Реакция мононуклеарных клеток на фетальные протеины и результаты патогистологического исследования злокачественных новообразовании в легком и молочной железе
Реакция мононуклеарных клеток на фетальные протеины и результаты патогистологического исследования злокачественных новообразовании в легком и молочной железе
Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск
Изучены показатели реакции мононуклеарных клеток (МНК) на фетальные протеины (ФП) у 105 больных злокачественными новообразованиями легких и молочной железы, и проведено их сопоставление с патогистологическими особенностями опухоли, которым была дана балльная оценка. При возрастании относительного содержания CD8+-лимфоцитов после инкубации МНК с ФП на 15% и более в опухолях преобладали высокодифференцированные клетки, а встречаемость патологических митозов была низкой. Чаще встречалась I, реже II степени злокачественности. При преобладании в опухолях низко- и умереннодифференцированных клеток, встречаемость патологических митозов возрастала. Чаще встречались II и III степени злокачественности. В этих случаях реакция МНК на ФП не наблюдалась. На основе полученных результатов исследования могут быть разработаны методы ранней диагностики злокачественных новообразований. (Цито- кины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 16-23.)
По данным Минздрава РФ, рак легкого (РЛ) по распространенности лидирует среди других онкологических заболеваний человека, а рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин [5].
Образование злокачественной опухоли сопровождается целым рядом структурных и функциональных изменений, которые отличают ее от нормальной ткани. Одним из признаков, характеризующих опухоль, является экспрессия фетальных протеинов (ФП), относящихся к опухолеассоциированным антигенам [8].
В предыдущих работах нами была изучена реакция лимфоцитов на опухолеассоциированные антигены у больных РЛ и РМЖ, где было показано увеличение относительного содержания клеток, экспрессирующих CD8-антиген, после инкубации мононуклеарных клеток (МНК) с ФП [2, 3].
Целью настоящей работы явилось сопоставление показателей реакции МНК на ФП с содержанием популяций и субпопуляций лимфоцитов и патогистологической картиной опухоли у больных РЛ и РМЖ.
Обследовано 105 больных злокачественными новообразованиями, из них РЛ был у 75 человек в возрасте от 30 до 75 лет и РМЖ — у 30 пациенток в возрасте от 38 до 79 лет. В контрольную группу вошли 17 здоровых лиц, не имеющих в анамнезе указаний на онкологические заболевания.
Центральная форма РЛ диагностирована у 54 (72 %) пациентов, периферическая—у 21 (28%) человека. Изменения в легких обнаружены у 29 пациентов (38,6%) при проведении профилактического флюорографического исследования, у остальных 46 (61,4 %) — при обращении за врачебной помощью. Бронхолегочно-плевральный синдром был выявлен у 56 (74,7 %) больных, синдром интоксикации различной степени выраженности у 15 (20%) больных. По результатам патоморфологического изучения резецированной опухоли плоскоклеточный рак легкого диагностирован у 50 (66,7 %) человек, аденокарцинома — у 25 (33,3 %) больных.
РМЖ у 24 (80 %) пациенток был выявлен при обращении к врачу, у остальных 6 (20 %) — при проведении профилактического осмотра. По гистологическому строению у всех больных был выявлен инфильтративный протоковый рак.
До оперативного вмешательства больные со злокачественными новообразованиями не подвергались лучевой химиотерапии.
Определение относительного содержания популяций и субпопуляций лимфоцитов проводили методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител серии ИКО (НПЦ «Медбиоспектр», Москва) в соответствии с прилагаемыми рекомендациями. В работе использованы моноклональные антитела: ИКО 90 — маркер зрелых Т-лимфоцитов ^3+-кпет- ки), ИКО 86— маркер Т-хелперов/индукторов ^4+-клетки), ИКО 31 — маркер Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов ^8+-клетки), ИКО 180 — маркер В-лимфоцитов (CD20+- клетки), ИКО 116 — маркер натуральных киллеров ^16+-клет- ки), ИКО 160 — маркер клеток, имеющих FAS-антиген ^95+-клетки), ИКО 105 — маркер клеток, имеющих рецептор к IL-2 ^25+-клетки), ИКО 92— маркер клеток, имеющих рецептор к трансферрину ^71+-клетки), ИКО 20 — маркер активированных Т- и В-клеток ^38+-клетки).
В качестве опухолеассоциированных антигенов применяли ФП в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащие раковоэмбриональный антиген — 84 МЕ/мл, хорионический гонадотропин человека —170 МЕ/мл, нейронспецифическую енолазу— 1,35 МЕ/ мл, углеводные антигены — СА-19-9 — 144 МЕ/мл и СА 125 — 512 МЕ/мл, альфа-фетопротеин —172 МЕ/мл и микроглобулин человека— 4 МЕ/мл. Оценку реакции на ФП проводили в соответствии с патентом № 2118819 по изменению относительного содержания CD8+-лимфоцитов после инкубации МНК с ФП (100 мкл, исходная концентрация белка 2,5 мг/мл) in vitro в течение 1 ч по сравнению с контрольной пробой, содержащей вместо ФП 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия.
Для подтверждения специфичности реакции параллельно инкубировали МНК с раствором бычьего сывороточного альбумина по указанной выше технологии и в той же концентрации по белку.
Позитивной считалась реакция, при которой относительное содержание CD8+-лимфоцитов повышалось после инкубации МНК с ФП на 15 % и более по сравнению с соответствующей контрольной пробой [4]. Во всех остальных случаях реакция считалась негативной. Пороговое значение достоверности реакции на ФП, равное 15%, превышает допустимый предел ошибки [6].
После хирургического вмешательства проводилось гистологическое исследование резецированного материала, окрашенного по стандартной методике гематоксилином-эозином. Патогистологическая картина характеризовалась следующими признаками, которым была дана балльная оценка:
границы опухоли с окружающей тканью: четкие — 1 балл; наряду с четкими границами имеются крупные участки ответвления — 2 балла; наряду с четкими границами опухолевого узла имеются мелкие тонкие тяжи — 3 балла; четкость границ отсутствует, имеется диффузный рост опухоли — 4 балла;
наличие опухолевых клеток в сосудах (ОКС): опухолевых клеток в сосудах нет— 1 балл; наличие опухолевых клеток в сосудах сомнительно — 2 балла; единичные клетки в сосудах — 3 балла; много клеток в сосудах — 4 балла;
число митозов в поле зрения: отсутствуют — 1 балл; единичные — 2 балла; 2-3 — 3 балла; 4-5 — 4 балла; 6-10 — 5 баллов; более 10 — 6 баллов;
патологические митозы: отсутствуют—1 балл; единичные — 2 балла; в большом количестве — 3 балла;
наличие в опухоли клеточных элементов различной степени дифференцировки: высокодифференцированные (ВД) — 1 балл; умереннодифференцированные (УД) —
балла, низкодифференцированные (НД) — 3 балла;
степень злокачественности: I степень — 1 балл; II степень — 2 балла; III степень — 3 балла;
метастазы (МТС) в регионарных лимфоузлах: нет—0 баллов, есть — 1 балл.
Таким образом, сумма баллов указанных выше признаков является интегральным показателем патогистологической картины опухоли.
Кроме того, учитывали частоту встречаемости опухолевых клеток различной степени зрелости (%), а также их соотношения (НД/УД, НД/ВД, УД/ВД). Для этого с помощью морфометрической сетки с 121 рабочими точками-узлами, вставленной в окуляр микроскопа, при увеличении 20 х 1,5 х 10=300 методом случайного наложения сетки на опухолевую ткань подсчитывали количество точек, попавших на высоко-, умеренно- и низкодифференцированную опухолевую ткань. В каждом случае подсчитывали среднее арифметическое значение, выраженное в процентах [1]. По общепринятым критериям оценивали степень злокачественности опухоли [7].
Указанные выше признаки, представленные в числовых значениях, позволили выявить взаимосвязь между показателями реакции лимфоцитов на ФП и патогистологической картиной опухоли.
Результаты исследований обработаны статистически с использованием критериев Стьюдента (Ц, Вилкоксона — Манна — Уитни (и) и коэффициента корреляции (г) по программе StatGraphicsPLus.
Данные по относительному и абсолютному содержанию популяций и субпопуляций лимфоцитов у больных РЛ и РМЖ при позитивной и негативной реакциях МНК на ФП.
Следовательно, при позитивной реакции МНК на ФП отмечается как слабая (у больных РЛ), так и более выраженная активация иммунной системы (у больных РМЖ).
При сопоставлении показателей популяций и субпопуляций лимфоцитов с патогистологической картиной видно (табл. 3), что корреляционные связи могут быть как прямыми, так и обратными. Необходимо подчеркнуть, что достоверные обратные корреляционные связи отмечаются у больных РЛ и РМЖ между содержанием CD25+-лимфоцитов и митозами, патологическими митозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток в опухоли.
В целом же, отмечена достоверная обратная корреляционная связь между клетками с маркерами активации (CD25+, CD71+, CD95+) и показателями, отражающими степень злокачественности опухоли, что подтверждается прямой корреляционной связью между выше указанными лимфоцитами и процентным содержанием ВД клеток в опухоли.
Прямая корреляционная связь выявлена между содержанием CD20+-лимфоцитов (В-клетки) и митозами, степенью злокачественности, процентным содержанием НД клеток, соотношениями НД/УД, НД/ВД, УД/ВД, что подтверждается обратной корреляционной связью между указанными выше лимфоцитами и процентным содержанием ВД клеток в опухоли. Что касается CD16+-лимфоцитов, то достоверная обратная корреляционная связь выявлена между ними и соотношением УД/ВД, что может явиться косвенным признаком более низкой степени злокачественности опухоли.
Наиболее значимые корреляционные связи между уровнем прироста (%) относительного содержания CD8+-лимфоцитов после инкубации МНК с ФП и показателями патогистологической картины у больных РЛ и РМЖ представлены в табл. 4. Как видно из таблицы, при РЛ достоверная обратная корреляционная связь отмечается между процентом прироста CD8+- клеток после инкубации МНК с ФП и следующими показателями патогистологической картины: ОКС, митозами и патологическими митозами. Достоверная прямая корреляционная связь наблюдалась только с процентным содержанием ВД клеток в опухоли. При РМЖ достоверная обратная корреляционная связь установлена с патологическими митозами, вариантом дифференцировки опухоли, процентным содержанием НД и УД клеток. Достоверная прямая корреляционная связь выявлена между процентом прироста CD8+-клеток после инкубации МНК с ФП и процентным содержанием ВД клеток.
Проведенные исследования показали, что увеличение процента прироста CD8+-лимфоцитов после инкубации МНК с ФП коррелирует с показателями патогистологической картины, свойственными более низкой степени злокачественности опухоли при РЛ и РМЖ.
Представленные в настоящей статье результаты исследования могут иметь прямой выход в практику, т. к. от своевременного определения степени злокачественности опухоли зависит характер лечения больных и его эффективность.
ЛИТЕРАТУРА
Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1999. — 382 с.
Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Столярова В.М., Михайлова Е.С. Реакция лимфоцитов и гуморальный иммунный ответ на опухолеассоциированные антигены у онкологических больных // Бюллетень СО РАМН. — 1999. — № 3-4. — С. 60-63.
Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Сидоров С.В. и др. Реакция лимфоцитов на фетальные протеины у больных раком молочной железы // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 4-й конгресс РААКИ. — М., 2001. — Т. 2. — С. 43.
Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Сидоров С.В. Ответ лимфоцитов больных фиброаденоматозом и раком молочной железы на опухолеассоциированные антигены in vitro // Иммунология. — 2003. — № 1. — С. 26-28.
Злокачественные новообразования в России 1998 г. / Под ред. В.И. Чиссо- ва, В.В. Старинского. — М.: Медицина, 1999. — 237 с.
Леонова Т.Я., Степанова Е.Г. Контроль качества лабораторных исследований (методические рекомендации для врачей-лаборантов). — Новосибирск, 1993. — 23 с.
Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. Руководство для врачей / Под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. — М.: Медицина, 1993. — 512 с.
Lee T.V., AndersonB.W., Peoples G.E. et al. Identification of activated tumor antigen-reactive CD8+ cells in healthy individuals // Oncol. Rep. — 2000. — Vol. 7. — № 3. — P. 455-466.