загрузка...
 
Влияние агонистов PPAR? и ? и LXR на содержание ядерных гормональных рецепторов PPAR?, LXR и RXR в макрофагах и TNFa в крови мышей при остром воспалении М.И. Душкин, М.И. Часовских, О.М. Хощенко  НИИ клинической иммунологии СО РАМН;  НИИ терапии СО РАМН, г. Новосибирск
Повернутись до змісту

Влияние агонистов PPAR? и ? и LXR на содержание ядерных гормональных рецепторов PPAR?, LXR и RXR в макрофагах и TNFa в крови мышей при остром воспалении М.И. Душкин, М.И. Часовских, О.М. Хощенко  НИИ клинической иммунологии СО РАМН;  НИИ терапии СО РАМН, г. Новосибирск

Исследовано влияние агониста рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (РРДК)а, безафибрата, агониста РРДРу росиглитазона и агониста Х-рецептора печени (Ш) Т0901317 на уровень белковых продуктов PPAR?, LXR и ретиноидных Х-рецепторов (КХК) в перитонеальных макрофагах и содержание Т^а у мышей С57В1/6 в сыворотке крови в первые сутки асептического воспаления, индуцированного внутрибрюшинным введением 50 мг/кг зимозана. Введение зимозана приводило к резкому снижению уровня PPAR?, LXR? и RXR в макрофагах и повышению уровня Т№а в сыворотке крови. Введение безафибрата, росиглитазона или Т0901317 на фоне воспаления, вызванного зимозаном, снижало содержание Т№а в сыворотке крови и повышало уровень белковых продуктов  в макрофагах. Таким образом, введение агонистов РРДРа и у и ЬХК является эффективным способом индукции белковых продуктов этих транскрипционных факторов в макрофагах, что может быть использовано в разработке комбинированной терапии широкого круга заболеваний воспалительной и аутоиммунной природы. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 3. С. 9-13.)

Ключевые слова: рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом (PPAR), Х-рецепторы печени (LXR), ретиноидные Х-рецепторы (RXR), макрофаги, воспаление.

Рецепторы активации пролиферации пероксисом (PPAR) и Х-рецепторы печени (LXR), входящие в суперсемейство ядерных гормональных рецепто­ров, играют важную роль в регуляции иммунного ответа при воспалении в макрофагах [1]. Активация этих транскрипционных факторов натуральными и синтетическими агонистами приводит к образо­ванию гетеродимеров с ретиноидными Х-рецеп- торами (RXR), которые транслоцируются в ядро и связываются с регуляторными участками ДНК, модулируя транскрипцию генов-мишеней [11]. Агонисты PPAR, LXR и RXR обладают противо­воспалительным действием, контролируя транс­крипционные программы, вовлеченные в процесс регуляции экспрессии и продукции цитокинов [12]. Поэтому агонисты этих рецепторов выступают как потенциальные фармакологические средства про­тив таких заболеваний, как ревматоидный артрит,вирусные и бактериальные повреждения органов, атеросклероз и диабет 2-го типа [13].

В экспериментах на грызунах показано, что ве­дение бактериальных липополисахаридов (ЛПС) или провоспалительных цитокинов вызывает снижение активности содержания и экспрессии мРНК многих ядерных гормональных рецепторов в печени, почках, мышцах и других органах, а вве­дение агонистов PPAR, LXR или RXR, напротив, подавляет воспалительный ответ [6]. В то же время, информация относительно роли этих рецепторов в регуляции воспалительного ответа в макрофагах ограничена исследованиями in vitro на клеточных перевиваемых линиях [11], которые не могут быть аппроксимированы на животных. Данных о том, как введение агонистов PPAR, LXR или RXR ре­гулирует их активность в макрофагах в процессе воспаления in vivo, в литературе недостаточно.

Ранее на модели асептического воспаления, вызванного введением полимера a-D-маннана и Результаты и обсуждение Как видно из рис. 1, через 24 ч после введения зимозана в сыворотке крови обнаружено увеличение уровня TNFa в 11,5 раз по сравнению с контрольным показателями (введение PBS). Введение агониста LXR Т0901317, агониста PPARa безафибрата и агониста PPARy росиглитазона приводило к достоверному снижению индуцированного зимозаном уровня TNFa на 44, 47 и 61 %, соответственно (рис. 1). Необходимо отметить, что введение исследуемых агонистов не оказывало значительного влияния на контрольный уровень этого цитокина.Известно, что зимозан А, содержащий 50-57 % 3-0-гликанов, индуцирует продукцию различных концентрация TNFa (пг/мл) 250 г Ядерные гормональные рецепторы макрофагов при воспалении ?-D-глюкана Saccharomyces cerevisiae (зимозана А), нами были изучены изменения синтеза липидов, деградации липопротеинов низкой плотности [3] и влияние агонистов PPAR, LXR или RXR на фор­мирование липидных включений [2] в макрофагах в динамике воспалительного процесса. Однако в этих работах не была изучена взаимосвязь между содержанием белковых продуктов этих транскрип­ционных факторов и уровнем провоспалительных цитокинов.

Поэтому целью настоящей работы явилось изу­чение влияния агонистов ядерных гормональных рецепторов PPARa безафибрата, PPARy розигли- тазона, и LXR Т0901317 на содержание белковых продуктов PPAR, LXR или RXR в макрофагах и TNFa в сыворотке крови мышей через 24 ч после развития абдоминального воспаления, индуциро­ванного зимозаном А.

в течение 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с первичными кроличьими поликлональными антителами к мы­шиным PPARa («Sigma-Aldrich», разведение 1:500), RXR («Santa Cruz Biotechnology», разведение 1:500), LXRa, LXR? («Abcam», разведение 1:500) или мышиными антителами к ?-актину («Sigma- Aldrich», clone AC-74, разведение 1:2000) в течение 2 ч при 37 °С. Затем отмывали 3 раза по 15 мин в фосфатно-солевом буфере, содержащем 5 % обезжиренное молоко. Иммунокомплексы де­тектировали, используя вторичные антикроличьи (разведение 1:500) и антимышиные антитела (разведение 1:2000), меченные фосфатазой («Santa Cruz Biotechnology»). Визуализацию иммун­ных комплексов проводили в 10 мл 0,1 М Трис-буфера, pH 8,2, содержащем 2 мг нафтол^-МХ-фосфата, разведенного в 200 мкл диметилформамида, и 10 мг Fast Red TR Salt. Количественную обработку результатов сканирования имунноблотов проводили, используя программу «TotalLab».

Достоверность различий (р<0,05) сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, используя статистический пакет «Statgraphics».

Материалы и методы

В экспериментах использовали мышей-самцов линии C57BL/6, содержащихся на стандартной диете в виварии Института кли­нической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск). Асептическое воспаление вызывали внутрибрюшинным введением зимозана А («Sigma», USA) в дозе 50 мг/кг массы тела в 1мл 0,05 М фосфат­ного буфера, содержащего 0,9 % NaCL (PBS). Контрольным мышам внутрибрюшинно вводили 1 мл PBS. Агонисты LXR Т0901317 («Sigma-ALdrich»), PPARa безафибрат («Sigma-ALdrich») и PPAR? росиглитазон («Cayman Chemical») вводили внутрибрюшинно дважды с интервалом 12 ч в обLеме 100 мкл PBS, содержащего 20 % диметилсульфоксида, в дозах 10, 20 и 20 мг/кг массы тела, соответственно. Животные были разделены на 8 групп: 1-я — кон­трольная, 2-я — введение зимозана, 3-я — введение Т0901317, 4-я — введение Т0901317 и зимозана, 5-я — введение росигли- тазона, 6-я - введение росиглитазона и зимозана, 7-я — введение безафибрата, 8-я — введение безафибрата и зимозана. В каждой группе было по 6 животных.

Через 24 ч после введения зимозана животных декапитирова- ли, отбирали и центрифугировали кровь, и полученную сыворотку крови замораживали при -20 °С. Перитонеальные макрофаги получали из перитонеального лаважа и культивировали обще­принятым методом [3].

Уровень TNFa в сыворотке крови животных определяли с использованием набора реагентов для твердофазного иммуноферментного анализа ProCon фирмы «Протеиновый контур» (Санкт Петербург), как описано нами ранее [2].

Иммуноблотинг ядерных рецепторов осуществляли в лизиро- ванных макрофагах [7]. Для этого клетки лизировали буфером, содержащим 10 мМ HEPES (pH 7,9), 0,5 % Nonidet P40, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCL, 0,5 мМ дитиотрейтола и 1 % коктейль ингибиторов про­теаз («Sigma-ALdrich») в течение 15 мин при +4 °С. Супернатант собирали, определяли концентрацию белка методом Бредфорда. Пробы замораживали и хранили при -20 °С. Белки разделяли в 10 % полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.

 

Рис. 1. Влияние агонистов Ш Т0901317, РРАШа безафибрата и РРАШу росиглитазона на содержание Т а в сыворотке крови мышей через 24 ч после введения зимозана, М±т, п=6

По оси абсцисс:

К — контроль, З — зимозан, ТО — Т0901317, ТО+З — Т0901317+зимозан, Р — росигли- тазон, Р+З — росиглитазон+зимозан, Б —безафибрат, Б+З — безафибрат+зимозан.

* — достоверность отличий от действия зимозана (р<0,05).

Оригинальные статьи

Для иммунодетекции проводили блокировку в фос- фатно-солевом буфере, содержащем 5 % обезжиренное молоко,провоспалительных медиаторов в макрофагах, свя­зываясь с гликановыми рецепторами и активируя NF-kB [14]. Предполагается, что агонисты PPAR, LXR и RXR могут снижать экспрессию и продукцию воспалительных цитокинов путем трансрепрессии, ингибируя активность сигналзависимых транс­крипционных факторов NF-kB и AP-1 [13]. Ранее на различных моделях воспаления у мышей было по­казано, что введение T0901317 [10], агониста PPARy пиоглитазона [9] или агониста PPARa WY14,643 [5] снижает иммунный ответ и уровень провоспа­лительных цитокинов крови, в частности, TNFa. Хотя механизмы противовоспалительного действия агонистов PPAR и LXR до конца не изучены, однако они, вероятно, могут включать экспрессию белковых продуктов PPAR, LXR и RXR в макрофагах.

Содержание белковых продуктов изоформ ядерных гормональных рецепторов PPARa, LXRa и в и содержание RXR в макрофагах мышей оце­нивали с использованием специфических антител методом иммуноблот-анализа. Для этого на фоне введения мышам PBS или зимозана вводили аго­нисты PPAR и LXR, получали и культивировали в течение 2 ч перитонеальные макрофаги и в кле­точных лизатах определяли относительное содер­жание белковых продуктов ядерных рецепторов. Результаты выражали в процентах отношения оптической плотности белковых бендов ядерных рецепторов к в-актину в макрофагах, принимая за 100 % контрольные величины, полученные при введении мышам PBS. Введение зимозана А приводило к резкому снижению содержания бел­ковых продуктов PPARa на 66,5 % (рис. 2), LXRe на 84,3 % (рис. 4) и RXR на 46 % (рис. 3), в то время как уровень LXRa существенно не изменялся (рис. 5). Как показано на рис. 2, введение агонистов PPAR и LXR оказывало индуцирующие влияние на уровень PPARa в макрофагах как в контроль­ных условиях, так и на фоне воспаления, вы­званного зимозаном. Росиглитазон и безафибрат повышали базовый уровень PPARa на 58 и 82 %, соответственно, по сравнению с контролем, и на 72 и 44 %, соответственно, по сравнению с зимозаном. T0901317 не оказывал влияния на уровень PPARa в макрофагах контрольных животных, но повышал его почти в 2 раза при введении зимозана. Подобным образом под действием агонистов PPAR и LXR изменялся белковый уровень RXR (см. рис. 3), которые образуют с PPAR и LXR ге- теродимеры, что является необходимым условием для реализации их транскрипционной активности. T0901317, росиглитазон и безафибрат значитель­но индуцировали белковый уровень RXR в макро­фагах контрольных животных. На фоне введения зимозана росиглитазон и безафибрат сходным образом повышали уровень RXR на 36 %, в то вре­мя как T0901317 оказывал более выраженный эф­фект (повышение на 75 %). При изучении влияния агонистов PPAR и LXR на содержание белковых продуктов LXRe в макрофагах (см. рис. 4), было обнаружено, что росиглитазон достоверно повы­шал уровень LXRe только в клетках контрольных мышей и не оказывал существенного влияния на этот показатель в условиях воспаления. T0901317, напротив, эффективно восстанавливал белковый уровень LXRe в зимозан-индуцированных макро­фагах до контрольных значений, но не оказывал влияния на уровень LXRe в клетках, полученных у контрольных мышей. Полученные результаты о неспособности T0901317 стимулировать базовый уровень LXR в мышиных макрофагах согласуются с данными других авторов, указывающих, что, в отличие от макрофагов человека, в мышиных перитонеальных макрофагах T0901317 не инду­цирует экспрессию LXR [8]. В то же время нами не было обнаружено достоверных изменений белкового уровня LXRa макрофагов под влиянием агонистов PPAR и LXR как в контрольной, так и в зимозан-индуцированной группе мышей (см. рис. 5). Как свидетельствуют литературные данные [8], это может быть связано с низкой экспрессией этой изоформы LXR перитонеальными макро­фагами мышей по сравнению с человеческими макрофагами.

Известно, что механизмы противовоспали­тельной активности агонистов PPAR, LXR и RXR в макрофагах реализуются через стимуляцию образования сложных комплексов гетеродимеров этих рецепторов с транскрипционными факторами NF-kB и AP-1 при их связывании с промоторными участками, что вызывает ингибирование транскрип­ции генов цитокинов и других провоспалительных факторов [12]. Однако имеются исследования, в которых показано, что эффект агонистов LXR не ассоциируется с подавлением экспрессии мРНК c-Fos/c-Jun или связыванием NF-kB/AP-1 с ДНК [4]. Эти данные указывают, что антивоспалительная активность агонистов LXR может быть не связана с ингибированием транскрипционной активнос­ти NF-kB/AP-1. Как бы то ни было, механизмы противоспалительного эффекта агонистов PPAR, LXR включают их способность индуцировать уровень белковых продуктов PPAR, LXR и RXR. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что рост экспрессии RXR, PPARa и LXR-в в макрофагах при введении агонистов PPARa и у и LXR на фоне острого воспаления ассоциируются со снижением уровня TNFa в сыворотке крови. Важно подчеркнуть, что специфические для каждого ре­цептора агонисты не ограничиваются способностью ауторегуляторного действия на свой собственный траскрипционный фактор.

 

 

Рис. 2-5

По оси абсцисс: К — контроль, З — зимозан, ТО — Т0901317, ТО+З — Т0901317+зимозан, Р — росиглитазон, Р+З — росиглитазон+зимозан, Б—безафибрат, Б+З — безафибрат+зимозан.

По оси ординат: отношение оптических плотностей опытных бэндов к бэнду Р-актина (%)

Рис. 2: За 100 % принято отношение оптической плотности бэндов PPARa к бэнду Р-актина в контрольных клетках (введение PBS).

Рис. 3: За 100 % принято отношение оптической плотностей бэндов RXR к бэнду Р-актина в контрольных клетках (введение PBS).

Рис. 4: За 100 % принято отношение оптической плотности бэндов LXRP к бэнду Р-актина в контрольных клетках (введение PBS).

Рис. 5: За 100 % принято отношение оптической плотности бэндов LXRa к бэнду Р-актина в контрольных клетках (введение PBS).

Достоверность различий (p<0,05): * — с контролем, **— с зимозаном.

Так, нами обнаружено, что агонист PPARy росиглитазон способен стиму­лировать экспрессию белковых продуктов PPARa и RXR, агонист PPARa безафибрат повышает уровень LXRe и RXR, а агонист LXR T0901317 стимулирует увеличение PPARa и RXR в макро­фагах в условиях воспаления. Обнаруженная нами перекрестная регуляция сигнальных путей трансдукции ядерных гормональных рецепторов находит свое подтверждение в литературных источниках. Показано, что ген LXR является мишенью для регуляции PPARa и у в макрофагах и адипо- цитах, и агонисты PPAR способны индуцировать транскрипцию генов АТФ-связанных кассетных транспортеров АВСА1 и ABCG1 в макрофагах,контролируемых LXR [5]. Ранее также было обна­ружено, что агонисты LXR повышают чувствитель­ность рецепторов к инсулину, которая находится под контролем PPARy [7]. Более того, известно, что в экспериментах на моделях инфекционных и ауто­иммунных заболеваний природные и синтетические лиганды PPAR, LXR и RXR оказывают аддитивное противовоспалительное действие [12].

Таким образом, настоящее исследование де­монстрирует, что антивоспалительная активность каждого из изученных специфических агонистов PPARa и у и LXR ассоциируется не только с экспрессией соответствующей изоформы рецептора как результат ауторегуляции, но и со стимуляцией роста количества белковых продуктов некоторых других ядерных гормональных рецепторов в мак­рофагах, агонисты которых имеют другую хими­ческую структуру. Это открывает новые широкие возможности использования комбинированного влияния агонистов PPARa, PPARy и LXR в терапии воспалительных заболеваний, в которые вовлече­ны макрофаги.

Работа поддержана РФФИ (грант №06-04-48273).

ЛИТЕРАТУРА

Душкин М.И., Кудинова Е.Н, Шварц Я.Ш. Интеграция сигнальных путей регу­ляции липидного обмена и воспалительного ответа // Цитокины и воспале­ние. — 2007. — Т. 6, № 2. — С. 12-18.

Душкин М.И., Хощенко О.М., Посохова Е.Н. и др. Агонисты PPAR-a и -у и RXR ингибируют образование макрофаг/пенистых клеток при воспалении у мышей // Бюлл. эксп. биол. мед. — 2007. — Т. 144, № 11. — С. 556-559.

Посохова Е.П., Хощенко О.М., Часовских М.И. и др. Синтез липидов в макрофагах при воспалении in vivo: влияние агонистов рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом-a и -у и ретиноидных // Биохимия. — 2008. — Т. 73. — С. 364-374.

BirreLL M.A., CatLey M.C., Hardaker E. et al. Novel role for the liver X nuclear receptor in the suppression of lung inflammatory responses // J. Biol. Chem. — 2007. — Vol. 282, № 44. — P. 31882-31890.

Cunard R., DiCampli D., Archer D.C. et al. WY14,643, a PPAR alpha ligand, has pro­found effects on immune responses in vivo // J. Immunol. — 2002. — Vol. 169, № 12. — P. 6806-6812.

Khovidhunkit W., Kim M.S., Memon R.A. et al. Effects of infection on lipid and lipoprotein metabolism: mechanisms and consequences to the host // J. Lipid Res. — 2004. — Vol. 45, № 7. — P. 1169-1196.

Khovidhunkit W., Moser A.H., Shigenaga J.K. et al. Endotoxin down-regulates ABCG5 and ABCG8 in mouse liver and ABCA1 and ABCG1 in J774 murine macrophages: dif­ferential role of LXR // J. Lipid Res. — 2003. — Vol. 44, № 9. — P. 1728-1736.

Laffitte B.A., Joseph S.B., Walczak R.et al. Autoregulation of the human liver X receptor alpha promoter // Mol. Cell. Biol. — 2001. — Vol. 21, № 22. — P. 7558-7568.

Ohata M., Suzuki H., Sakamoto K. et al. Pioglitazone prevents acute liver injury induced by ethanol and lipopolysaccharide through the suppression of tumor necrosis factor- alpha // Alcohol Clin. Exp. Res. — 2004. — Vol. 28, 8 suppl. Proc. — P. 139S-144S.

Dai X., Ou X., Hao X. et al. Effect of T0901317 on hepatic proinflammatory gene expression in apoE-/- mice fed a high-fat/high-cholesterol diet // Inflamma­tion. — 2007. — Vol. 30, № 3-4. — P. 105-117.

Ricote M., Valledor A.F., Glass C.K. Decoding transcriptional programs regulated by PPARs and LXRs in the macrophage: effects on lipid homeostasis, inflamma­tion, and atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2004. — Vol. 24, № 2. — P. 230-239.

Rigamonti E., Chinetti-Gbaguidi G., Staels B. Regulation of macrophage functions by PPAR-alpha, PPAR-gamma, and LXRs in mice and men // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. — 2008. — Vol. 28, № 6. — P. 1050-1059.

Straus D.S., Glass C.K. Anti-inflammatory actions of PPAR ligands: new insights on cellular and molecular mechanisms // Trends Immunol. — 2007. — Vol. 28, № 12. — P. 551-558.

Young S.H., Ye J., Frazer D.G. Shi X., Castranova V. Molecular mechanism of tumor necrosis factor-alpha production in 1^3-beta-glucan (zymosan)-activated mac­rophages // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276, № 23. — P. 20781-20787.

The effect of PPARa and y and LXR agonists upon macrophage protein product level of PPARa,LXR and RXR nuclear hormone receptor and serum TNFa in acute inflammation in mice M.I. Dushkin, M.I. Chasovskikh, O.M. Khoshchenko

1 Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch RAMS, Novosibirsk;2 Institute of Internal Medicine, Siberian Branch RAMS, Novosibirsk

The effects of PPARa u y and LXR agonists bezafibrate, rosiglitazone and T0901317, accordingly, upon peritoneal macrophage protein product level of PPARa, LXR and RXR nuclear hormone receptors as well as on serum TNFa level 24 hr after intraperitoneal injection of 50 mg/kg zymosan to C57Bl/6 mice were studied.Injection of zymosan led to the significant decrease in macrophage PPARa, LXR and RXR levels and increase in serum TNFa level. Against a background of zymosan inflammation the injection of bezafibrate, rosiglitazone and T0901317 resulted in decrease of serum TNFa level and increase of macrophage PPARa, LXR level and RXR levels. Thus, combined action of PPARa, y and LXR agonists possesses therapeutic potential and can be used in effective treatment of a variety of inflammation and autoimmune diseases. Injection of bezafibrate, rosiglitazone or T0901317 in mice with zymosan-induced inflammation reduced the blood serum TNFalpha, and increased the level of protein products PPARa, LXRP and RXR in macrophages. Thus, the injection of PPARa, PPARy and LXR agonists is an effective way of inducing protein products of these transcription factors in macrophages, which can be used in the development of combination therapies for a wide range of autoimmune and inflammatory diseases. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 3. P. 9-13.)

Key words: peroxisome proliferation activating receptors, liver X receptors, retinoid X receptors, macrophages,inflammation.



загрузка...