IL12p70, которая, как известно, состоит из более мелких  субъединиц  IL12p40 и IL12p35, связанных дисульфидными связями, определяющими  активность цитокина. Таким образом, мы не учитывали свободные фракции IL12p40 и  IL12p35. Известно, что субъединица p40 не имеет биологической активности, но участвует в связывании с рецептором для IL12. Субъединица р35 необходима для  трансдукции сигнала. При сопоставлении данных, полученных двумя методами, можно предположить, что при ФБ повышен синтез  IL12p40 субъединицы  (по данным проточной цитометрии), в то время как при СЗРП, по данным ИФА, продукция макрофагами биологически активного IL12р70 значительно превышает физиологическую норму. Полученные нами данные об увеличении содержания IL12 в экстрактах ДО при СЗРП хорошо согласуются с отмеченным нами ранее повышением содержания NK клеток в лейкоцитарном инфильтрате ДО [17]. Общеизвестно, что IL12 является фактором дифференцировки NK клеток  [2]. Возможно, усиленная продукция в ДО биологически активного IL12 при СЗРП отражает активацию макрофагов слабопатогенными в норме микроорганизмами, например, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis, отмечавшуюся нами ранее [3]. В связи с этим встает вопрос о характере функциональной активности макрофагов при СЗРП. Изучение экспрессии функциональных молекул на клеточной поверхности децидуальных макрофа  гов показало, что при СЗРП нарушена экспрессия молекул, обеспечивающих межклеточное взаимо  действие децидуальных макрофагов с другими клетками иммунной системы и с клетками сосудистого эндотелия. Данные приведены в табл. 2. Следует отметить, что большинство децидуальных макрофагов как в норме, так и при СЗРП, экспрессировали на своей поверхности рецептор Fc?R III типа (СD16). Причем достоверных различий по содержанию СD16+ макрофагов в двух сравниваемых группах не отмечалось (p > 0,05). В то же время, в группе СЗРП децидуальные макрофаги характеризовались достоверно сниженной экспрессией антигенов MHC  II класса  (p < 0,05).

Таблица  2 Сравнительный анализ экспрессии CD16, CD11b и HLADR молекул на поверхности децидуальных макрофагов при ФБ и при СЗРП (% позитивных клеток)

 

Примечание. * — p < 0,05;

 Однако наиболее выраженным отличием децидуальных макрофагов при СЗРП было увеличение пула CD11b+ клеток (p < 0,01). Таким образом, для СЗРП характерно снижение антиген презентирующих свойств макрофагов и усиление их способности к адгезии к сосудистому эндотелию, при этом экспрессия поверхностных структур, обеспечивающих начальные этапы антителозависимого фагоцитоза, при СЗРП не изменяется. Следовательно, задержка развития плода в значительной степени коррелировала с изменением экспрессии молекул межклеточного взаимодействия. Наши данные соответствуют описанному ранее усилению экспрессии адгезионных молекул (CD11a и CD11b) на поверхности периферических нейтрофилов при СЗРП [14]. Проведенные нами исследования позволили выделить несколько основных форм нарушений функции макрофагов при СЗРП: снижение продукции провоспалительных  (IL1?) и регуляторных цитокинов (IL10); повышение концентрации IL12 в экстрактах децидуальной ткани; угнетение антиген презентирующей функции макрофагов; усиление адгезии к эндотелию сосудов.

Таким образом, при СЗРП в ДО плаценты наблюдается неадекватная активация децидуальных макрофагов, сопровождающаяся нарушением их синтетической и антиген презентирующей функции. Можно предположить, что нарушение функции макрофагальных клеток играет важную роль в нарушении развития плода.

ЛИТЕРАТУРА

1. Астраух Н.В. Особенности фенотипа и цитокинового профиля децидуальных лимфоидных клеток при гестозе. — Дисс. … канд. мед. наук. — Иваново. — 2002. — 157 с.

2. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Хорева М.В., Соколова Е.В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. — М.: РГМУ, 2001. — 20 с.

3. Кудряшова А.В., Сотникова Н.Ю., Веденеева М.В., Панова И.А. Особенности дифференцировки и активации Т хелперов децидуальной оболочки плаценты при  синдроме  задержки развития плода  (СЗРП)  // Russ.  J. Immunol. — 2004. — Vol. 9, № 1. — P. 318.

4.  Медведев М.В., Юдина Е.В. Задержка внутриутробного развития плода. — М.: РАВУЗДПГ, 1998. — 208 с.

5. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб: Наука, 2001. — Т. 1. — 231 с.

6. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. — Екатеринбург: УрО РАН, 2002. — Т. 2. — 379 с.

7. Billington W.D. The nature and possible functions of MHC antigens on the surface of human  trophoblast.  In: Reproductive  Immunology  (Ed. by S.K. Gupta). — Narosa Publishing House, New Delhi. — 1999. — P. 71–77.

8. Chernyshov V.P., Slukvin I.I., Bondarenko G.I. Phenotypic characterization of CD7+ , CD3+  and CD8+  lymphocytes from first trimester human decidua using twocolor flow cytometry // Am. J. Reprod. Immunol. — 1993. — Vol. 29, № 1. — P. 5–16.

9. D’Anna R., Scilipoti A.,  Leonardi  J. et al. Annticardiolipin antibodies  in preeclampsia and intrauterine growth reyardation // Clin. Exp. Obstet. Gy necol. — 1997. — Vol. 24, № 3. — P. 135–137.

10. Hahn Zoric M., Hagberg H., Kjellmer I. et al. Aberrations in placental cytokine mRNA related to intrauterine growth retardation // Pediatr. Res. — 2002. — Vol. 51, № 2. — P. 201–206.

11. Kameda T., Matsuzaki N., Sawai K. et al. Production of interleukin 6 by normal human trophoblast // Placenta. — 1990. — Vol. 11. — P. 203–213.

12. Lohler K.R., Rennick D., Rajewsky K., Muller W. Interleukin 10 deficient mice develop chronic enterocolitis // Cell. — 1993. — Vol. 75. — P. 263–274.

13.  Marzi M., Vigano A., Trabattoni D. et al. Characterization of type 1 and type 2 cytokine production profile  in physiologic and pathologic human pregnancy // Clin. Exp. Immunol. — 1996. — Vol. 106. — P. 127–133.

14. Miyakoshi K.,  Ishimoto H., Nishimura O. et al. Role of  leukocytes  in uterine hypoperfusion and  fetal growth  retardation  induced by  ischemiareperfusion // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. — 2001. — Vol. 280. — P. 1215–1221.

15. Reid G.J.,  Flozak A.S., Simmons R.A. Placental expression of  insulin like growth  factor  receptor 1 and  insulin  receptor  in  the growth restricted  fetal rat // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2002. Vol. 9, № 4. — P. 210–214.

16. Rijhhsinghani A.G., Thompson K., Tygrette  L., Bhatia S.K.  Inhibition of  interleukine 10 during pregnancy results in neonatal growth retardation // Am. J. Reprod. Immunol. — 1997. — Vol. 37, № 3. — P. 232–235.

17.Sotnikova N.Yu., Kudryashova A.V., Vedeneeva M.V., Panova  I.A.  Systemic and local mechanisms of immunoregulation in normal and IUGR pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. — 2004. — Vol. 51, № 6. — P. 468.

18. Wegmann T.G. Maternal T cells promote placental growth and prevent sponta neous abortion // Immunol. Let. — 1988. — Vol. 17. — P. 297–302.

Cytokine production by decidual macrophages in uncomplicated pregnancy and intrauterine growth retardation N.Yu. Sotnikova, A.V. Kudryashova, N.V. Kroshkina, I.A. Panova, M.V. Vedeneeva, Yu.V. Gagaeva V.N. Gorodkov State Research Institute of Maternity and Childhood, Ivanovo

Flow cytometry evaluation of cytokine intracellular expression showed the decrease of intracellular IL1?, IL10, IL12 synthesis by decidual macrophages in intrauterine growth retardation (IUGR) pregnancy. IUGR was accompanied by significant decrease of IL1?,  IL10  levels and  increase of  IL#12 concentration  in ex# tracts of decidual  tissue. Decidual macrophages  in  IUGR pregnancy were  characterized by diminished MHC antigens expression and elevation of CD11b+  pool of cells. Thus, inadequate activation of decidual macrophages associated with  impairment of cytokine synthesis and antigen presenting  function, was seen in IUGR pregnancy. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 1. P. 16–20.)

Key words:  intrauterine growth  retardation, cytokines, decidual macrophages.



загрузка...