загрузка...
 
Сравнительная оценка уровня 17 цитокинов в сыворотке и цельной крови здоровых доноров методом проточной флюориметрии
Повернутись до змісту

Сравнительная оценка уровня 17 цитокинов в сыворотке и цельной крови здоровых доноров методом проточной флюориметрии

А.А. Останин, Е.Р. Черных

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Целью исследования было определение нормативных значений цитокинового статуса на основе сравнительной оценки содержания 17 цитокинов (IL-ip, TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-ip) в сыворотке и цельной крови здоровых доноров как на уровне спонтанной продукции, так и при митогенной стимуляции бактериальным эндотоксином и конканавалином А. Выявлена индивидуальная вариабельность сывороточного уровня IFNy, IL-13, IL-ip, TNFa, MIP-ip, G-CSF и GM-CSF, а также достоверная обратная корреляционная взаимосвязь между возрастом обследованных доноров и содержанием в сыворотке IFNy, TNFa, IL-12, IL-7 и GM-CSF. При сравнительном анализе доноров до 30 лет (в среднем 24 года) и старше 43 лет (в среднем 48 лет) установлено, что лица старшей возрастной группы характеризуются более низким сывороточным уровнем провоспалительных (IL-ip, TNFa), Thi- (IFNy), ^2-цитокинов (IL-i3) и факторов иммуногемопоэза (IL-7, GM-CSF). Показано, что исследования спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в 24-часовых супернатантах цельной крови повышают информативность оценки цитокинового статуса человека. Полученные значения уровней цитокинов in vivo и ex vivo, детально представленные в виде М ± S.E., median и диапазона min-max, могут использоваться в качестве нормативной базы в дальнейших исследованиях. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 25-32.)

Ключевые слова: цитокины человека, сыворотка, цельная кровь, Bio-PLex.

 

Для заинтересованного читателя, который обращается к такому специализированному журналу, как «Цитокины и воспаление», наверное, нет необходимости подробно объяснять во введении важность и актуальность изучения роли цитоки- нов в регуляции иммунного ответа, гемопоэза, воспаления и т. д. и тем самым превращать данный раздел статьи в «ритуальную молитву». О неослабевающем интересе к системе цитокинов свидетельствуют тысячи оригинальных и обзорных работ, ежегодно публикуемых в современной научной периодике. Бесспорно, что за последние 10-20 лет наши представления о структуре и организации цитокиновой сети, об особенностях функционирования ее регуляторных подсистем в норме и при различных иммунопатологических состояниях значительно расширились [3, 7]. Однако нельзя не отметить одну очень важную проблему. Парадоксально, но, несмотря на то, что количество детально охарактеризованных цитокинов постоянно растет, значения физиологической нормы для многих из них до сих пор не установлены. Поэтому иногда очень трудно, а иногда и невозможно корректно оценить особенности цито- кинового профиля в том или ином конкретном клиническом случае, хотя и считается, что оценка уровня цитокинов в различных биологических материалах (сыворотке, цельной крови, культуральных супернатантах и т.д.) должна занять центральное место среди современных методов иммунодиагностики [1, 10].

С появлением в арсенале иммунологических лабораторий автоматизированного анализатора нового поколения (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA), который проводит одномоментное количественное определение до 100 различных белков и пептидов в тестируемом образце, появилась надежда на улучшение существующего по
ложения. В частности, в настоящее время разработаны коммерческие тест-системы для определения 17 цитокинов человека. Поскольку ряд цитокинов из предложенной панели ранее был недоступен для лабораторного тестирования, представлялось важным при проведении дальнейших исследований сначала определить их нормативные значения. Поэтому целью настоящей работы явилась сравнительная оценка содержания 17 цитокинов, относящихся к различным, функционально значимым группам, в сыворотке и в цельной крови здоровых доноров, как в режиме спонтанной продукции, так и при митогенной стимуляции.

Материалы и методы

В исследование были включены 39 практически здоровых доноров крови, представленных лицами обоего пола (20 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 20 до 58 лет (средний возраст 37 ± 2 лет). Периферическую кровь забирали разовым шприцем из локтевой вены и инкубировали в стерильной пробирке

ч при комнатной температуре и 1 ч при 4°С. Затем, после центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 мин, собирали сыворотку, которую замораживали и хранили до тестирования при -20°С.

Подпись: Группы цитокинов	Цитокины	М	±	S.E.	Median	Min-max
Thl-цитокины	IFNy	23,7	±	4,6	12,5	1,0-98,8
	IL-2	1,4	±	0,2	1,0	0
1
9
	IL-4	1,3	±	0,1	1,0	0
1
7
	IL-5	1,4	±	0,1	1,4	1,0-3,5
Т1п2-цитокины	IL-6	3,3	±	0,6	1,0	1,0-15,5
	IL-10	4,3	±	0,4	3,9	1,0-10,5
	IL-13	4,
1	±	1,5	15,4	1,0-43,3
	IL-10	20,3	±	2,5	17,5	2,4-83,7
Провоспалительные	TNFa	18,0	±	2,4	14,5	1,0-58,5
цитокины	IL-12 (p70)	6,3	±	1,0	5,6	1,0-17,7
	IL-17	7,2	±	1,1	7,8	1,0-18,3
Факторы
иммуногемопоэза	IL-7	3,4	±	0,6	2,9	0
1
9
	G-CSF	4,4	±	1,3	1,0	1,0-44,9
	GM-CSF	,8
8,
3	±	10,0	1,0	1,0-231,9
	IL-8	1,9	±	0,2	1,5	,3
5
-
,0
1
Хемокины	MIP-1P	,9
1
3	±	3,7	30,8	5,0-116,6
	MCP-1		<1	<1	<1
Дополнительно у 11 доноров (5 мужчин и 6 женщин, в возрасте от 23 до 42 лет) часть венозной крови добавляли в стерильную пробирку, содержащую гепарин (20 ЕД/мл), и тщательно перемешивали. Затем 1 мл цельной гепаринизиро- ванной крови смешивали с 4 мл среды RPMI-1640 (Sigma, USA), дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 5мМ HEPES-буфера и 100 мкг/мл гентамицина, т.е. кровь разводили в 5 раз. Подготовленные таким образом образцы крови (по 1 мл) культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии липополисахарида (ЛПС, Escherichia coli 0111:B4 (Sigma), в конечной концентрации 10 мкг/мл) или конкана- валина А (КонА, Sigma, в конечной концентрации 15 мкг/мл), а также в отсутствие митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 24 ч, после чего осторожно отбирали супернатанты (аликвотами по 0,2 мл) и хранили полученные образцы при -20 °С до тестирования. В данной подгруппе доноров в день гемоэксфузии на гемоанализаторе «HEMA-Screen 13» (Швейцария-Ита- лия) проводился общий анализ крови с целью определения абсолютного количества мононуклеарных клеток (лимфоцитов и моноцитов).

Содержание в сыворотке, а также в супернатантах цельной крови 17 цитокинов (IL-1P, TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,

IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF,

GM-CSF, МСР-1, MIP-1P) оценивали методом проточной флюориметрии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-PLex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя [6, 15]. Анализ содержания цитокинов проводили тремя независимыми экспериментальными сериями, при этом значения цитокинов, как в стандартных калибровочных разведений, так и в тестируемых образцах, были хорошо воспроизводимы. Сывороточную концентрацию цитокинов выражали в пкг/мл, тогда как уровень продукции цитокинов в цельной крови пересчитывали индивидуально с учетом абсолютного количества мононуклеарных клеток (МНК) и выражали в пкг/мл/106 МНК.

Математическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ «Statistica 5.0». Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона—Манна—Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции по Спирману. При статистической обработке значения цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода (< 2 пкг/мл), принимали за 1 пкг/мл.

Результаты и обсуждение

Для удобства восприятия материала анализируемые 17 цитокинов были отнесены к нескольким подгруппам (табл. 1). Однако, учитывая полифункциональность многих цитокинов, а также возможность их продукции различными типами клеток, была хорошо понятна относительная условность такого разделения. Так, например, ^1- и ^2-цитокины продуцируются не только CD4+ ^хелперами, но также CD8+

Т-лимфоцитами и другими субпопуляциями клеток [23, 24, 26]. Дополнительно могла быть выделена и подгруппа противовоспалительных цитокинов, куда с полным правом могли войти 1Ъ-10 и 1Ъ-13. В свою очередь, подгруппа про- воспалительных цитокинов могла быть дополнена хемокинами, а также 1Ъ-6, который, как известно, вместе с 1Ъ-1р выступает в качестве индуктора острофазового ответа, но, с другой стороны, может проявлять и альтернативные (противовоспалительные и иммуносупрессорные) свойства [30].

Оценка уровня цитокинов в сыворотке здоровых доноров показала (см. табл. 1), что, в целом по группе, концентрация большинства тестируемых цитокинов находится на нижней границе чувствительности метода и варьирует от 1 до 10-20 пкг/мл. В то же время для отдельных цитокинов, таких как №N7, 1Ъ-13, 1Ь-1р, TNFa, М1Р-1Р, G-CSF и GM-CSF, была выявлена более широкая вариабельность индивидуальных значений (от 1 до 100-200 пкг/мл), которые, тем не менее, имели нормальный характер распределения в исследуемой группе. В этом случае, а также при столь широком разбросе минимальных и максимальных значений, уровень цитокинов более точно отражается показателями медианы, чем соответствующими средними значениями (М ± SE). В табл. 1 видно, что из всей панели тестируемых цитокинов в сыворотке здоровых доноров отчетливо выявлялись только №N7 (медиана 12,5), 1Ъ-13 (медиана 15,4), 1Ъ-1р (медиана 17,5), TNFa (медиана 14,5) и М1Р-1Р (медиана

пкг/мл), тогда как средний уровень остальных цитокинов, включая G-CSF и GM-CSF, был «минорным» и варьировал от 1 до 7,8 пкг/мл.

Подпись: Группы цитокинов	Цитокины	Уровни (пкг/мл)	и частота встречаемости в группе
		Низкий	Средний	Высокий
Т1п1-цитокины		<25 64 % (25/39)	25-74 23 % (9/39)	> 74 13 % (5/39)
Т1п2-цитокины	К-13	< 12 38,5 % (15/39)	і2-33 56,5 % (22/39)	>33 5 % (2/39)
Провоспалительные	а-ір	< 22 59 % (23/39)	22-63 38,5 % (15/39)	> 63 2,5 % (1/39)
цитокины	TNFa	<15 51,5 % (20/39)	15-44 43,5 % (і7/39)	>44 5 % (2/39)
Факторы	G-CSF	<12 90% (35/39)	12-34 7,5 % (3/39)	> 34 2,5 % (1/39)
иммуногемопоэза	GM-CSF	< 58 79,5 % (31/39)	58-17 413 % (5/39)	> 174 7,5 % (3/39)
СС-хемокины	мір-ір	<33 54% (21/39)	33-88 41 % (16/39)	> 88 5 % (2/39)
В процессе математической обработки полученных результатов для цитокинов, характеризующихся наиболее широким диапазоном минимальных и максимальных значений, были выделены пороговые уровни низкого, среднего и высокого содержания соответствующих ци- токинов и проведен анализ частоты их встречаемости в исследуемой группе.

Данные, представленные в табл. 2, показывают гетерогенность популяции здоровых доноров. При этом, например, высокие сывороточные концентрации №N7 или GM-CSF обнаруживались соответственно в 13 и 7,5 % случаев, а повышенный уровень 1Ъ-13, TNFa, М1Р-1Р, 1Ъ-1р или G- CSF регистрировался с частотой 2,5-5 %.

Выявленная гетерогенность могла быть обусловлена индивидуальными особенностями обследованных лиц, например, их полом или возрастом. Однако нами не было обнаружено каких-либо значимых различий в уровне цитокинов в подгруппах доноров-мужчин (п = 20) и доноров-женщин (п = 19, данные не представлены). В то же время, проведенный корреляционный анализ показал наличие достоверной обратной взаимосвязи между возрастом доноров и концентрацией в сыворотке №N7 (г, = -0,5; р < 0,01), TNFa (г, = -0,44; р < 0,01), 1Ъ-12 (г., = -0,55; р < 0,05), 1Ъ-7 (г, = -0,6; р < 0,05) и GM-CSF (г, = -0,38; р < 0,05). Для того чтобы более точно оценить возрастные особенности исследуемых параметров, были выделены две оппозитные подгруппы доноров до 30 и старше 43 лет. Средний возраст обследованных лиц в первой подгруппе составил 24 года, во второй — 48 лет (табл. 3). При сравнительном анализе было установлено, что практически здоровые доноры старшей возрастной группы характеризуются более низким уровнем провоспали- тельных (1Ъ-1р, TNFa), ТЫ- (№N7) и №2-цито- кинов (1Ъ-13), факторов иммуногемопоэза (1Ь-7, GM-CSF). Выявленный факт позволяет предположить, что с возрастом в организме человека, даже при отсутствии каких-либо клинических проявлений той или иной патологии, формируется недостаточность и/или дисбаланс отдельных цитокинов, участвующих в регуляции иммунных реакций, а также в организации воспалительного ответа.

В целом же, анализ уровня цитокинов в сыворотке крови здоровых доноров показал, что вследствие относительно низкой их концентрации в системном кровотоке данные показатели могут быть в
группу вошли 11 здоровых доноров, представленных лицами обоего пола в возрасте от 23 до 42 лет.

Подпись: Параметры		Подгруппы доноров	Ри
		< 30 лет (n = 11)	> 43 лет (n = 12)	
Возраст (лет)		24,6 ± 0,9 (20-30)	48 ± 1,6 (43-58)	< 0,001
Пол (муж./жен.)		54,5 % / 45,5 %	50 % / 50 %	
Thl-цитокины (пкг/мл)	IFNy	48 ± 10	13,0 ± 5,0	< 0,01
Т1п2-цитокины (пкг/мл)	IL-13	22,0 ± 2,8	14,3 ± 2,3	< 0,05
Провоспалительные	TNFa	27,5 ± 5,0	11,5 ± 3,2	< 0,01
цитокины (пкг/мл)	IL-12	10,1 ± 1,7	4,1 ± 1,0	< 0,05
Факторы иммуногемо-	IL-7	5,5 ± 1,0	2,4 ± 0,5	< 0,05
поэза (пкг/мл)	GM-CSF	83 ± 25	21 ± 15	< 0,05
Из данных табл. 4 видно, что в условиях суточной инкубации клетки крови активно продуцируют цитокины из всех анализируемых функциональных групп. По сравнению с сывороточным уровнем регистрируется значимый прирост Th1- (IFNy, IL-2) и Th2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6), провоспалительных цитокинов (TNFa, IL-17), G-CSF и хемокинов (IL-8, МСР-1, MIP-1P). Следует отметить, что наиболее выраженные изменения отмечались в содержании IL-6, IL-8 и MCP-1, которые в сыворотке регистрировались лишь в «следовых» количествах (1-2 пкг/мл), тогда как в супернатантах цельной крови их концентрация увеличивалась до 228, 792 и 122 пкг/мл/106 МНК, соответственно. Прирост других цитокинов, за исключением MIP-1P, был менее значительным, хотя и статистически достоверным. Характерно, что широкая вариабельность индивидуальных значений, выявленная для отдельных цитокинов на сывороточном уровне (IFNy, IL-13, IL-1 в, TNFa, MIP-10, G-CSF, GM-CSF), сохранялась и даже усиливалась в отношении их

Не менее выраженный разброс минимальных и максимальных значений отмечался также и для цитокинов, активная продукция которых регистрировалась только в цельной крови (IL-6, IL-8, MCP-1). Поскольку в анализируемой подгруппе доноры были достаточно однородны по возрасту (не старше 42 лет), а также в равной степени представлены мужчинами и женщинами, обоснованно было предположение, что в этом случае выявленная гетерогенность в большей степени обусловлена генетическими особенностями отдельных индивидов. В настоящее время четко установлено, что характер секреции цитокинов во многом зависит от аллельного полиморфизма кодирующих их генов. Так, наличие различных аллельных вариантов генов показано для TNFa, IL-1a, IL-1 в, IL-2, IL-10, IFNy, IL-6, а также для многих других цитокинов и их рецепторов [12, 14, 25, 28, 29]. При этом хорошо известно, что практически все гены цитокинов являются индуци- бельными, поэтому не удивительно, что наиболее ярко те или иные особенности организации и функционирования цитокиновой сети в норме, а также при иммунопатологических состояниях могут быть выявлены в условиях активации имму- нокомпетентных клеток.

Сравнительный анализ спонтанной и митоген- индуцированной продукции цитокинов в цельной крови здоровых доноров показал (табл. 5), что профиль цитокинов, секретируемых ex vivo, в ответ на стимуляцию эндотоксином и конканавалином А во многом идентичен, хотя и имеет определенные особенности. Видно, что в обоих случаях суточная инкубация цельной крови с ЛПС или КонА приводит к достоверному увеличению уровня IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa и IL-12. В то же время, значимое усиление продукции IL-1P, G-CSF, GM-CSF и IL-8 характерно исключительно для ЛПС, тогда как МСР-1 — для активации КонА. Однако следует отметить, в отличие от интенсивности вышеперечисленных цитокинов, интенсивность секреции IL-5, IL-7, IL-17, и MIP-ip в стимулированной цельной крови сохранялась на уровне спонтанной продукции и значимо не изменялась в ответ на активацию как ЛПС, так и КонА. Сравнительный анализ выраженности стимулирующих эффектов митогенов показывает, что эндотоксин характеризуется более сильным влиянием на продукцию IFNy, IL-4, IL-6 и TNFa, тогда как влияние КонА на уровень секреции IL-2 в

раза выше, чем у ЛПС.

В целом, проведенные исследования содержания 17 цитокинов в сыворотке здоровых доноров, а также уровня их спонтанной и митоген-индуци- рованной продукции ex vivo позволили нам решить не только «утилитарную» задачу по определению нормативных значений цитокинового статуса, но и показали, что у здорового человека сложная, многокомпонентная система цито- кинов как в состоянии относительного «покоя» in vivo, так и в условиях активационных воздействий ex vivo характеризуется физиологическим равновесием регуляторных подсистем. В сыворотке концентрация большинства исследованных нами цитокинов находится на минимальном уровне, что подтверждается и другими работами [1, 4, 34]. Только отдельные провоспалитель- ные и ТЫ-цитокины (IL-1P, TNFa и IFNy), а также MIP-1P (CC-хемокин) отчетливо регистрируются в диапазоне 10-30 пкг/мл. Можно предположить, что в организме здорового человека они выполняют некую «сторожевую» функцию, поскольку хорошо известно, что именно эти цито- кины являются медиаторами «первой волны», ответственными за запуск и организацию защитных реакций врожденного и адаптивного иммунитета [11]. Тем не менее, активность «триггерных» цитокинов, по-видимому, находится под определенным негативным контролем и сбалансирована на системном уровне циркулирующим IL-13 (медиана 15,4 пкг/мл), который функционально относится к группе №2-цитокинов и характеризуется выраженным противовоспалительным и иммунорегуляторным действием [18, 24]. В таком же контексте, по-видимому, следует рассматривать имеющиеся данные о повышенном содержании в сыворотке здоровых лиц рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra) и растворимых рецепторов TNF (sTNFr-I, sTNFr-II) [5, 17].

В группе обследованных доноров нами была выявлена широкая вариабельность (от 1 до 100-200 пкг/мл) индивидуальных значений сывороточного уровня отдельных цитокинов, а именно IL-1ß, TNFa, IFNy, IL-13, MIP-1ß, G-CSF и GM-CSF. Подобная вариабельность хорошо документирована и обычно объясняется генетическими особенностями отдельных индивидов, связанными с аллельным полиморфизмом генов цитокинов [35]. К сожалению, в нашем исследовании не оценивался характер распределения аллельных вариантов генов цитокинов. Тем не менее, нами была выявлена четкая обратная корреляционная взаимосвязь между возрастом (но не полом) доноров и концентрацией отдельных ци- токинов с различной функциональной активностью. Так, при сравнительном анализе доноров, чей средний возраст различался в 2 раза и составлял, соответственно, 24 и 48 лет, было установлено, что лица старшей возрастной группы характеризуются более низким сывороточным уровнем про- воспалительных (IL-1ß, TNFa), Th1- (IFNy) и Th2- цитокинов (IL-13), факторов иммуногемопоэза (IL-7, GM-CSF). Вероятно, именно эти онтогенетические особенности организации и функционирования цитокиновой сети, проявляющиеся количественным дефицитом и/или дисбалансом отдельных регуляторных факторов, во многом обусловливают те или иные изменения клеточного и гуморального звена иммунитета, которые обычно обнаруживаются у людей старшего и пожилого возраста [13, 16, 20, 27, 33].

Полученные нами результаты показывают, что уровни цитокинов в сыворотке крови отражают текущее состояние иммунной системы и в комбинации с другими показателями могут иметь определенную диагностическую ценность, особенно при мониторинге состояний, связанных с гиперпродукцией цитокинов. Однако в ситуациях, сопряженных с дефицитом или дисбалансом регуляторных факторов или когда нужно оценить функциональный резерв системы, измерение сывороточного уровня цитокинов может оказаться малоинформативным, поскольку «референтные» величины физиологического контроля исходно находятся на нижней границе разрешающей способности существующих методов тестирования (ИФА или Bio-Plex анализа, электрохемилюми- несценции и т.д.). В этом случае более адекватным подходом является оценка уровня спонтанной и/или митоген-индуцированной продукции цитокинов в культурах МНК in vitro или в цельной крови ex vivo [1, 10, 35, 21]. Использование цельной крови имеет, на наш взгляд, несколько очевидных преимуществ. Во-первых, этот метод не требует выделения и подготовки мононукле- арных клеток к культивированию, что соответственно устраняет вероятность неспецифической активации МНК на этапах сепарации. Во-вторых, оценка цитокин-продуцирующей функции клеток происходит в их естественном микроокружении, при котором сохраняется существующий in vivo баланс, как различных типов клеток крови, так и гуморальных факторов. Следовательно, оценка продукции цитокинов в экспериментальных условиях максимально приближается к условиям in vivo. И, наконец, исследования цельной крови требуют меньше времени для их проведения, а также более доступны в экономическом отношении. При этом в отдельных работах была показана выраженная корреляционная взаимосвязь (rs = 0,4-0,6; p < 0,001) между концентрацией цитокинов (IL-1a, IL-10, TNFa, IFNy, IL-2, IL-10), измеряемой в цельной крови ex vivo и в культурах МНК in vitro при митогенной стимуляции ЛПС или КонА [35].

Нами установлено, что даже в условиях спонтанного культивирования клетки цельной крови активно продуцируют достаточно большой спектр цитокинов из различных функционально значимых групп (IFNy и IL-2; IL-4, IL-5 и IL-6; TNFa и IL-17; G-CSF; IL-8, MCP-1 и MIP-1P). В отличие от сывороточного уровня, концентрация вышеперечисленных цитокинов в цельной крови была достоверно выше и, в целом по группе, эффективно обнаруживалась при Bio-Plex анализе. Интересно отметить, что IL-6, IL-8 и MCP-1 регистрировались только ex vivo, тогда как в сыворотке их концентрация была минимальной (1-2 пкг/мл). Запуск активной продукции цитокинов в нести- мулированных культурах цельной крови реализуется, очевидно, через механизмы ауто- и пара- кринной регуляции [3]. Тем не менее, в условиях 24-часовой инкубации мы не обнаружили значимого усиления спонтанной продукции таких ци- токинов, как IL-10, IL-13, IL-12, IL-7, GM-CSF, концентрация которых и в супернатантах цельной
крови и в сыворотке достоверно не различалась между собой. Можно предположить, что пик их накопления приходится на более поздние сроки (48-72 ч), когда начинают превалировать механизмы feed-back регуляции.

Выявленное нами увеличение уровня продукции цитокинов в митоген-стимулированных культурах показывает, что клетки крови здоровых доноров функционально полноценны и через 24 ч культивирования с ЛПС или КонА активно продуцируют IFNy IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa и IL-12 в концентрациях, значимо превышающих уровень спонтанной продукции. По сравнению с КонА бактериальный эндотоксин характеризовался большей способностью индуцировать IFNy, IL-4, IL-6 и TNFa. Кроме того, ЛПС дополнительно усиливал продукцию IL-1P, G-CSF, GM-CSF и IL-8. При использовании КонА наблюдался более выраженный прирост продукции IL-2. Полученные данные показывают, что сравнительный анализ уровня базальной и стимулированной продукции позволяет оценить функциональный резерв системы цитокинов и секреторную активность кле- ток-продуцентов, что имеет очень большое значение в диагностике различных заболеваний.

Естественно, при работе с цельной кровью возникают некоторые вопросы. Какие именно клетки (лимфоциты/моноциты или, например, полиморфноядерные лейкоциты) являются основными продуцентами цитокинов, и, соответственно, каким образом индивидуальные особенности содержания лейкоцитов в крови и их популяционного состава сказываются на качестве используемого диагностического подхода? В наших исследованиях использовались поликлональные активаторы (ЛПС, КонА), которые действуют на различные субпопуляции клеток крови, в то же время изменение условий активации (например, стимуляция иономицином в сочетании с форбол- миристатацетатом) позволило бы более дифференцировано судить о функциональном состоянии Т-клеток-продуцентов.

Хотя в настоящее время доказано, что нейтро- филы способны продуцировать достаточно большой набор цитокинов, характерный по составу для фагоцитарных клеток (IL-1P, IL-1a, IL-1Ra, TNFa, TGFP, IL-8, IL-12, G-CSF, GM-CSF, MIP-1a и P), тем не менее признается, что их секреторная активность ниже, чем, например, у моноцитов/ макрофагов [9]. Существуют работы, в которых экспериментально показано, что в культурах ЛПС-стимулированных МНК (0,5 х 106/мл) уровень продукции TNFa и G-CSF был таким же, как и в культурах МНК в комбинации с нейтрофила- ми (1,5 х 106/мл) [32]. Конечно нельзя исключить влияния нейтрофилов (через механизмы пара- кринной регуляции) на уровень продукции тестируемых нами цитокинов (в том числе IFNy, IL-2,

IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-17), тем не менее, основными клетками-продуцентами этих факторов в цельной крови являются преимущественно МНК.

Для того чтобы нивелировать различия обследуемых лиц по абсолютному количеству МНК в крови, полученные значения концентрации цито- кинов целесообразно пересчитывать на 1 х 106 МНК [31]. В принципе, результаты продукции цитокинов могли бы быть стандартизированы и по абсолютному числу лейкоцитов крови. Но, что касается обследованной нами группы доноров, такой «математический пируэт» привел бы только к количественным, но не качественным изменениям результатов оценки цитокинового статуса.

В заключение можно сказать, что исследование продукции цитокинов в культурах клеток цельной крови, как и любой другой витральный метод, имеет свои достоинства и недостатки. Но, тем не менее, такой подход в сочетании с комплексной оценкой 17 цитокинов из различных функциональных групп позволяет достичь главного: в эксперименте исследовать цитокиновую сеть как целостный объект, проанализировать структуру и организацию ее регуляторных подсистем, характер их функционирования в условиях ауто- и паракринной регуляции (спонтанная продукция) и при антигенной или митогенной нагрузке (стимулированная продукция). При этом получаемая информация максимально приближена к условиям in vivo и может быть чрезвычайно полезной как в теоретическом, так и практическом плане при проведении экспериментальных и клинических исследований.

К сожалению, следует признать, что для внедрения Bio-Plex технологии в научную и медицинскую практику требуются значительные финансовые инвестиции. Проведенные нами исследования были бы невозможны, если бы руководство Президиума СО РАМН и Института клинической иммунологии СО РАМН, понимая всю важность изучаемой проблемы, не приняло решение

о    приобретении соответствующего оборудования и необходимой реагентики. Понимая это и учитывая затратную часть подобного рода работ, мы считаем, что полученные данные об уровне цито- кинов в сыворотке и в цельной крови здоровых доноров являются общей интеллектуальной собственностью сотрудников нашего Института, которые вправе их использовать в качестве нормативной базы в своих дальнейших исследованиях.

Авторы выражают признательность Региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований, а также сотрудникам лаборатории иммуногенетики ИКИ СО РАМН (зав. лабораторией академик РАМН В.И. Коненков) И.Г. Раковой и В.В. Авдошиной за участие в совместной работе при проведении Bio-Plex анализа.
Литература

Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С. Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 3. — С. 20-35.

Исаченко Е.Г., Виткина Т.И., Геронина С.А. и др. Спонтанный и ЛПС-инду- цированный синтез цитокинов клетками крови человека в норме и при аллергопатологиях // Иммунология. — 1999. — № 5. — С. 37-39.

Козлов В.А. Некоторые аспекты проблемы цитокинов // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 5-8.

Маркелова Е.В., Гельцер Б.И., Корявченкова И.В., Костюшко А.В. Состояние системы цитокинов при нозокомиальных пневмониях // Цитокины и воспаление. — 2003. — Т. 2, № 1. — С. 14-19.

Останин А.А., Леплина О.Ю., Тихонова М.А. и др. Цитокин-опосредованные механизмы развития системной иммуносупрессии у больных с гнойно-хирургической патологией // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 38-45.

Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Черных Е.Р., Коненков В.И. Оценка цитокинового профиля у больных с тяжелым сепсисом методом проточной флюориметрии (Bio-Plex анализа) // Цитокины и воспаление. — 2004. — Т. 3, № 1. — С. 20-27.

Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 9-16.

Сысоев К.А., Калинина Н.М., Бахтин М.Ю., Никифоров А.М. Продукция IL-1 р и TNF-a in vivo и in vitro у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с сердечно-сосудистой патологией // Мед. иммунология. — 2000. — Т. 2, № 1. — С. 53-58.

Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука,

— 231 с.

Фрейдлин И.С. Цитокины в клинике // Сб. тр. II Нац. Конгр. РААКИ. — 1998. — С. 104-112.

Arai K.I., Lee F., Miyajima A. et al. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses // Ann. Rev. Biochem. — 1991. — Vol. 59. — P. 783-836.

Bidwell J., Keen L., Gallageher G. et al. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line database // Genes and Immunity. — 1999. — Vol. 1. — P. 3-19.

Butcher S., Chahel H., Lord J.M. Ageing and the neutrophil: no appetite for killing? // Immunology. — 2000. — Vol. 100. — P. 411-416.

Cantagrel A., Navaux F., Loubet-Lescoulie P. et al. IL-1beta, IL-1 receptor an- tagoist, IL-4, and IL-10 gene polymorphism // Arthritis Rheum. — 1999. — Vol. 42, № 6. — P. 1093-1100.

Carson R., Vignali D. Simultaneous quantitation of fifteen cytokines using a multiplexed flow cytometric assay // J. Immunol. Methods. — 1999. — Vol. 227. — P. 41-52.

Chen J., Flurkey K., Harrison D.E. A reduced peripheral blood CD4(+) lymphocyte proportion is a consistent ageing phenotype // Mech. Ageing Dev. —

— Vol. 123. — P. 145-153.

Cogos C.A., Drosou E., Bassaris H.P., Skoutelis A. Pro- versus anti-inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis: a marker for prognosis and future therapeutic options. // J. Infec. Dis. — 2000. — Vol. 181, № 1. — P. 176-180.

Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., Hoogkamp-Korstanje J.A.A. A primer on cytokines: sources, receptors, effects and inducers // Clin. Microbiol. Rev. — 1997. — Vol. 10, № 4. — P. 742-780.

Flach R., Majetschak M., Heukamp T. et al. Relation of ex vivo stimulated blood cytokine synthesis to post-traumatic sepsis // Cytokine. — 1999. — Vol. 11, № 2. — P. 173-178.

Ginaldi L., De Martinis M., D'Ostilio A. et al. Changes in the expression of surface receptors on lymphocyte subsets in the elderly: quantitative flow cytometric analysis // Am. J. Hematol. — 2001. — Vol. 67. — P. 63-72.

Katial R.K., Sachanandani D., Pinney C., Lieberman M.M. Cytokine production in cell culture by peripheral blood mononuclear cells from immunocompetent hosts // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 1998. — Vol. 5, № 1. — P. 78-81.

Lauw F.N., ten Hove T., Dekkers P.E. et al. Reduced Th1, but not Th2, cytokine production by lymphocytes after in vivo exposure of healthy subjects to endotoxin // Infect. Immunity. — 2000. — Vol. 68, № 3. — P. 1014-1018.

Lucey D.R. Evolution of the Type-1 (Th1) — Type-2 (Th2) cytokine paradigm // Infect. Dis. Clin. North Am. — 1999. — Vol. 13, № 1. — P. 1-9.

Lucey D.R., Clerici M., Shearer G.M. Type 1 and Type 2 cytokine dysregulation in human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases // Clin. Microbi

ol.  Rev. — 1996. — Vol. 9, № 4. — P. 532-562.

2 5. Mira J-P., Cariou A., Groll F. et al. Association of TNF2, a TNF-a promoter polymorphism, with septic shock susceptibility and mortality // JAMA. — 1999. — Vol. 282, № 6. — P. 561-568.

Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more // Immunol. Today. — 1996. — Vol. 17, № 3. — P. 138-146.

Pawelec G., Hirokawa K., Fulop T. Altered T cell signaling in ageing // Mech. Ageing Dev. — 2001. — Vol. 122. — P. 1613-1637.

Pociot F., Veijola R., Johannsen J. et al. Analysis of an interferon-gamma gene (IFNG) polymorphism in Danish and Finnish insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) patients and control subjects // J. Interferon Cytokine Res. — 1997. — Vol. 17. — P. 81-93.

9.Struber F., Peterson M., Bokelmann F., Schade F.U. A genomic polymorphism

within the tumor necrosis factor locus influences plasma TNF-a concentrations and outcome of patients with severe sepsis // Crit. Care Med. —

— Vol. 24. — P. 381-384.

Tilg H., Dinarello C.A., Mier J.W. IL-6 and APPs: anti-inflammatory and immunosuppressive mediators // Immunol. Today. — 1997. — Vol. 18, № 9. — P. 428-432.

Viallard J.F., Pellegrin J.L., Ranchin V. et al. Th1 (IL-2, interferon-gamma) and Th2 (IL-10, IL-4) cytokine production by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with systemic lupus erythematosus (SLE) // Clin. Exp. Immunol. — 1999. — Vol. 115, № 1. — P. 189-195.

Weiss M., Fisher G., Barth E. et al. Dissociation of LPS-induced monocytic ex vivo production of G-CSF and TNF-a in patients with septic shock // Cytokine. — 2001. — Vol. 13, № 1. — P. 51-54.

Whisler   R.L., Beiqing L., Chen M. Age-related decreases in IL-2 production by human T cells are associated with impaired activation of nuclear transcriptional factors AP-1 and NF-AT // Cell Immunol. — 1996. — Vol. 169, № 2. — P. 185-195.

Whiteside T.L. Cytokine measurements and interpretation of cytokine assays in human disease // J. Clin. Immunol. — 1994. — Vol. 14, № 6. — P. 327-339.

5.Yagoob P., Newsholme E.A., Calder P.C. Comparison of cytokine production in

cultures of whole human blood and purified mononuclear cells // Cytokine. — 1999. — Vol. 11, № 8. — P. 600-605.

 

 



загрузка...