Особенности системной и местной продукции цитокинов при ревматоидном увеите Г.Х. Зайнутдинова, В.Б. Мальханов, Н.Е. Шевчук Уфимский НИИ глазных болезней, г. Уфа
Определяли содержание цитокинов: IL-1?, IL-6, TNFa, IL-8, IL-2, IFNa, IFNy и IL-4 в слезной жидкости и сыворотке крови в динамике развития (на 3-й и 21-й дни) ревматоидного увеита (РУ). Клиникоиммунологическое обследование 26 больных выявило более высокие уровни провоспалительных цитокинов — IL-1?, TNFa, IL-8, IL-6 — в слезной жидкости пациентов по сравнению с сывороткой крови в острый период заболевания. Установлена общая закономерность в изменении содержания IFNy и IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости, подтверждающая развитие Thl-типа иммунного ответа при этой офтальмопатологии. Тяжелое длительное течение и неблагоприятный исход РУ ассоциируются с более высокими уровнями провоспалительных цитокинов в слезной жидкости. Установленные изменения концентрации цитокинов свидетельствуют о значимом участии местных иммунных реакций при развитии воспаления в увеальном тракте. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 2. С. 52-55.)
Ревматоидный увеит (РУ) развивается преимущественно у лиц трудоспособного возраста и представляет собой тяжелый воспалительный процесс. РУ характеризуется рецидивирующим течением, развитием осложнений в молодом возрасте и заканчивается существенным снижением зрения в 55 % случаев и слабовидением или слепотой — в 10-17 % [3, 6, 12].
Основное значение в развитии воспалительного процесса увеального тракта при РУ имеют нарушения Т- и В-систем иммунитета, включая изменение баланса про- и противовоспалительных цитокинов, приводящие к формированию аутоиммунных реакций.
Целью исследования явилось определение роли системной и местной продукции цитокинов в развитии РУ.
Проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование 26 больных РУ, находившихся на лечении в Уфимском НИИ глазных болезней. Все обследуемые пациенты находились в стадии ремиссии ревматоидного артрита (РА). Женщин было 15 (57,7 %), мужчин — 11 (42,3 %). Возраст пациентов варьировал от 27 до 62 лет, составляя в среднем 44,5 ± 2,5 лет.
При постановке диагноза РУ использовали данные анамнеза, клинической картины, выявление специфических аутоантител к IgG с помощью иммуноферментного анализа, заключения ревматолога.
Контрольную группу составил 41 практически здоровый донор той же возрастной группы.
Взятие крови у всех пациентов осуществляли натощак из локтевой вены в строго стерильных условиях.
Определение уровней сывороточных иммуноглобулинов классов IgA, IgM, IgG (тест-системы «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и интерлейкинов — IL-1 ?, IL-4, IL-6, TNFa, IL-8, IL-2, а также интерферонов (IFN) a и у (тест-системы ProCon, ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) в сыворотке крови и слезной жидкости больных в динамике развития увеитов (в первые 3 дня с момента воспаления глаза и на 20-24-е сутки) было проведено твердофазным иммуноферментным методом по стандартной методике [2]. Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра «Униплан» при длине волны 450 нм. Результаты содержания цитокинов выражали в пкг/мл.
Определение субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+, CD71+, CD95+проводили методом непрямого имму- нофлуоресцентного окрашивания с применением моноклональных антител (ООО «Сорбент», НИИ Иммунологии МЗ РФ).
Статистическую обработку данных проводили с помощью стандартных методов параметрической и непараметрической статистики в рамках программы Statsoft Windows (США), версия 5.0.
Результаты и обсуждение
Анализ содержания изучаемых цитокинов в сыворотке крови пациентов с РУ приведен в табл. 1. В период клинических проявлений РУ характеризовался достоверным (р < 0,01) повышением средних уровней IL-ip, TNFa, IL-6 и IL-8 по сравнению с таковыми в контрольной группе. На стадии ранней реконвалесценции было отмечено снижение концентрации данных цитокинов, причем содержание IL-ip и IL-6 по-прежнему оставалось значительно выше контрольных значений. Уровни IL-2 и IFNa в сыворотке крови в динамике исследования существенно не изменялись. Средняя концентрация IFNy в острый период заболевания была выше, чем в контроле, и нормализовалась при выздоровлении. Уровень IL-4 в острый период заболевания существенно не отличался от контроля, и, в отличие от провоспалительных цитокинов, повышался в период выздоровления.
Известно, что РА в стадии обострения на фоне отсутствия увеита сопровождается активацией иммунной системы по Thi-типу и характеризуется дисбалансом между синтезом про- и противовоспалительных цитокинов [5]. Накопление провоспалительных цитокинов в сыворотке крови способствует поддержанию активности процесса. Особое значение при РА имеют IL-1 и TNFa, приводящие к разрушению суставных поверхностей за счет стимуляции продукции протеиназ и активации остеокластов [13]. Следует отметить, что и при эндогенных увеитах также происходит накопление данных цитокинов в сыворотке крови [8].
Содержание в сыворотке крови IFNy, продуцируемого Th1-лимфоцитами, при РУ было выше в 2,4 раза по сравнению с контролем, а уровень противовоспалительного IL-4 увеличивался в 1,7 раза. Соотношение их концентраций составляло 12,2, свидетельствуя об активации ТЫ-клеток при РУ в стадии ремиссии РА.
Определение местных иммунных реакций дает возможность изучить роль цитокинов в развитии локального воспаления увеальной оболочки. Проведенные исследования показали, что содержание изучаемых провоспалительных цитокинов в слезной жидкости в период клинических проявлений РУ было достоверно (р < 0,05) выше, чем в контрольной группе, и, за исключением IL-6, нормализовалось в период ранней реконвалесценции (табл. 1). Наиболее существенное (в 7 раз) повышение уровня в слезе было отмечено для IL-6. Интересно отметить, что содержание IL-2 в слезной жидкости в острый период РУ достоверно повышалось, тогда как в сыворотке крови оставалось без изменений. Напротив, при заболевании неревматического генеза — болезни Бехчета происходило одновременное повышение уровня IL-2 в сыворотке крови и во влаге передней камеры [12].
Об участии провоспалительных цитокинов в развитии воспаления сосудистой оболочки глаза свидетельствовало высокое содержание IL-1P в сыворотке крови и слезной жидкости при двусторонних увеитах (вялотекущих, генерализованных, активных) [1, 4, 9], в слезной жидкости у детей с РУ [2]. Во внутриглазных жидкостях отмечали повышение уровней IL-6 при различных увеитах и IL-8, ответственного за приток нейтрофилов и тканевую инфильтрацию, — при болезни Бехчета [6, 12]. Высокие значения уровня TNFa в биологических жидкостях у больных с эндогенными увеитами обусловлены его влиянием на ангиогенез и индукцию аутоиммунных реакций [9-11], особенно при болезни Бехчета, симпатической офтальмии [1, 4].
Таблица 1 Содержание цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости больных увеитом ревматоидной этиологии, пкг/мл
Примечание. * — достоверность различий с контролем (р < 0,01), ** — достоверность различий между периодами заболевания (р < 0,05).
Существенных изменений содержания IFNa в слезе при РУ в нашем исследовании выявлено не было, тогда как уровень IFNy повышался (р < 0,05), нормализуясь в период клинического выздоровления. Повышение уровня IFN у в слезе было отмечено также при офтальмогерпесе [7] и при острых первичных увеитах [12], а его дефицит — при хронических, рецидивирующих [8].
Обнаруженное в нашем исследовании повышение содержания противовоспалительного IL-4 в слезной жидкости при РУ к моменту клинического выздоровления свидетельствует о восстановлении баланса про- и противовоспалительных цитокинов в этот период болезни, тогда как, по данным О.С. Сле- повой и др.. , низкие концентрации IL-4 при острых увеитах в сыворотке крови и слезе не обеспечивают противовоспалительные эффекты [8].
Сравнительный анализ уровней цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при РУ выявил общую закономерность: увеличение содержания провоспалительных цитокинов, причем в слезной жидкости концентрации TNFa, IL-8 и IL-6 более, чем в 2 раза превышали их значения в сыворотке крови, подтверждая значимую роль местной продукции цитокинов в развитии воспалительного процесса в увеальном тракте. Соотношение уровней IFNy к IL-4 в слезной жидкости составляло 11,2 (в сыворотке крови — 12,2), подтверждая преимущественное развитие ТЬ1-типа иммунного ответа при РУ, также как и в целом при увеитах, ассоциированных с такими ревматическими заболеваниями, как спондилоартрит и ювенильный РА [3].
В зависимости от исхода РУ были выявлены 2 группы больных. В 1-ю вошли 11 (57,9 %) из 19 пациентов с благоприятным исходом заболевания — стиханием воспалительного процесса в увеальном тракте в сроки до 3-х недель. Это выражалось в значительном уменьшении инъекции сосудов глазного яблока, рассасывании экссудата в передней камере, фибринозной пленки в области зрачка, разрыве спаек, повышении остроты зрения по сравнению с исходной. Во 2-ю группу вошли 8 (42,1 %) больных с тяжелым длительным течением воспалительного процесса в глазу и неблагоприятным его исходом, у которых проведенная терапия не привела к полному купированию воспалительного процесса в исследуемые сроки.
Сопоставление уровня провоспалительных цитокинов в слезной жидкости с исходом РУ показало более высокое (р < 0,05) их содержание в острый период заболевания у больных 2-й группы по сравнению с таковым в 1-й группе (рисунок). На стадии ранней реконвалесценции концентрации изучаемых цитокинов в слезе больных с тяжелым течением и неблагоприятным исходом увеита (2-я группа) по-прежнему оставались выше контроль
ных значений, тогда как в 1-й группе больных с благоприятным исходом РУ — нормализовались.
Определение количественных показателей основных субпопуляций лимфоцитов крови у больных с РУ не выявило их существенных изменений (табл. 2). Содержание иммуноглобулинов классов IgA и IgM в сыворотке крови у больных в исследуемой группе было достоверно (р < 0,01) выше таковых в группе контроля. Установленная нами взаимосвязь числа В-клеток (CD19+) в острый период заболевания с содержанием IgM (г = 0,7731, p = 0,024) у больных РУ, вероятно, косвенно свидетельствует о продукции антиувеальных антител [1]. Значимых изменений в содержании IgG у больных увеитами не было выявлено.
Таким образом, при РУ выявлены иммунные нарушения, характеризующиеся изменениями цитокинового статуса больных на системном и местном уровнях.
Рисунок. Содержание провоспалительных цитокинов в слезной жидкости в зависимости от исхода ревматоидного увеита, пкг/мл
Таблица 2 Относительное содержание основных субпопуляций лимфоцитов крови (%) и иммуноглобулинов (мг/мл) у больных ревматоидным увеитом, М ± т
Примечание. *** — различия достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05; р < 0,01, соответственно).
Установлена общая закономерность в изменении содержания IFNy и IL-4 в сыворотке крови и слезной жидкости, подтверждающая развитие Thl-типа иммунного ответа при этой офтальмопатологии. Уровни провоспалительных цитокинов в слезной жидкости оказались значительно выше по сравнению с их содержанием в сыворотке крови, что свидетельствует о более значимом участии местных иммунных реакций при развитии воспаления в увеальном тракте. Тяжелое длительное течение воспалительного процесса в глазу и неблагоприятный исход РУ ассоциируются с более высокими уровнями провоспалительных цитокинов в слезной жидкости по сравнению с легким течением заболевания. Установленные изменения концентрации цитокинов, участвующих в инициации и развитии воспалительного процесса, позволяют обосновать адекватную иммунотропную терапию увеитов ревматоидной этиологии.
Быковская Г.Н., Слепова О.С., Кричевская Г.И. и др. Изучение антител к ДНК у больных с односторонними и двусторонними увеитами // Вестн. офталь- мол. — 1997. — № 2. — С. 30-32.
Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 20-35.
Дроздова Е.А. Увеит при ревматических заболеваниях: особенности клиники, диагностика, иммунопатогенез и лечение: Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. — Челябинск, 2006. — 48 с.
Ершов Ф.И., Оспельникова Т.П. Современный арсенал антигерпетических лекарственных средств // Инфекции антимикробн. тер. — 2001. — Т. 3, № 4. — С. 100-104.
Ильина Н.И., Гудима Г.О. Воспаление и иммунитет в общеклинической практике. Общая концепция // Цитокины и воспаление. — 2005. — Т. 4, № 3. — С. 42-44.
Марванова З.Р. Клинико-иммунологическое прогнозирование и корригирующая терапия циклофероном герпетического кератита: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. — Уфа, 2003. — 24 с.
Слепова О.С., Быковская Г.Н., Катаргина Л.А. и др. Нарушение продукции и баланса цитокинов при воспалительных заболеваниях глаз // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 2. — С. 50-51.
Теплинская Л.Е., Филичкина Н.С., Матесова К.С. Локальный гуморальный и цитокиновый статус при активном увеите // Мат. науч.-практ. конф. — Челябинск, 2004. — С. 9-11.
Третьяк Е.Б., Сыроедова О.Н., Рябцева А.А., Сучков С.В. Современные представления о патогенезе аутоиммунных увеитов // Клин. офтальмол. — 2003. — Т. 4, № 4. — С. 144-145.
Jacob C.O. Studies on the role of tumor necrosis factor in murine and human autoimmunity // J. Autoimmun. — 1992. — Vol. 5, suppl. A — P. 133-143.
Lacomba M.S., Martin C.M., Chamond R.R. et al. Aqueous and serum interferon gamma, interleukin (IL) 2, IL-4 and IL-10 in patients with uveitis // Arch. Ophthalmol. — 2000. — Vol. 118, № 6. — P. 768-782.
Teitelbaum S.L. Bone resorption by osteoclasts // Science. — 2000. — Vol. 289, № 5484. — P. 1504-1508.
Serum and lacrimal levels of IL-1?, IL-б, TNFa, IL-8, IL-2, IFNa, IFNy, and IL-4 cytokines were measured on 3rd and 21st days of rheumatoid uveitis. Clinical and immunological study of 26 patients showed more significant increase in pro-inflammatory cytokines IL-1?, TNFa, IL-8, IL-б levels in lacrimal fluid than in serum during the acute phase of disease. Changes in IFNy and IL-4 serum levels were the same as in lacrimal fluid and showed Th1 type immune response. Severity of rheumatoid uveitis and its unfavorable outcome were associated with higher pro-inflammatory cytokine levels in lacrimal fluid. Our study showed importance of local immune reactions in ocular inflammation. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 2. P. 52-55.)