загрузка...
 
Цитокиновый профиль и количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы Н.Е. Громада Уральская государственная медицинская академия, Екатеринбург
Повернутись до змісту

Цитокиновый профиль и количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы Н.Е. Громада Уральская государственная медицинская академия, Екатеринбург

Проведено исследование содержания цитокинов (интерлейкинов 1 в, 4, 6, фактора некроза опухолей а) в крови у 75 доношенных новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением центральной нервной системы в возрасте 1-е-3-и, 5-7-е, 28-е сутки жизни. Определяли среднее количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов методом кариометрии. Выявлен дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами и их взаимосвязь с количеством ДНК в ядрах лимфоцитов в зависимости от степени тяжести перинатальной гипоксии. (Цитокины и воспаление. 2008. Т. 7, № 3. С. 14-18.)

Ключевые слова: новорожденные, перинатальная гипоксия, цитокины, кариометрия.

В настоящее время проблема прогнозирования исходов и катамнестического наблюдения за но­ворожденными с постгипоксическим поражением центральной нервной системы остается актуальной. Методы лабораторного исследования центральной нервной системы (ЦНС), используемые наряду с визуализирующими методами исследования, не могут представить обLективной информации о степени поражения клеток мозга и не позволяют судить о прогнозе. В этой связи имеет значение использование нейроиммунологических методов оценки состояния ЦНС у новорожденных детей, перенесших перинатальную гипоксию [2].

Все цитокины или их рецепторы обнаружены во многих клетках ЦНС, в том числе и в нейронах. Повышение концентрации интерлейкинов TNFa и IL-1? не только свидетельствует об острой сис­темной воспалительной реакции в ответ на различ­ные инфекционные воспалительные факторы, но отражает избыточную продукцию данных интерлейкинов глиальными клетками и макрофагами при ишемии. Как известно, при перинатальной гипоксии нарушается функция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и цитокины поступают в кровоток [3, 6, 7].

Исследования подтверждают гипотезу о том, что провоспалительные цитокины IL-1P и TNFa, быстро появляющиеся в поврежденном мозге, ответственны за прогрессирующее повреждение нейронов, и что эти медиаторы являются важны­ми пусковыми факторами в нейропротективной интервенции после острого периода повреждения мозга. Многие цитокины играют двоякую роль, ускоряя или предотвращая гибель апоптотических нервных клеток [4, 6, 7].

Кроме того, периферические цитокины высво­бождаются иммунными клетками (лимфоцитами, моноцитами, макрофагами) при воспалении, стиму­лируя самые различные физиологические, нейро- эндокринные и иные реакции ЦНС. В свою очередь, ЦНС регулирует иммунную систему на локальном и общем уровнях различными путями [4, 6, 8, 9].

Интерлейкин 6 (IL-6) также относится к цито- кинам острой фазы воспаления, но его длительное повышение свидетельствует о поддержании пато­логического процесса [4, 8].

Материалы и методы

Обследованы 120 доношенных новорожденных (62 мальчика, 58 девочек) с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС различной степени тяжести. Средняя масса тела новорожденных — 3560 ± 220,4 г, длина тела — 51,8 ± 1,8 см. В обследование не были включены дети с врожденными пороками развития, недоношенные, с синдромом задержки внутриутробного развития, внутриутробной инфекцией и гнойно-воспалительными заболеваниями, травматическим поражением ЦНС. Дети были разделены на три группы по клинико-нейрофизиологическим признакам: 1-я группа (n = 25) — гипоксическая энцефалопатия легкой степени; 2-я группа (n = 25) — средней тяжести; 3-я группа (n = 25) — гипоксическая энцефалопатия тяжелой степени. В группу сравнения (группу 4) включены 45 здоровых новорожденных без неврологических и соматических отклонений. Группы наблюдения были сопоставимы по антропометрическим параметрам, полу, факторам риска развития перинатальной патологии, клиническим синдромам, патогенетической терапии. Все дети были обследованы по общим клиническим и нейрофизиологическим методикам согласно рекомендательным стандартам. Клиническое обследование проводили на базе родильного отделения городской больницы № 14 Екатеринбурга и отделения патологии новорожденных детской городской больницы № 5. Новорожденные с легкой степенью гипоксической энцефалопатии были выписаны домой и практически не нуждались в проведении лечебных мероприятий.

Содержание цитокинов в сыворотке крови изучали с помощью иммуноферментного анализа в 1-е-3-и, 5-7-е, 28-е сутки жизни. Уровень TNFa, интерлейкинов 1р, -4, -6 определяли наборами фирмы ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург).

Параллельно у всех детей в указанные периоды наблюдения (физиологические точки транзиторного состояния лимфоцитов неонатального гемопоэза) определяли среднее количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов методом кариометрии по оптической плотности ядер при окраске по Фельгену. Использованы компьютерные микротелефотометрические автоматизированные системы с ма­тематическим моделированием гистопатологического процесса. Метод кариометрии разработан на основании методологии и медицинской морфометрии, методики плоидометрии лимфоци­тов, предложенной и усовершенствованной Г.Г. Автандиловым [1]. Этот метод ранее не использовался с целью диагностики гипоксии у новорожденных.

Статистическую обработку данных осуществляли в опера­ционной среде Windows 2000 с использованием программы Statistica. Для сравнения показателей использовались непара­метрические методы (тесты Манна — Уитни, Вилкоксона).

Значимыми перинатальными факторами риска развития гипоксического поражения ЦНС у детей 2-й и 3-й групп были: неблагоприятное течение беременности у матерей, хронические заболева­ния (пиелонефрит, гастрит, холецистит), острые респираторные вирусные инфекции, которые на­блюдались у женщин в 2 раза чаще ф < 0,05) при тяжелой форме патологии. У матерей 3-й группы в 1,5 раза чаще, чем во 2-й группе, имели место быстрые роды, экстренное (незапланированное) кесарево сечение, стимуляция родовой деятель­ности, длительный безводный период ф < 0,05). Признаки острой асфиксии в интранатальном периоде наблюдались чаще у детей 3-й группы ^ < 0,05).

Дети 2-й и 3-й групп наблюдения имели клини­ческие признаки гипоксического поражения ЦНС (табл. 1). Во 2-й группе (средняя степень тяжести) доминировали синдромы вегето-висцеральных дисфункций и гипертензионный.

Таблица 1 Синдромы гипоксического поражения центральной нервной системы при различных формах тяжести в остром периоде (5-7-е сутки)

 

Примечание. Различия достоверны (р < 0,05): * — между 1-й и 2-й группами, ** — между 2-й и 3-й группами.

У детей с тяжелой формой патологии ведущими были судорожный синдром угнетения и кома. У детей с легкой сте­пенью гипоксического поражения ЦНС отмечался синдром повышенной нервно-рефлекторной воз­будимости с быстрой регрессией.

Отсутствует достаточная информация о повреж­дающем действии перинатальной гипоксии на ДНК ядер клеток, в том числе лимфоцитов. Повреж­дение ДНК клеток в результате окислительного стресса можно рассматривать как один из пуско­вых механизмов апоптоза [5]. Можно полагать, что механизмы повреждения ДНК иммунокомпетентных клеток на фоне гипоксии являются молекулярно-биохимическими механизмами формирования иммунологической недостаточности и развития вторичных иммунодефицитных состояний.

Целью настоящего исследования явилось изу­чение содержания цитокинов в крови и их взаимо­связи с количественным значением ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови новорожден­ных с гипоксическим перинатальным поражением ЦНС различной степени тяжести.

Результаты и обсуждение

По данным нейровизуализации (нейросонография) структур головного мозга, установлено, что частота внутрижелудочковых кровоизлияний была почти одинаковой в обеих группах, но только у детей 3-й группы наблюдались внутрижелудоч- ковые кровоизлияния III степени (40 %). Цереб­ральная ишемия III степени чаще наблюдалась при тяжелом поражении ЦНС (76 %), а ишемия II степени (92 %) была характерна для гипоксической энцефалопатии средней тяжести.

У большинства детей 1-й группы структурных изменений практически не было.

При анализе показателей про- и противовос­палительных цитокинов во 2-й и 3-й группах наблюдения установлено, что уровни провоспалительных цитокинов TNFa, IL-1 ? в сыворотке крови в первые 7 дней в 5, 7, 8 раз превышали (p < 0,001) нормативные значения и оставались высокими в течение всего неонатального периода, в то время как в 1-й группе достоверных отличий от нормы не наблюдалось (p > 0,05) (рис. 1, 2).

Интерлейкин (IL-1?) активирует лимфоциты, запускает специфический иммунитет и является ранним диагностическим признаком гипоксичес- ких изменений и осложненного периода адаптации [6, 7]. При ишемических повреждениях резко уси­ливается синтез IL-1? макрофагами, астроцитами, а глиальные клетки мозга продуцируют TNFa, который инициирует лимфоциты и макрофаги спинномозговой жидкости. Повышение уровня интерлейкина TNFa ведет к массивному повреж­дению тканей.

Интерлейкины IL-1?, TNFa — не только мар­керы тканевого повреждения, они могут стимули­ровать процессы тканевой репарации и пролифе­рацию эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток, дифференцировку фибробластов и синтез ими коллагена [3, 4, 6, 7].

Повышение уровня противовоспалительного IL-4, по-видимому, играет роль в уравновешива­нии провоспалительного каскада и ограничении последующего повреждения тканей (рис. 3).

Сравнительная характеристика иммунологичес­ких показателей в зависимости от степени тяжести гипоксического повреждения ЦНС в неонатальном периоде (21-28-е сутки) показала, что у детей 2-й и 3-й групп наблюдения в этот период наблюдалось снижение уровня IL-1?, TNFa, IL-4 в сыворотке крови, но показатели не достигали нормативных значений (см. рис. 1, 2, 3). Изучаемые показатели коррелировали с массивностью патологического процесса, повреждением структур мозга в виде ишемии III степени и внутрижелудочковых крово­излияний II-III степени с последующим развитием гидроцефалии, перивентрикулярной лейкомаля- ции, кистозной дегенерацией и атрофией.

 

 

Рис. 1. Динамика показателей IL-1? в крови у детей в неонатальном периоде с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы

 

Рис. 2. Динамика показателей TNFa в крови у детей в неонатальном периоде с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы

Рис.3. Динамика показателей К-4 в крови у детей в неонатальном периоде с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы

У детей 3-й группы достоверно (p < 0,05) от­мечалось снижение IL-6 по сравнению с группой здоровых детей в течение первых трех дней жизни и в дальнейшем повышение к 5-7 суткам с незначи­тельным снижением к концу неонатального перио­да. Аналогичные тенденции снижения уровня IL-6 наблюдались у детей 2-й группы в первые 3 дня жизни, и к 28 суткам показатели оставались ниже нормативных значений. Возможно, это связано с повышенной экспрессией рецепторов эндотелиальными клетками и способствует снижению их уровня в кровотоке. Учитывая, что у наблюдаемых детей не было инфекционного воспалительного процесса, уровень IL-6, участвующего в патогенезе воспаления и выделении белков острой фазы, не имел высоких значений (рис. 4).

Результаты кариометрии лимфоцитов показали, что чем ниже показатели оптической плотности ядер лимфоцитов периферической крови новорож­денных, тем тяжелее церебральные нарушения (рис. 5). В 1-й группе у детей с легким поражением ЦНС на 5-7-е сутки жизни отмечалось увеличение среднего количества ДНК и нормализация показа­телей к 28 дню жизни. У новорожденных 2-й и 3-й групп в первые трое суток жизни определялось достоверное снижение (p < 0,001) среднего коли­чества ДНК в ядрах лимфоцитов почти в 3 раза по сравнению с группой здоровых детей. К 28 дню жизни значения этих показателей не нормализо­вались.

Динамическое исследование состояния цитокинового профиля и кариометрия лимфоцитов показали наличие отрицательной связи во 2-й и 3-й группах наблюдения между показателями интерлейкинов IL-1 в, TNFa и количественным содержа­нием ДНК в ядрах лимфоцитов (г = -0,32 и r = -0,58, соответственно) в течение неонатального периода. Возможно, эта связь отражает отсутствие адапта­ционных механизмов у детей со среднетяжелой и тяжелой формой гипоксического поражения ЦНС. Не исключено, что высокие уровни IL-1P и TNFa оказывают повреждающее действие на ДНК лим­фоцитов на фоне гипоксии.

Таким образом, динамическое исследование цитокинового профиля (IL-1P, IL-4, IL-6, TNFa) позволяет определить не только концентрацию этих медиаторов в крови и общую реакцию им­мунной системы, но и оценить характер течения патологического процесса в зависимости от степени тяжести гипоксии.

 

Рис. 4. Динамика показателей К-6 в крови у детей в неонатальном периоде с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы

 

Рис. 5. Динамика средних величин оптической плотности ядер лимфоцитов (кариометрия) в зависимости от степени тяжести гипоксического поражения центральной нервной системы у новорожденных

У новорожденных со среднетяжелой и тяже­лой формами гипоксического поражения ЦНС в остром периоде (1-е-28-е сутки) наблюдается повышение уровня IL-1P, IL-4, TNFa, снижение IL-6 в первые трое суток жизни и количественного содержания ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови. Не исключено, что цитокины, обладающие высокой биологической активностью, даже в минимальных концентрациях оказывают регулирующее влияние на процессы репарации и повреждения ДНК иммунокомпетентных клеток. Возможно, опосредованное цитокинами снижение ДНК лимфоцитов в условиях гипоксии нарушает трансформацию пролимфоцитов в полноцен­ные лимфоциты (иммунокомпетентные клетки), участвующие в иммунных реакциях и процессах клеточного энергетического метаболизма ЦНС.

Цитокины при перинатальной гипоксии

ЛИТЕРАТУРА

Автандилов Г.Г. Перспективы развития диагностической морфометрии. Диа­гностическая медицинская морфометрия. — М.: РМАПО. — 2002. — С. 4-24.

Володин Н.Н., Рогаткин С.О., Медведев М.И. Актуальные проблемы пери­натальной неврологии на современном этапе // Ж. неврол. психиатр. им. С.С. Корсакова. — 2001. — Т. 101, № 7 — С. 4-9.

Дегтярева М.В., Дегтярев Д.Н., Володин Н.Н. и др. Роль интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли у новорожденных в норме и патологии // Педиат­рия. — 1996. — № 1. — С. 93-97.

Ларионова А.В., Беликова М.Э., Чаша Т.В. Цитокиновый профиль у новорож­денных с перинатальными поражениями центральной нервной системы // Мат. 7-го Росс. форума «Мать и дитя». — М., 2005. — С. 556-557.

Патрушев Л.И. Экспрессия генов. — М.: Наука. — 2000. — 527с.

Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз и цитокины // Усп. соврем. биол. — 1999. — Т. 119, № 4. — С. 359-367.

Рожнова У.С., Алексеенко А.В. Функциональная активность фактора некроза опухоли альфа (TNFa) - в центральной нервной системе // Нейрохимия. — 1999. — Т. 16, № 2. — С. 118-132.

BickLer P.E., Donohoe P.H. Adaptive responses of vertebrate neurons to hypoxia // J. Exp. BioL. 2002. — VoL. 205, pt. 23. — P. 3579-3586.

Sternberg E.M. NeuraL-immune interactions in health and disease // J. CLin. Invest. — 1997. — VoL. 100, № 11. — P. 2641-2647.

Investigation of the cytokine profile and quantitative value of DNA in nuclei of blood lymphocytes of the newborns with perinatal hypoxic lesion of the central nervous system N.E. Gromada

The Ural State Medical Academy, Ekaterinburg

A study of the contents of cytokines (interleukin 1p, 4, 6, tumor necrosis factor alpha) in blood from 75 newborns at the age of 1-3, 5-7, and 28th day of life with perinatal hypoxic defeat of the central nervous system. Average DNA content in the nuclei of lymphocytes was evaluated by karyometry. An imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines was revealed and the relationship between cytokine levels and DNA content in the nuclei of lymphocytes with the perinatal hypoxia severity. (Cytokines and Inflammation. 2008. Vol. 7, № 3. P. 14-18.)

Key words: newborns, perinatal hypoxia, cytokines, karyometry.



загрузка...