загрузка...
 
П.Г. Назаров, И.Б. Крылова, Н.Р. Евдокимова, Г.И. Нежинская, А.А. Бутюгов ГУ НИИ  экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург С реактивный белок: фактор воспаления, связывающий и инактивирующий ацетилхолин
Повернутись до змісту

П.Г. Назаров, И.Б. Крылова, Н.Р. Евдокимова, Г.И. Нежинская, А.А. Бутюгов ГУ НИИ  экспериментальной медицины РАМН, Санкт Петербург С реактивный белок: фактор воспаления, связывающий и инактивирующий ацетилхолин

С реактивный белок (CRP), маркер воспаления и защитный фактор врожденного иммунитета, связывает фосфорилхолин (ФХ) и ФХ содержащие вещества. Основываясь на структурном сходстве между ФХ и ацетилхолином (АХ), исследовали способность очищенного CRP человека связывать АХ, влиять на его физиологическую активность и расщепление ацетилхолинэстеразой. Результаты показали, что CRP связывает АХ. У крыс CRP значительно снижал сердечно сосудистую реакцию на введение АХ, а in vitro связывал АХ и защищал от гидролиза ферментом. Влияние CRP на сердечно сосудистую систему может реализоваться через АХ зависимые механизмы. (Цитокины и воспаление. 2006.  Т. 5, № 4. С. 32–35.)

Ключевые  слова:  Среактивный белок, пентраксины, врожденный иммунитет, ацетилхолин.

Пентраксины — это семейство гомологичных белков человека и животных, состоящих из пяти субъединиц и связывающих определенные лиганды. Такие пентраксины, как С реактивный белок (CRP) и сывороточный P компонент амилоида (SAP), являются маркерами острой фазы воспаления и играют защитную роль в реакциях врожденного иммунитета. Одна из функций CRP состоит в связывании и поврежденных и вредных продуктов— компонентов клеточного детрита, нуклеопротеинов, бактериальных токсинов, модифицированных липопротеинов [1–3]. Основными лигандами CRP и SAP являются фосфорилхолин (ФХ) и ФХ содержащие соединения. После связывания с пентраксином они разрущаются комплементом и элиминируются путем фагоцитоза. ФХ структурно сходен с ацетилхолином (АХ), парасимпатическим нейромедиатором: оба вещества имеют холиновое ядро, соединенное с фосфатом или ацетатом. Несмотря на сходство ФХ и АХ, в литературе нет работ, касающихся сродства пентраксинов к АХ. АХ не упоминался среди лигандов CRP. Вместе с тем, некоторые фосфолипиды (лизофосфатидилхолин, сфингозин, лизо"тромбоцитактивирующий фактор (lyso PAF)) проявляют холинолитическиую активность, т. е. связываются с ацетилхолиновыми рецепторами  (АХР) и конкурируют с АХ, блокируя его физиологическую активность [9, 15]. В литературе обсуждается патогенетическая роль CRP в развитии сердечно сосудистой тромбоэмболической патологии. Считают, что CRP— фактор атерогенеза, способствующий формированию атеросклеротических бляшек и развитию тромбозов [11]. У лиц с повышенным уровнем CRP снижен сосудистый ответ на инфузию АХ  [5]. Можно допустить, что CRP способен связывать АХ и ограничивать его влияние на сердечно сосудистую систему.

Цель работы—исследовать, влияет ли CRP на физиологическую активность АХ  in vivo и, если да, то каким путем. Проведены следующие исследования:

1) опыты на животных по выяснению влияния CRP на основные виды активности АХ— способность понижать артериальное давление и вызывать брадикардию;

2) опыты  in vitro по выяснению связывания АХ с CRP с оценкой защиты АХ от разрушения ацетил холинэстеразой и с оценкой электрофоретической подвижности комплексов CRP АХ.

Материалы и методы

Использовали препараты  следующих фирм: ацетилхолин хлорид (АХ)—Казанского химфармзавода; очищенный С реактивный белок человека (CRP)—ICN (USA) и RDI (USA); аденозин  (Адо) и ацетил холинэстеразу  (АХЭ;  EC 3.1.1.7)—ICN (USA); нормальный гаммаглобулин человека (IgG)—НИИЭМ им. Пастера (Санкт Петербург); фосфорилхолин хлорид (ФХ)— Sigma  (USA); пневмококковый  С полисахарид — Reanal (Hungary); реагенты для метода Хестрина и электрофореза в геле агарозы  (гидроксиламин,  FeCl3, HCl, NaOH, дитионитробензойная кислота, маркеры молекулярной массы и др.)— ICN (USA), Helicon (USA) и «Вектон» (Санкт Петербург). Животные и схема опытов. Опыты проведены на крысах самцах Wistar (Питомник РАМН «Рапполово», СанктПетербург), массой 280–330 г (в возрасте 7 нед.), под внутрибрюшинным наркозом этаминалом натрия (50 мг/кг массы тела, растворитель—забуференный физиологический раствор NaCl (ЗФР)). Вводили 2 катетера: один в бедренную артерию для регистрации артериального давления (АД), другой в бедренную вену для введения препаратов. После 30минутного  стабилизационного периода получали ответ на  гипотензивные агенты— АХ и Адо.  Гипотензивный ответ оценивали по процентному снижению АД по сравнению с индивидуальным фоновым АД. Влияние препаратов на сердечный ритм оценивали по частоте сердцебиений—по максимальному изменению длины интервала RR на  электрокардиограмме  (ЭКГ) во втором отведении при скорости записи 50 мм/сек на приборе ЭК1Т03М2. Как известно, АД и интервал RR нормализуются после введения АХ без десенсибилизации рецепторов, не влияя на  характер  сердечно сосудистой реакции на повторное введение АХ. Это определило схему опытов. Каждая крыса получала две инъекции вазорелаксанта с интервалом 20 мин. После 1 й инъекции регистрировали исходную  сердечно сосудистую реакцию; через 20 мин вводили тот же релаксант повторно, в той же дозе, но  теперь в виде  смеси  с  CRP,  IgG или ЗФР, и снова регистрировали  сердечно сосудистую реакцию. Минимальные эффективные дозы АХ и Адо были подобраны в предварительных опытах: оба препарата вводили по 2,5 мкг/кг в 0,1 мл ЗФР.

Группы животных:

1) 1 я инъекция — АХ, 2я — АХ,  смешанный и инкубированный в  течение 15 мин при комнатной температуре с 0,1 мл ЗФР (контроль) либо с 0,3 мл CRP (650 мкг/мл);

2) 1 я инъекция—АХ, 2я—АХ, смешанный и инкубированный, как указано выше, с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл);

3) 1 я — Адо, 2 я — А до в смеси с 0,1 мл ЗФРлибо  с 0,3 мл CRP  (650 мкг/мл);

4) 1 я инъекция — Адо, 2 я—А до в смеси с IgG человека (0,3 мл, 650 мкг/мл).

При расчете дозы CRP, вводимого животным, за основу был принят известный факт, что молекула CRP связывает 5 молекул ФХ. В случае введения смеси АХ с CRP крысы получали по 2 нМ CRP и по 5 нМ АХ. Это соответствовало молярному отношению CRP к АХ 1:2,5 и 2 кратному молярному избытку ФХсвязывающих сайтов CRP над АХ. Оценку  гидролиза АХ ацетилхолинэстеразой  (АХЭ) в присутствии CRP или IgG проводили гидроксиламиновой реакцией Хестрина [7] с регистрацией на ридере SpektraIII (Austria) при 570 нм. Рабочая концентрация АХЭ  составляла 1 мг/мл. Электрофорез в геле агарозы проводили без додецил сульфата натрия. CRP, АХ, ФХ, Cполисахарид и АХЭ растворяли в растворе Хэнкса,  содержащем ионы кальция. Статистическая обработка данных. Данные представлены в виде  средних арифметических  (М) и ошибок  средних (SEM). Различия между группами оценивали с помощью tкритерия  Стьюдента.

Результаты и обсуждение

CRP ингибирует ответ на АХ  in vivo. Через 10– 15 мин после введения АХ у крыс наблюдалось падение АД на 50 % по сравнению с фоном (табл. 1) с возвратом к исходному уровню в течение 60 сек. Наблюдалось также временное замедление частоты сердцебиений: через 5 сек после введения АХ интервал R R возрастал в 2,5 раза и через 15 сек возвращался к исходному. Повторная инъекция АХ после 20 минутного перерыва вызывала такие же изменения величины АД и интервала R"R, как 1"я инъекция. Введение АХ, предварительно смешанного и инкубированного с CRP, приводило к заметному ослаблению  (на 33 %) гипотензивного эффекта АХ. У крыс, получивших смесь АХ с CRP, уровень АД снижался достоверно меньше, чем у крыс, получивших АХ+ЗФР  (p < 0,05), или чем у крыс другой контрольной  группы, получивших АХ, смешанный с другим  гетерологичным белком  (IgG) (табл. 1). Гипотензивный ответ на АХ у животных, получивших смесь АХ с IgG, не отличалсяот  животных  контрольной  группы, получивших АХ в смеси с ЗФР (см. табл. 1). Иные  результаты были получены с Адо в качестве вазорелаксанта (табл. 2). В смеси с CRP Адо вызывал такое же снижение АД, как и в смеси с ЗФР (p > 0,05), т. е. в случае Адо индуцированной вазорелаксации CRP не оказывал влияния. Таким образом, CRP не уменьшал эндотелий

Таблица  1 Артериальное давление и интервал RR у крыс, получивших смесь ацетилхолина с С реактивным белком или IgG

 

 

Таблица  3 С реактивный белок ингибирует разрушение ацетилхолина ацетилхолинэстеразой (% гидролиза АХ)

 

Примечание. Представлены M±SEM  четырех опытов. * — достоверно отличается от влияния  соответствующей дозы  IgG  (p < 0,05).

 

Рисунок. Электрофорез  смесей  CRP  с  ацетилхолином, пневмококковым  Сполисахаридом и  ацетилхолинэстеразой Дорожки: 1 —  смесь CRP+АХ; 2, 3 — CRP; 4 —  смесь CRP+пневмококковый Cполисахарид); 5, 6 — смесь CRP+АХЭ; 7 — АХЭ; 8 — маркеры молекулярной массы (указана мол. масса в кДа).

независимый  гипотензивный эффект. Эффект смеси Адо+IgG также не отличался от эффекта контрольной смеси Адо+ЗФР  (см. табл. 2, p > 0,05). Влияние АХ и Адо на сердечный ритм оценивали по длине интервала RR на ЭКГ (см. табл. 1, 2). Оба агента вызывали достоверное удлинение интервала RR. Добавление CRP к АХ существенно  влияло  надлину  интервала  RR  по  сравнению  со  смесью АХ+ЗФР  (см. табл. 2, p < 0,05): CRP почти полностью отменял влияние АХ на сердечный ритм; АХ в смеси с CRP практически не влиял на частоту сердцебиений. Cовершенно иные результаты получены с Адо. Вызываемое этим эндотелий независимым вазорелаксантом удлинение интервала R R было нечувствительно к модуляции С реактивным белком (см. табл. 2); различие между  группами «Адо+CRP» и «Адо+ЗФР» было недостоверным (p > 0,05). CRP ингибирует  гидролиз АХ ферментом АХЭ  in vitro. Человеческий CRP дозозависимо угнетал расщепление АХ ферментом АХЭ  (достоверно при концентрациях CRP 1,5 и 0,75 мг/мл—p<0,05, табл. 3). В отличие от CRP, IgG в таких же концентрациях не угнетал расщепление АХ (см. табл. 3). CRP не взаимодействует с АХЭ. Электрофоретическая подвижность CRP, смешанного с АХ, была такой же, как у CRP, смешанного с ЗФР (рисунок). Низкомолекулярный АХ не изменял заряда и подвижности CRP. В случае смеси CRP с АХЭ оба компонента мигрировали независимо, с такими же скоростями, как на контрольных дорожках, где их наносили по отдельности. Таким образом, CRP не взаимодействует с ферментом АХЭ. В то же время, контрольная дорожка (рис., дорожка № 4,) показывает, что подвижность CRP заметно изменялась при смешивании с известным ФХ содержащим лигандом (пневмококковым С полисахаридом). Данные электрофореза указывают на то, что CRP не взаимодействует с АХЭ. Следовательно, ингибирующий эффект CRP в отношении расщепления АХ ферментом АХЭ является результатом связывания пентраксина с нейромедиатором.

Заключение

Результаты исследования влияния CRP на два основных эффекта АХ in vivo—гипотензивный и брадикардический—впервые показали, что CRP ингибирует биологическую активность АХ. Оба эффекта АХ достоверно подавляются пентраксином. Как известно, медиатором сосудорасширяющего действия обоих релаксантов—АХ и Адо—является оксид азота, хотя АХ и Адо действуют че"рез разные мембранные рецепторы  [10, 12]. Ингибирующий эффект CRP проявлялся только в отношении АХ, но не в отношении Адо, следовательно, CRP влияет не на генерацию NO, а на АХ зависимые механизмы активации АХР. Одним из доказанных нами механизмов ингибирующего эффекта CRP в отношении АХ является связывание АХ как лиганда. CRP блокировал АХ и затруднял его атаку ферментом АХЭ. По этой причине пентраксин должен предотвращать взаимодействие АХ и с клеточными АХР, что, вероятно, и является причиной наблюдаемого смягчения или отмены влияния АХ на клеточные функции  in vivo. Таким образом, наши данные показали, что АХ является лигандом CRP. Нельзя, исключить ингибирующего влияния CRP на физиологию клеток и другими путями, на" пример, путем воздействия CRP непосредственно на АХР или другие рецепторы. Этот вопрос требует изучения. Способность CRP связывать и нейтрализовать АХ может оказывать влияние на процессы, протекающие с участием АХ в разных регуляторных компартментах организма. Роль CRP может быть актуальна как для системы парасимпатической нервной регуляции, так и за ее пределами, в частности для автономной регуляции в рамках иммунной системы, где АХ действует как внутренний фактор, синтезируемый лимфоидными клетками [8, 13, 14].

Таким образом, наши данные указывают на существование новой линии взаимодействий между воспалением (с CRP в качестве фактора) и холинергической регуляцией. Одним из механизмов влияния С реактивного белка на эндотелий является АХ зависимый путь. Синтез в печени и массивный выброс CRP связаны с воспалением, что, на первый взгляд, огра" ничивает влияние пентраксина на функции АХ острой фазой воспаления. Однако показано, что CRP продуцируется не только  гепатоцитами при системном воспалении, но и клетками иммунной системы при их активации  [4, 6]. Локально синтезированный CRP может участвовать в регуляции местных иммунологических процессов, управляемых вненейрональным АХ, также имеющим лимфоидное происхождение. Характер взаимодействий между CRP и АХ, их физиологические последствия и роль в регуляции реакций врожденного иммунитета требует дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Назаров П.Г. Реактанты острой фазы воспаления. — СПб.: Наука, 2001. — 423  с.

2. Назаров П.Г., Берестовая Л.К. Ингибирующее действие Среактивного белка (СРБ) на гемолитическую активность стрептолизина О. Сравнение конформационных вариантов СРБ // Бюл. эксперим. биол. мед. — 1995. — Т. 119, № 5. — С. 506–509.

3. Назаров П.Г., Берестовая Л.К. Нейтрализующая активность Среактивного белка в отношении порообразующих цитотоксинов бактериального происхождения // Докл. РАН. — 1995. — Т. 343, № 1. — С. 123–126.

4. Назаров П.Г., Софронов Б.Н. Синтез Среактивного белка лимфоидными клетками // Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике. — М., 1983. — С. 112–113.

5. Fichtlscherer S., Breuer S., Zeiher A.M. Prognostic value of systemic endothelial dysfunction in patients with acute coronary syndromes: further evidence for the existence of the «vulnerable» patient // Circulation. — 2004. — Vol. 110, № 14. — P. 1926–1932.

6. Ikuta T., Okubo H., Ishibashi H. et al. Human lymphocytes synthesize Creactive protein  //  Inflammation. — 1986. — Vol. 10, № 3. — P. 223–232.

7. Kao G., Tsai C.M. Quantification of  Oacetyl,  Nacetyl and phosphate groups and determination of the extent of Oacetylation in bacterial vac cine polysaccharides by highperformance anionexchange chromatography with conductivity detection (HPAECCD) // Vaccine. — 2004. — Vol. 22. — P. 335–344.

8. Kirkpatrick C.J., Bittinger  F., Nozadze K., Wessler  I. Expression and  function of  the nonneuronal  cholinergic  system  in endothelial  cells  //  Life Sci. — 2003. — Vol. 72. — P. 2111–2116.

9. Mangin E.L., Kugiyama K., Nguy J.H. et al. Effects of  lysolipids and oxidatively modified low density lipoprotein on endotheliumdependent relaxation of rabbit aorta // Circulation res. — 1993. — Vol. 72, № 1. — P. 161–166.

10. Murad F. The nitric oxidecyclic GMP signal transduction system for intracellular and intercellular communication // Recent Prog. Horm. Res. — 1994. — Vol. 49. — P. 239–248.

11. Verhamme P., Quarck R., Hao H. et al. Dietary cholesterol withdrawal reduces vascular inflammation and induces coronary plaque stabilization in miniature pigs // Cardiovasc. Res. — 2002. — Vol. 56, № 1. — P. 135–144.

12. Wang Y.X., Poon C.I., Poon K.S., Pang C.C. .  Inhibitory actions of diphenyleneiodonium on endotheliumdependent  vasodilatations  in  vitro and  in  vivo // Br. J. Pharmacol. — 1993. — Vol. 110, № 3. — P. 1232–1238.

13. Wessler  I., Kilbinger H., Bittinger F. et al. The nonneuronal cholinergic sys tem  in humans: Expression,  function and pathophysiology  //  Life Sci. — 2003. — Vol. 72. — P. 2055–2061.

14. Wessler I.K., Kirkpatrick C.J. The nonneuronal cholinergic system: an emerg ing drug target in the airways // Pulm. Pharmacol. Therapeutics. — 2001. — Vol. 14. — P. 423–434.

15. Zvezdina N.D., Prokasova N.V., Vaver V.A. et al. Effect of lysolecithin and leci thin of blood serum on the sensitivity of heart to acetylcholine // Biochem. Pharmacol. — 1978. — Vol. 27, № 24. — P. 2793–801.

C reactive protein: a factor of inflammation binding and inactivating acetylcholine P.G. Nazarov, I.B. Krylova, N.R. Evdokimova, G.I. Nezhinskaya, A.A. Butyugov Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg C reactive protein (CRP), a marker of inflammation and factor of innate immunity, binds phosphorylcholine (PC) and PC containing compounds. Based on structural similarity between PC and acetylcholine (ACh) we investigated  the ability of purified human CRP  to bind ACh and  influence  its physiological activity and susceptibility to breakdown with acetylcholinesterase (AChE). The results showed that CRP binds ACh. CRP significantly lowered the cardio vascular response of rats to ACh infusion and protected ACh from hydrolysis by AChE in vitro. It is suggested that CRP effects on cardio vascular system in vivo is mediated through ACh dependent mechanisms. (Cytokines and Inflammation. 2006. Vol. 5, № 4. P. 32-35.)

Key words: Creactive protein, pentraxins, innate immunity, acetylcholine.



загрузка...