V.S. Kozhevnikov, A.A. Ostanin, V.A. Kozlov Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk
Comparative analysis of Th1 and Th2 cytokine production (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) and percentage of IFNy- and/or IL-4-positive CD4 and CD8 T cells in healthy donors and septic patients, including those who had > 50 % depressed vs normal anti-CD3-induced T-cell proliferation, has been performed. The patients with diminished T-cell proliferation were characterized by depressed IL-2, IFNy and IL-4 production and decreased percentage of both IFNy- and IL-4-positive CD4 T cells evidencing for global Th1/Th2 anergy. Elevated IL-10 production in these patients was suggested to be a result of regulatory T cell (Tr1) accumulation. On the other hand, the patients with normal T cell proliferation showed enhanced TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 levels and concomitant shift to a Th2 cytokine profile. Since the imbalance between Th1 and Th2 cytokines was associated with the decrease of IFNy+CD8+T cells and increase of IL-4+CD8+T lymphocytes, these data strongly suggest the Ts1^Ts2 switch. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 45-53.)
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Санкт- Петербургское научное общество дерматовенерологов имени В.М. Тарновского и общественная организация "Человек и его здоровье" приглашают Вас принять участие в работе научно-практической конференции с международным участием "Санкт-Петербургские дерматологические чтения", которая состоится в Санкт-Петербурге, в гостинице "Пулковская"
(пл. Победы, д. 1) 15-16 сентября 2005 года.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА: 15 сентября Тема: "Атопический дерматит"
Тема дискуссии: "Иммуноактивная терапия атопического дерматита - средства и методы, объем и тактика применения"
16 сентября Тема: "ИППП и современная фармакотерапия"
Тема дискуссии: "Неспецифическая терапия ИППП - есть ли для нее место: за и против"
Конгресс проводится совместно с Европейским обществом хирургии коленного сустава и артроскопии - ESSKA и Международным обществом артроскопии коленного сустава и ортопедической спортивной медицины - ISAK0S
НАУЧНАЯ ПРОГРАММА
организация артроскопической помощи • новые методики диагностики и лечения в артроскопии
лечебная тактика при острых повреждениях коленного и плечевого суставов • хирургическая тактика при повреждениях связок коленного сустава • хирургическая тактика при нестабильности плечевого сустава
осложнения после артроскопии • современные принципы диагностики и лечения повреждений хряща
хирургия менисков. Отдаленные результаты резекции менисков, шва менисков и перспективы трансплантации менисков • современные возможности артроскопии тазобедренного, локтевого и кистевого суставов • роль артроскопии в диагностике и лечении деформирующего артроза крупных суставов
роль артроскопии в ревматологии • артроскопия в детском возрасте • роль УЗИ и МРТ в диагностике повреждений и заболеваний суставов особенности восстановительного лечения после операций с использованием артроскопии • артроскопия и спортивная травматология
Научно-исследовательский онкологический институт, г. Ростов-на-Дону
Исследовали возможность применения в ЬАК-терапии больных раком яичника Ронколейкина — препарата рекомбинантного ^-2. В качестве источника лимфоцитов использовали лимфу грудного протока больных, получавших также аутолимфохимиотерапию. Изучение иммунобиологических свойств лимфоцитов лимфы после кратковременной инкубации (30 мин) и более длительного культивирования (24 и 48 ч) с Ронколейкином показало, что под действием этого препарата происходит усиление пролиферации Т-лимфоцитов, аутокринной стимуляции продукции ^-2, повышение эффекторных свойств NК-клеток, а также установлено прямое цитотокси- ческое действие Ронколейкина на культуру клеток линии К562 и сенсибилизирующий эффект - способность повышать ее чувствительность к лизису NК-клетками. ЬАК-терапия с Ронколейкином была применена в комплексном лечении больных раком яичника. Достигнутый эффект дает основание считать метод перспективным для лечения этого заболевания. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 54-58.)
Цитокинотерапия онкологических заболеваний является одним из наиболее современных и перспективных направлений в онкоиммунологии. Несмотря на то, что идея адаптивной иммунотерапии ^АК-терапии) с применением ^-2 была высказана еще в 80-х годах ХХ века [16], ее потенциал далеко не исчерпан, и в настоящее время определяется, прежде всего, возможностью использования рекомбинантных цитокинов, их различных сочетаний, а также расширением спектра тех заболеваний, при которых такое лечение представляется целесообразным.
Ронколейкин как препарат рекомбинантного ^-2 нашел применение в лечении различных заболеваний, в том числе онкологических [2, 4, 5, 7]. Он используется как для внутривенного капельного введения, так и для культивирования с ним лимфоцитов, в ходе которого происходит генерация естественных цитотоксических клеток и LАК- клеток [1,16]; описаны также варианты, сочетающие оба подхода [2]. При этом стимулируются не только МК-клетки, но, видимо, и макрофаги, поскольку IL-2 при действии in vitro усиливает продукцию монокинов TNFa и IL-8, которые, в свою очередь, потенциируют эффекты IL-2 [9]. Введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с IL-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цито- кина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными [2, 11]. Следует отметить, что первоначально применение IL-2, в том числе в виде LAK-терапии, считалось эффективным не при всех опухолях, а преимущественно при меланоме, почечно-клеточном раке, некоторых лимфопролиферативных заболеваниях [7, 18], особенно при использовании в рамках монотерапии. Однако в последние годы появились сообщения об успешном применении данного препарата при раке легкого [4], эндомет- риозе [6] в качестве одного из компонентов комплексного лечения этих заболеваний.
Было проведено исследование влияния совместной инкубации Ронколейкина с клетками лимфы грудного протока больных раком яичника на иммунобиологическое состояние лимфоцитов, а также предпринято использование LAК-терапии в комплексном лечении этих больных.
Учитывая данные литературы о дозовой и временной зависимости эффекта, известной для многих цитокинов [11], при постановке опытов были применены различные концентрации препарата и сроки инкубации. Лимфу грудного протока больных местно-распространенным и генерализованным раком яичника (350-400 мл) инкубировали в присутствии 2 х 106 МЕ Рон- колейкина. При этом в зависимости от цитоза приходилось
4-2,0 МЕ препарата на каждый лимфоцит. Проводили инкубацию лимфы с Ронколейкином в течение 30 мин при 37 °С, а также культивирование в полной культуральной среде, содержащей среду RPMI-1640 с 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Flow Lab.), 5 х 10-5 М 2-меркаптоэ- танола (Serva), 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES (Flow Lab.), 50 мкг/мл гентамицина, в присутствии 5 % СО2 в течение 24 и 48 ч. До и после культивирования изучали иммунофенотип лимфоцитов в непрямом иммунофлюоресцентном тесте с моноклональными антителами (Сорбент) и функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансфор- мации лимфоцитов (РБТЛ) с ФГА, КонА и ЛПС [10].
С целью изучения действия препарата на естественную цитотоксичность были проведены опыты по раздельной оценке его влияния на гибель клеток-мишеней К562 (клетки эрит- ромиелолейкоза человека) и на функцию клеток-эффекторов (NK-клеток). Для этого Ронколейкин в концентрации 5, 50 и 5000 МЕ/мл инкубировали в течение 30 мин при 37 °С:
с клетками-мишенями без клеток-эффекторов (контроль);
с клетками-мишенями, к которым затем добавляли интак- тные клетки-эффекторы (опыт № 1);
с клетками-эффекторами, к которым затем добавляли ин- тактные клетки-мишени (опыт № 2).
Во всех случаях клетки трехкратно отмывали и ставили цитотоксический тест (ЦТТ), включающий культивирование проб в течение 24 ч при 37 °С с последующим определением процента гибели клеток-мишеней и расчетом индекса цитотоксичности (ИЦ) по формуле:
ИЦ = (О - К)/К,
где О (опыт) — % погибших клеток-мишеней в присутствии клеток-эффекторов, К (контроль) — % погибших клеток-мишеней в присутствии среды.
Определение продукции IL-2 проводили в опытах с культурами клеток-продуцентов этого цитокина (Т-лимфобластной линии Jurkat). Оценивали их пролиферацию при культивировании с добавлением Ронколейкина (опыт), среды RPMI-1640 (контроль) и альбумина (контроль). Кроме того, супернатанты опытных и контрольных 48-часовых культур Jurkat добавляли к культивируемым спленоцитам мышей линии СВА и изучали их пролиферацию по результатам спонтанной 72-часовой РБТЛ.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода непрямых разностей и критерия Уил- коксона — Манна — Уитни.
ная инкубация (30 мин) с Ронколейкином вызывает выраженное повышение экспрессии маркера СD8+ (р < 0,05). Экспрессия других субпопуляционных и активационных маркеров не имела статистически достоверных отличий ни через 30 мин, ни через 24 ч после инкубации. Анализ результатов РБТЛ показал, что 30-минутная инкубация не отражается на функциональной активности лимфоцитов, тогда как 24- и 48-часовое культивирование приводит к статистически значимому усилению как спонтанной, так и митоген-индуцированной РБТЛ (см. табл. 1). Стимуляция достигает максимума на 1-е сутки в случае спонтанной и ЛПС-индуцированной (В-кле- точной) пролиферации и на 2-е — в случае индуцированной ФГА и КонА (Т-клеточной).
Наиболее интересными представляются результаты оценки изменения функциональной активности МК-клеток под действием Ронколейкина (см. табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность Ронколейкина по отношению к культуре клеток-мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту гибели клеток-мишеней 32,1 ± 5,8 % и по ИЦ 2,26 ± 0,44, то постановка ЦТТ с лимфоцитами, обработанными Ронколейкином в различ-
Влияние Ронколейкина на иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника
Примечание. * — статистически достоверные отличия от фона (р < 0,05); ** — статистически достоверные отличия от контроля (р<0,05).
превышает стимулирующую активность супернатантов клеток Jurkat, культивированных без Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейки- ном вызывает усиление продукции ^-2 клетками- продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными клетками Jurkat, среди которых преобладает ^-2.
На рис. 2 представлена возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейки- на после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных.
Полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования LАК-тера- пии с использованием аутологичной лимфы в клинике для лечения 8 больных раком яичника. Мы использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу, поскольку она содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл), а дренирование грудного лимфатического протока позволяет получить ее в значительном объеме и дает возможность сочетать LАК-терапию с аутолим- фохимиотерапией (АЛХТ), т. е. с введением цито- статиков после инкубации с аутологичной лимфой [8]. Результаты клинического применения АЛХТ+LАК свидетельствуют о том, что у больных на 25-30 % повышалась исходно низкая функциональная активность Т- и В- лимфоцитов. Кроме того, отмечалось снижение числа клеток, экспрессирующих маркеры СD8 и СD16, что на фоне отмеченной регрессии опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических клеток из периферической крови в очаг. Использование сочетания аутолимфохимиотерапии и LАК-тера- пии с использованием лимфы в предоперационном периоде у больных распространенным раком яичника позволило улучшить их состояние, уменьшить степень распространенности опухолевого процесса и количество метастазов, перевести больных из неоперабельного в операбельное состояние. Несмотря на то, что полученные данные еще малочисленны, они демонстрируют перспективу такого варианта использования Ронко- лейкина в лечении больных раком яичника.
Итак, приведенные результаты свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка лимфы больных раком яичника с помощью Ронколей- кина приводит к повышению экспрессии СD8, увеличению спонтанной и митоген-индуцирован- ной РБТЛ, стимуляции функциональной активности МК-клеток, а также увеличению чувствительности клеток-мишеней к действию эффекторов естественной цитотоксичности и продукции ^-2. Нами не было получено дозозависимого эффекта, т. е. Ронколейкин после обработки им лимфоцитов в концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал одинаковую гибель клеток- мишеней, что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата в достаточно широких пределах, включая область низких доз, об эффективности которых для генерации LАК при лечении, например, рака легкого имеются сообщения в литературе [3].
Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что успешная LАК-терапия при раке яичника возможна, т. к. лимфоциты больных активируются в присутствии ^-2, повышая продукцию таких цитокинов, как ^-2 и №N7 [15], обладающих противоопухолевым эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК-клетки, способные лизировать даже линии опухолей яичника, эксп
рессирующие факторы лекарственной устойчивости, такие как pgР и mdr [17]. Важным аспектом предлагаемого метода лечения является сочетание АЛХТ с LАК-терапией с применением аутолимфы. Одной из сторон потенциирования их эффекта может быть стимуляция апоптоза опухолевых клеток. Известно, что многие цитостатики, помимо прямого действия на неопластические клетки, способны повышать экспрессию на них Fas-R [14], а важным механизмом, через которые LАК-клет- ки проявляют свою цитотоксичность, является индукция Fas-зависимого апоптоза клеток-мишеней [13]. Кроме того, в эксперименте показано, что LАК-клетки более интенсивно поступают в опухолевую ткань после введения цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение цитостатиков и LАК-клеток способно улучшать противоопухолевый эффект, что показано на примере рака почки, легкого [4], а в рамках нашего исследования — на примере рака яичника.
Бережная Н.М., Ковальчук Е.В. ЛАК-феномен (фенотип клеток, механизм действия и условия его реализации) // Иммунология. — 1995. — № 2. — С. 12-16.
Гершанович М.Л. Применение интерлейкина-2 (пролейкина, алдеслейкина) в онкологической практике // Вопр. онкологии. — 2003. — Т. 49, № 6. — С. 776-782.
Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В. Влияние адоптивной иммунотерапии на эффективность хирургического лечения больных раком легкого // Эксперим. онкол. — 2000. — Приложение. — С. 66.
Кадагидзе З.Г. Цитокины и их использование в онкологии // Int. J. Immunorehab. — 1997. — № 6. — P. 47-56.
Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Ронколейкин в онкологической практике. — СПб., 2003. — С. 6-18.
Крамарева Н.Л., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли цитокинов в патогенезе эндометриоза и выборе иммунокорригирующей терапии // Мед. иммунол. — 2002. — Т. 4, № 2. — С. 278-279.
Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. — М., 1999. — 135 с.
Тотолян А.А. Иммунологические эффекты Ронколейкина in vitro и in vivo // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 45.
Фримель Х. Иммунологические методы. — М., 1987. — 456 с.
Ярилин А.А. Принципы и пути использования цитокинов в противоопухолевой терапии // Аллергия, астма, клин. иммунол. — 1999. — № 10. — С. 3-16.
Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced accumulation of transferred LAK cells into tumor sites after chemotherahy // Hokkaido Igaku Zasshi. — 1995. — Vol. 70, № 3. — P. 507-517.
Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al. Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic molecules used by lymphokine-activated killer cells // J. Immunol. — 1996. — Vol. 157, № 5. — P. 1919-1925.
Micheau O., Solary E., Hammann A. et al. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to Fas-mediated cytotoxicity // J. Natl Cancer Inst. —
— Vol. 89, № 11. — P. 783-789.
Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al. Differential expression of cytokine transcripts in human epithelial ovarian carcinoma by solid tumour specimens, peritoneal exudate cells containing tumour, tumour-infiltrating lymphocyte (TIL)-derived T cell lines and established tumour cell lines // Clin. Exp. Immunol. — 1998. — Vol. 112, № 2. — P. 172-180.
Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant IL-
to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. — 1985. — Vol. 313, № 23. — P. 1485-1492.
17.Savas B., Cole S.P., Tsuruo T., Pross H.F. P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and lymphokine-activated killer cell susceptibility in ovarian carcinoma // J. Clin. Immunol. — 1996. — Vol. 16, № 6. — P. 348-357.
Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Adoptive immunotherapy of patients with metastatic renal cell cancer using lymphokine-activated killer cells, interleukin-
and cyclophosphamide: long-term results // Int. J. Urol. — 1998. — Vol. 5, № 1. — P. 16-21.
Влияние Ронколейкина на иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника
клеток Jurkat, культивированных без Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейки- ном вызывает усиление продукции ^-2 клетками- продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными клетками Jurkat, среди которых преобладает ^-2.