Индукция антител к IFN? и IL-4 у мышей иммунизацией пептидами, воспроизводящими иммунодоминантные В-эпитопы С.В. Шевелев, А.Н. Митин, С.М. Андреев, А.А. Ярилин Институт иммунологии ФМБА РФ, г. Москва

Индукция антител к IFN? и IL-4 у мышей иммунизацией пептидами, воспроизводящими иммунодоминантные В-эпитопы С.В. Шевелев, А.Н. Митин, С.М. Андреев, А.А. Ярилин Институт иммунологии ФМБА РФ, г. Москва

С помощью комплекса компьютерных программ рассчитаны иммунодоминантные В-эпитопы молекул IFNy и IL-4 мыши. Синтезированы пептиды, соответствующие по аминокислотной последовательности некоторым из этих эпитопов — 99-113 из IFNy, 21-40 и 60-70 из IL-4. Коньюгатами

названных пептидов с гемоцианином иммунизировали мышей. Практически у всех мышей при этом индуцировались антитела, реагирующие, по данным иммуноферментного анализа, с пептидами 99-113 из IFNy и 21-40 из IL-4; использование для иммунизации пептида 21-40 оказалось менее эффективным. При иммунизации пептидом из IFNy антитела, реагирующие с целой молекулой цитокина, индуцированы у 10 из 12 мышей, при иммунизации пептидом из IL-4 — у половины мышей. Активность антител по отношению к целой молекуле цитокина и его фрагменту, использованному для иммунизации, коррелировала. Антитела сохранялись в циркуляции мышей на достаточно высоком уровне активности в течение месяца и долее. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 23-27.)

Ключевые слова: интерферон у, интерлейкин-4, антитела, пептиды.

В настоящее время широко разрабатываются методы антицитокиновой терапии, направлен­ные на лечение заболеваний, патогенетическим фактором которых является усиление выработки тех или иных цитокинов или их дисбаланс [1, 2]. Потенциальной областью применения подходов, основанных на связывании цитокинов или ингибировании их активности, являются заболевания, в развитии которых важная роль принадлежит дисбалансу Th1- и ТЬ2-клеток [5], в частности, аллергических заболеваний, при которых прева­лирует активность №2-клеток и продуцируемых ими цитокинов [3, 6]. Одним из возможных путей поисков в данном направлении является индукция эндогенных антител к ключевым цитокинам Th1- и №2-клеток.

В данной работе представлены результаты экспериментов по индукции антител к цитокинам путем иммунизации их пептидными фрагмен­тами. Использование пептидов вместо целых молекул цитокинов продиктовано стремлением не нарушать цитокиновый баланс организма в процессе иммунизации, а также избежать побоч­ных токсических эффектов цитокинов.

Материалы и методы

Для предсказания четвертичной структуры белков и расчета иммунодоминантных В-эпитопов использованы компьютерные программы Peptide Companion v. 1.231, A3-D Viewer for National Cen­ter for Biotechnology Information Databases Ver­sion 3.0 и Swiss-Pdb Viewer v.3.7b2. При этом учи­тывались следующие параметры: гидрофобность, «доступность больших сфер», гидропатичность и локализация сгибов ?-слоев, отсутствие сайтов гликозилирования, наличие в структуре остатков ароматических аминокислот [4]. Основанием для определения локализации эпитопа являлось сов­падение на определенном участке полипептидной цепи всех или большинства этих свойств.

Индукция антител к IFNy и IL-4 пептидами

В твердофазном синтезе пептида использовали стартовый Fmoc-Asn(Trt)-полимер (смола Wang от NovaBiochem, 0,44 ммоль/г) и производные аминокислот, где гидроксильные и карбоксильные группы защищались трет-бутильной группой (t- Bu), амидные функции — Trt, є-аминогруппа ли­зина — Boc, гуанидиновая группа аргинина — Mtr. Стандартный цикл включал промывку смолы диметилформамидом (ДМФ), удаление Fmoc-защиты (20 % пиперидин в ДМФ), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (DCC/HOBt) и конденсацию в среде ДМФ/^метилпирролидон при 4-кратном избытке карбоксильного компонен­та (~1,5 часа). Контроль за полнотой реакции прово­дили нингидриновым методом и при необходимости реакцию конденсации повторяли. Промежуточные пептиды анализировали на аминокислотном ана­лизаторе (Biotronik L5001). Отщепление пептида от смолы проводили трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (тиоанизол, этан- дитиол, фенол), пептид осаждали сухим серным эфиром, экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизировали.

Первичную очистку пептида проводили дву­кратной гель-хроматографией на смоле Toyopearl HW40 (колонка: 2,5 х 78 см, элюент — 0,1 % рас­твор NH3, 60 мл/час; детектор LKB Uvicord SII, 254 нм). Сырую фракцию, идентифицированную по данным аминокислотного анализа, очища­ли градиентной ВЭЖХ (система Gilson/Data system, детектор Spectroflow 57 при 254 нм, интегратор Shimadzu C-R3A) с использовани­ем колонки с Zorbax ODS 0,94 х 25 см («DuPont Сhromatography»). Дальнейший анализ прово­дили с помощью аналитической ВЭЖХ (Vydec C18, 0,4 х 25 см) в тех же условиях.

Для получения конLюгата пептидного фраг­мента мышиного IFNy с гемоцианином улитки (KLH, «Calbiochem», USA) 5 мг пептида (м^-4 60-70) растворяли в 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 9,0) и раствор смешивали с 800 мкл раствора 12,5 мг KLH в ФБ. Смесь перемешивали 30 мин и охлаждали до 4 °С. Добавляли 1,5 мкл охлажденого до 4 °С раствора глутарового аль­дегида («Serva», Germany) в 250 мкл фосфатного буфера; реакционную смесь перемешивали 1 час и оставляли на 22 часа при 4 °С. Затем добавля­ли охлажденный раствор 10 мг NaBH4 («Sigma», USA) в 400 мкл дистиллированной воды и остав­ляли на 1 час при комнатной температуре. Все содержимое переносили в диализную трубку (Servapore, 16 мм) и проводили исчерпывающий диализ против дистиллированной воды. Получен­ный диализат замораживали и лиофилизовали. Выход составлял 15,5 мг белого порошка, содер­жание пептида около 250 мкг/мг конъюгата.

Для иммунизации использованы мыши линии BALB/c и гибриды ^BA х С57В!/6Щ массой

20-22 г, полученные из питомника РАМН «Стол­бовая» и содержавшиеся на обычном пищевом рационе. Для индукции антител к цитокинам

мыши в качестве иммуногенов использовали их пептидные фрагменты (пептид 99-113 из IFNy мыши и пептиды 21-40 и 60-70 из IL-4 мыши) или

их коньюгаты с гемоцианином в дозе 30 мкг на мышь (в пересчете на пептид). Иммуногены вво­дили внутримышечно трехкратно с интервалом в 1 мес.; первое введение антигена осуществляли в полном, два следующие — в неполном адLюванте Фрейнда. Мышам контрольной группы вводили соответствующий адьювант без иммуногена в те же сроки, в которые иммунизировали животных из группы опыта.

Антитела к пептидам или целой молекуле IL-4 определяли в сыворотке крови мышей с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для постановки реакции использовали 96-луночные планшеты Titertek (Finland). На поверхности лунок общепринятым методом фиксировали антиген (IL-4, IFNy или их пеп­тидные фрагменты); для этого добавляли 100 мкг раствора соответствующих пептидов или белка в концентрации 10 мкг/мл на 40 мМ карбонат- бикарбонатном буфере, рН 8,3. Затем в лунки добавляли 100 мкл сыворотки крови в серийных разведениях (обычно двукратных, начиная с 1:100) на фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), рН 7,4. После инкубации и отмывания в лунки вносили 100 мкг коньюгата козьих антител к IgG мыши с пероксидазой на ФСБР. Ставили цветную реакцию на пероксидазу с о-фениленди- амином. Интенсивность окрашивания оценивали на ИФА-ридере (MultiskanEX «Labsystems», Finland) при длине волны 492 нм. Как правило, оценивали 3 показателя: оптическую плотность (ОП) в ИФА при разведении сывороток 1:100, титр антител (последнее разведение, при котором ОП превышала 0,25) и долю животных, сыворот­ка которых содержала антитела с этим уровнем связывания лигандов.

Результаты обрабатывали методами вариаци­онной статистики с использованием программы Microsoft Excel; вычисляли критерий t Стьюдента и коэффициент корреляции.

Результаты и обсуждение

С помощью подходов, описанных в разделе «Ма­териалы и методы», определили локализацию имму- нодоминантных В-клеточных эпитопов в молекулах IFNy и IL-4 мыши. В качестве таковых были квали­фицированы в молекуле IFNy участки 76-86, 99-113 и 142-150, в молекуле IL-4 — участки 21-40, 60-70 и 90-105 (указана последовательность для процесси- рованных молекул). Были синтезированы пептидный фрагмент IFNy99-113 (последовательность остатков- KFEVN- NPQVQRQAFN), а также фрагменты IL-4 21-40 (TGEGT-PCTEMDVPNVL-TATK) и 60-70 (LKH-GKTPCLKK). В таблице представлены результаты иммунизации двумя из трех использованных пептидов. Через 8-10 сут. после одного цикла трехкратной иммунизации мышей-гибридов (CBA х C57Bl/6)F1 коньюгатом пептида 99-113 из IFNy с гемоцианином антитела, связывающие свободный пептид 99-113, обнаружены у 11 из 12 иммунизированных мышей. При разведении сыворотки 1:100  оптическая плотность (ОП) составляла в среднем 1,92 ± 0,09 условных единиц. У двух из пяти контрольных мышей, которым вводили адьювант Фрейнда, определялась слабая связывающая способность с ОП около 0,3. Сыворотки мышей, которым вводили физиологический раствор, не связывали пептид. При оценке связывающей способности сывороток по отношению к целой молекуле мышиного IFNy установлено, что она определяется у 10 из 12 иммунизированных мышей, но ОП при этом была в 2 раза ниже, чем при оценке связывания с пептидом (0,90 ± 0,08). Способность связывать целую молекулу IFNy выявляется при разведении сывороток в 100-400 раз (средний титр 1:380). Принципиально сходные результаты были получены при иммунизации пептидом 99-113 мышей BALB/c; в этом случае образование антител, реагирующих с целой молекулой IFNy, наблюдалось у всех 12 мышей. Иммунизация пептидом 60-70 не привела к желаемым результатам: из 8 иммунизированных мышей лишь у двух определялись антипептидные антитела, взаимодействующие с пептидом в ИФА с уровнем ОП выше 0,25. Слабо выраженная избирательность связывания целой молекулы IL-4 наблюдалась только в одном случае. Иммунизация пептидом 21-40 была более успешной, однако для получения эффективного ответа потребовалась смена линии мышей на BALB/c и проведение двух циклов иммунизации, разделенных интервалом в 6 мес. В таблице и на рисунке представлены результаты тестирования сывороток после второго цикла иммунизации.

Таблица Характеристика антител в сыворотке мышей, иммунизированных пептидными фрагментами IFNy (99-113) и IL-4 21-40

 

Примечание.

* — отреагировавшими считались мыши, при взаимодействии сыворотки которых в ИФА с лигандом оптическая плотность превышала 0,25; ** — р<0,05 (по сравнению с контролем).

После первого цикла иммунизации коньюгатом пептида с гемоцианином антитела с уровнем связывания пептида, превышающим заданный порог (ОП > 0,25), обнару­жены у всех иммунизированных животных. Однако уровень связывания с пептидом был невысок (ОП при разведении 1:100 сывороток составлял в сред­нем 0,84). Способность связывать целую молекулу IL-4 после первого цикла иммунизации обнаружена у сывороток половины иммунизированных мышей. После второго цикла иммунизации конLюгатом пептида с гемоцианином была выявлена более вы­сокая способность сывороток взаимодействовать как с пептидом, так и с целой молекулой IL-4 в ИФА: ОП при разведении 1:100 возрастала примерно дву­кратно по сравнению с сыворотками, полученными после первого курса. Антитела к целой молекуле IL-4 обнаружены в сыворотке 6 из 8 мышей. Однако и титры антител, и их связывающая способность оставались более низкими, чем в случае иммуни­зации пептидом из IFNy. Иммунизация свободным пептидом была менее эффективна, чем иммуниза­ция коньюгатом пептида с гемоцианином. Выявлена высокая корреляция связывающей способности антител к пептиду 21-40, индуцированных после первой и второй иммунизаций (г = 0,94, p < 0,001). Корреляция связывающей способности антител в отношении пептида и целой молекулы IL-4 значима, но не столь высока (г = 0,82, p < 0,01).

Через 6 мес. после завершения курса иммуниза­ции сыворотку 8 из 12 мышей, иммунизированных пептидом 99-113 из IFNy, повторно тестировали на присутствие антител (без введения иммуногенов в этот период). Антитела, в том числе взаимодействующие с целой молекулой IFNy, продолжали выявляться, причем их активность в иммуноферментном тесте практически не из­менилась. Аналогичное тестирование сывороток мышей, получивших два курса иммунизации пептидом 21-40 из IL-4, осуществляли через 1 мес. после окончания второго курса. Способность связывать пептид сохранилась в сыворотке 4 из 8 мышей, для которых был исходно характерен высокий уровень ответа.

Таким образом, образование антител к эндогенным молекулам цитокинов IFNy и IL-4 (фактически — аутоантител) было индуцировано путем иммуниза­ции пептидами, воспроизводящими их иммунодоминантные эпитопы. Данный подход оказался успешным при имму­низации первым же синтезированным фрагментом молекулы IFNy (пептид 99-113). Иммунизация против IL-4 ока­залась эффективной лишь при введении коньюгата, содержащего пептид 21-40 (но не 60-70) мышам BALB/c. Очевид­но, иммуногенные свойства пептидов, иммунодоминантных в составе молекул цитокинов, могут измениться в составе коньюгата с гемоцианином. Так, пептид 60-70 в составе коньюгата лишается им- муногенности, а пептиды 99-113 из IFNy и 21-40 из IL-4 в большей или меньшей степени сохраняют ее. Образующиеся антитела, специфичные к пептидуим- муногену, могут перекрестно реагировать с участком молекулы цитокина, соответ­ствующим по своему составу данному пептиду. Особый интерес представляет длительность сохранения в циркуляции индуцированных антител, особенно в случае иммунизации пептидом из IFNy. Возможно, их синтез поддерживается эндогенными молекулами соответству­ющих цитокинов, образующихся при иммунных процессах, которые могут реализоваться у мышей, содержащихся в нестерильных условиях.

 

Рисунок. Кривые титрования в ИФА сывороток мышей, иммунизированных пептидами 99-113 из IFNy (а) и 21-40 из IL-4 (б)

По осям абсцисс — разведение сывороток, по осям ординат — ОП, у. е.

Кривые отражают усредненные результаты (М+SE) для сывороток контрольных и иммунизирован­ных мышей (во втором случае учтены лишь сыворотки мышей с 0П>0,5 — «иммунные сыворотки»). 1 — взаимодействие иммунных сывороток с пептидом, 2 — взаимодействие иммунных сывороток с целой молекулой цитокина, 3 — взаимодействие сывороток из контроля (введение адьюванта) с пептидом; 4 — физиологический раствор вместо сывороток. В группах по 6-8 проб сывороток.

Выводы

1. Пептиды, соответствующие по аминокислот­ной последовательности иммунодоминантным эпитопам молекул IFNy и IL-4, в составе конL- югатов с белком-носителем способны индуци­ровать у мышей образование антител, реагиру­ющих не только с пептидом-иммуногеном, но и с целой молекулой аутологичного цитокина.

Пептиды из IFNy более иммуногенны, чем пеп­тиды из IL-4.

Индуцированные антитела к цитокинам сохраня­ются в достаточно высоком титре в течение длитель­ного срока (не менее месяца) после иммунизации.

ЛИTEPATУPA

D?narello C.A. Anti-cytokine strategies // Eur. Cytokine Netw. — 1992. — 2. Feldmann M., Miotla J., Paleolog E. et al. Future prospects for anti-cytokine Vol. 3, № 1. — P. 7-17.  treatment. Ann. Rheum. Dis. — 2000. — Vol. 59, suppl. 1. — P. 119-122.

Оригинальные статьи

Holgate S.T. Cytokine and anti-cytokine therapy for the treatment of asthma and allergic disease // Cytokine. — 2004. — Vol. 28, № 4-5. — P. 152-157.

Hopp T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein an­tigenic determinants // Mol. Immunol. — 1983. — Vol. 20, № 4. — P. 483-489.

Romagnani S. Human Th1 and Th2 subsets: regulation of differentiation and role in protection and immunopathology // Int. Arch. Allergy Immu­nol. — 1992. — Vol. 98, № 4. — P. 279-285.

Simon H.U. Cytokine and anti-cytokine therapy for asthma // Curr. Allergy Asthma Rep. — 2006. — Vol. 6, № 2. — P. 117-121.

Induction of antibodies to IFNy and IL-4 in mice by immunization with immunodominant B-epitopes rendering peptides

S.V. Shevelev, A.N. Mitin, S.M. Andreev, A.A. Yarilin

Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, Moscow

Using a complex of computer programs, immunodominant B-epitopes of mouse IFNy and IL-4 were calculated. According to calculation, corresponding peptides were synthesized: 99-113 of IFNy, 21-40 and 60-70 of IL-4. These peptides conjugated with hemocyanine were used to immunize the mice. Almost in all cases there was registered production of antibodies reacting, as it was shown with immune-enzyme analysis, with 99-113 of IFNy and 21-40 of IL-4. Immunization with 21-40 peptide was less effective. After IFNY-peptide immunization antibodies reacting with the whole cytokine molecule, were found in 10 mice of 12, and after IL-4-peptide immunization only in half of mice. There was a correlation in the activity of antibodies against whole cytokine molecule and against the fragment used for immunization. Relatively high level of antibodies persisted in mice blood for a month and even longer. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 2. P. 23-27.)

Key words: interferon y, interleukin 4, antibodies, peptides.