V.S. Kozhevnikov, A.A. Ostanin, V.A. Kozlov
Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk
Comparative analysis of Th1 and Th2 cytokine
production (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) and percentage
of IFNy- and/or IL-4-positive CD4 and CD8 T cells in healthy donors and septic
patients, including those who had > 50 % depressed vs normal
anti-CD3-induced T-cell proliferation, has been performed. The patients with
diminished T-cell proliferation were characterized by depressed IL-2, IFNy and
IL-4 production and decreased percentage of both IFNy- and IL-4-positive CD4 T
cells evidencing for global Th1/Th2 anergy. Elevated IL-10 production in these
patients was suggested to be a result of regulatory T cell (Tr1) accumulation.
On the other hand, the patients with normal T cell proliferation showed
enhanced TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 levels and concomitant shift to
a Th2 cytokine profile. Since the imbalance between Th1 and Th2 cytokines was
associated with the decrease of IFNy+CD8+T cells and increase of IL-4+CD8+T
lymphocytes, these data strongly suggest the Ts1^Ts2 switch. (Cytokines and
Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 45-53.)
Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Санкт-
Петербургское научное общество дерматовенерологов имени В.М. Тарновского и
общественная организация "Человек и его здоровье" приглашают Вас
принять участие в работе научно-практической конференции с международным
участием "Санкт-Петербургские дерматологические чтения", которая
состоится в Санкт-Петербурге, в гостинице "Пулковская"
(пл. Победы, д. 1) 15-16 сентября
2005 года.
ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА: 15
сентября Тема: "Атопический дерматит"
Тема дискуссии:
"Иммуноактивная терапия атопического дерматита - средства и методы, объем
и тактика применения"
16 сентября Тема: "ИППП и современная
фармакотерапия"
Тема дискуссии:
"Неспецифическая терапия ИППП - есть ли для нее место: за и против"
Конгресс проводится совместно с
Европейским обществом хирургии коленного сустава и артроскопии - ESSKA и
Международным обществом артроскопии коленного сустава и ортопедической
спортивной медицины - ISAK0S
НАУЧНАЯ ПРОГРАММА
организация артроскопической
помощи • новые методики диагностики и лечения в артроскопии
лечебная тактика при острых
повреждениях коленного и плечевого суставов • хирургическая тактика при
повреждениях связок коленного сустава • хирургическая тактика при
нестабильности плечевого сустава
осложнения после артроскопии •
современные принципы диагностики и лечения повреждений хряща
хирургия менисков. Отдаленные
результаты резекции менисков, шва менисков и перспективы трансплантации
менисков • современные возможности артроскопии тазобедренного, локтевого и
кистевого суставов • роль артроскопии в диагностике и лечении деформирующего
артроза крупных суставов
роль артроскопии в ревматологии •
артроскопия в детском возрасте • роль УЗИ и МРТ в диагностике повреждений и
заболеваний суставов особенности восстановительного лечения после операций с
использованием артроскопии
• артроскопия и спортивная
травматология
Научно-исследовательский онкологический институт, г.
Ростов-на-Дону
Исследовали возможность
применения в ЬАК-терапии больных раком яичника Ронколейкина — препарата
рекомбинантного ^-2. В качестве источника лимфоцитов использовали лимфу
грудного протока больных, получавших также аутолимфохимиотерапию. Изучение
иммунобиологических свойств лимфоцитов лимфы после кратковременной инкубации
(30 мин) и более длительного культивирования (24 и 48 ч) с Ронколейкином
показало, что под действием этого препарата происходит усиление пролиферации
Т-лимфоцитов, аутокринной стимуляции продукции ^-2, повышение эффекторных
свойств NК-клеток, а также установлено прямое цитотокси- ческое действие
Ронколейкина на культуру клеток линии К562 и сенсибилизирующий эффект -
способность повышать ее чувствительность к лизису NК-клетками. ЬАК-терапия с
Ронколейкином была применена в комплексном лечении больных раком яичника. Достигнутый
эффект дает основание считать метод перспективным для лечения этого
заболевания. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 54-58.)
Цитокинотерапия онкологических
заболеваний является одним из наиболее современных и перспективных направлений
в онкоиммунологии. Несмотря на то, что идея адаптивной иммунотерапии
^АК-терапии) с применением ^-2 была высказана еще в 80-х годах ХХ века [16], ее
потенциал далеко не исчерпан, и в настоящее время определяется, прежде всего,
возможностью использования рекомбинантных цитокинов, их различных сочетаний, а
также расширением спектра тех заболеваний, при которых такое лечение
представляется целесообразным.
Ронколейкин как препарат рекомбинантного
^-2 нашел применение в лечении различных заболеваний, в том числе
онкологических [2, 4, 5, 7]. Он используется как для внутривенного капельного
введения, так и для культивирования с ним лимфоцитов, в ходе которого
происходит генерация естественных цитотоксических клеток и LАК- клеток [1,16];
описаны также варианты, сочетающие оба подхода [2]. При этом стимулируются не
только МК-клетки, но, видимо, и макрофаги, поскольку IL-2 при действии in vitro
усиливает продукцию монокинов TNFa и IL-8, которые, в свою очередь,
потенциируют эффекты IL-2 [9]. Введение аутологичных лимфоцитов после
культивирования с IL-2 приводит не только к повышению их цитотоксической
активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных
реакций этого цито- кина, которые при использовании его высоких доз бывают
весьма значительными [2, 11]. Следует отметить, что первоначально применение
IL-2, в том числе в виде LAK-терапии, считалось эффективным не при всех
опухолях, а преимущественно при меланоме, почечно-клеточном раке, некоторых
лимфопролиферативных заболеваниях [7, 18], особенно при использовании в рамках
монотерапии. Однако в последние годы появились сообщения об успешном применении
данного препарата при раке легкого [4], эндомет- риозе [6] в качестве одного из
компонентов комплексного лечения этих заболеваний.
Было проведено исследование
влияния совместной инкубации Ронколейкина с клетками лимфы грудного протока
больных раком яичника наиммунобиологическое
состояние лимфоцитов, а также предпринято использование LAК-терапии в
комплексном лечении этих больных.
Учитывая данные литературы о
дозовой и временной зависимости эффекта, известной для многих цитокинов [11],
при постановке опытов были применены различные концентрации препарата и сроки
инкубации. Лимфу грудного протока больных местно-распространенным и
генерализованным раком яичника (350-400 мл) инкубировали в присутствии 2 х 106
МЕ Рон- колейкина. При этом в зависимости от цитоза приходилось
4-2,0 МЕ препарата на каждый
лимфоцит. Проводили инкубацию лимфы с Ронколейкином в течение 30 мин при 37 °С,
а также культивирование в полной культуральной среде, содержащей среду
RPMI-1640 с 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Flow Lab.),
5 х 10-5 М 2-меркаптоэ- танола (Serva), 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES
(Flow Lab.), 50 мкг/мл гентамицина, в присутствии 5 % СО2 в течение 24 и 48 ч.
До и после культивирования изучали иммунофенотип лимфоцитов в непрямом
иммунофлюоресцентном тесте с моноклональными антителами (Сорбент) и
функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансфор- мации лимфоцитов
(РБТЛ) с ФГА, КонА и ЛПС [10].
С целью изучения действия
препарата на естественную цитотоксичность были проведены опыты по раздельной
оценке его влияния на гибель клеток-мишеней К562 (клетки эрит- ромиелолейкоза
человека) и на функцию клеток-эффекторов (NK-клеток). Для этого Ронколейкин в
концентрации 5, 50 и 5000 МЕ/мл инкубировали в течение 30 мин при 37 °С:
с клетками-мишенями без
клеток-эффекторов (контроль);
с клетками-мишенями, к которым
затем добавляли интак- тные клетки-эффекторы (опыт № 1);
с клетками-эффекторами, к которым
затем добавляли ин- тактные клетки-мишени (опыт № 2).
Во всех случаях клетки трехкратно
отмывали и ставили цитотоксический тест (ЦТТ), включающий культивирование проб
в течение 24 ч при 37 °С с последующим определением процента гибели
клеток-мишеней и расчетом индекса цитотоксичности (ИЦ) по формуле:
ИЦ = (О - К)/К,
где О (опыт) — % погибших
клеток-мишеней в присутствии клеток-эффекторов, К (контроль) — % погибших
клеток-мишеней в присутствии среды.
Определение продукции IL-2
проводили в опытах с культурами клеток-продуцентов этого цитокина
(Т-лимфобластной линии Jurkat). Оценивали их пролиферацию при культивировании с
добавлением Ронколейкина (опыт), среды RPMI-1640 (контроль) и альбумина
(контроль). Кроме того, супернатанты опытных и контрольных 48-часовых культур
Jurkat добавляли к культивируемым спленоцитам мышей линии СВА и изучали их
пролиферацию по результатам спонтанной 72-часовой РБТЛ.
Статистическую обработку
результатов проводили с использованием метода непрямых разностей и критерия
Уил- коксона — Манна — Уитни.
ная инкубация (30 мин) с
Ронколейкином вызывает выраженное повышение экспрессии маркера СD8+ (р <
0,05). Экспрессия других субпопуляционных и активационных маркеров не имела
статистически достоверных отличий ни через 30 мин, ни через 24 ч после
инкубации. Анализ результатов РБТЛ показал, что 30-минутная инкубация не
отражается на функциональной активности лимфоцитов, тогда как 24- и 48-часовое
культивирование приводит к статистически значимому усилению как спонтанной, так
и митоген-индуцированной РБТЛ (см. табл. 1). Стимуляция достигает максимума на
1-е сутки в случае спонтанной и ЛПС-индуцированной (В-кле- точной) пролиферации
и на 2-е — в случае индуцированной ФГА и КонА (Т-клеточной).
Наиболее интересными
представляются результаты оценки изменения функциональной активности МК-клеток
под действием Ронколейкина (см. табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность
Ронколейкина по отношению к культуре клеток-мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме
того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных
киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту гибели
клеток-мишеней 32,1 ± 5,8 % и по ИЦ 2,26 ± 0,44, то постановка ЦТТ с
лимфоцитами, обработанными Ронколейкином в различ-
Влияние Ронколейкина на иммунобиологические
свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника
Примечание. * — статистически
достоверные отличия от фона (р < 0,05); ** — статистически достоверные
отличия от контроля (р<0,05).
превышает стимулирующую
активность супернатантов клеток Jurkat, культивированных без
Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют
говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейки- ном вызывает
усиление продукции ^-2 клетками- продуцентами, а то обстоятельство, что
альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку
количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового
действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными
клетками Jurkat, среди которых преобладает ^-2.
На рис. 2 представлена возможная
схема реализации противоопухолевого действия Ронколейки- на после
культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных.
Полученные экспериментальные
данные послужили основанием для использования LАК-тера- пии с использованием
аутологичной лимфы в клинике для лечения 8 больных раком яичника. Мы
использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу, поскольку она
содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл), а дренирование грудного
лимфатического протока позволяет получить ее в значительном объеме и дает
возможность сочетать LАК-терапию с аутолим- фохимиотерапией (АЛХТ), т. е. с
введением цито- статиков после инкубации с аутологичной лимфой [8]. Результаты
клинического применения АЛХТ+LАК свидетельствуют о том, что у больных на 25-30
% повышалась исходно низкая функциональная активность Т- и В- лимфоцитов. Кроме
того, отмечалось снижение числа клеток, экспрессирующих маркеры СD8 и СD16, что
на фоне отмеченной регрессии опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических
клеток из периферической крови в очаг. Использование сочетания
аутолимфохимиотерапии и LАК-тера- пии с использованием лимфы в предоперационном
периоде у больных распространенным раком яичника позволило улучшить их
состояние, уменьшить степень распространенности опухолевого процесса и
количество метастазов, перевести больных из неоперабельного в операбельное
состояние. Несмотря на то, что полученные данные еще малочисленны, они
демонстрируют перспективу такого варианта использования Ронко- лейкина в
лечении больных раком яичника.
Итак, приведенные результаты
свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка лимфы больных раком
яичника с помощью Ронколей- кина приводит к повышению экспрессии СD8,
увеличению спонтанной и митоген-индуцирован- ной РБТЛ, стимуляции
функциональной активности МК-клеток, а также увеличению чувствительности
клеток-мишеней к действию эффекторов естественной цитотоксичности и продукции
^-2. Нами не было получено дозозависимого эффекта, т. е. Ронколейкин после
обработки им лимфоцитов в концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал одинаковую
гибель клеток- мишеней, что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата
в достаточно широких пределах, включая область низких доз, об эффективности
которых для генерации LАК при лечении, например, рака легкого имеются сообщения
в литературе [3].
Полученные нами результаты
подтверждают данные литературы о том, что успешная LАК-терапия при раке яичника
возможна, т. к. лимфоциты больных активируются в присутствии ^-2, повышая
продукцию таких цитокинов, как ^-2 и №N7 [15], обладающих противоопухолевым
эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК-клетки, способные
лизировать даже линии опухолей яичника, эксп
рессирующие факторы лекарственной устойчивости, такие как pgР и mdr [17].
Важным аспектом предлагаемого метода лечения является сочетание АЛХТ с
LАК-терапией с применением аутолимфы. Одной из сторон потенциирования их
эффекта может быть стимуляция апоптоза опухолевых клеток. Известно, что многие
цитостатики, помимо прямого действия на неопластические клетки, способны
повышать экспрессию на них Fas-R [14], а важным механизмом, через которые
LАК-клет- ки проявляют свою цитотоксичность, является индукция Fas-зависимого
апоптоза клеток-мишеней [13]. Кроме того, в эксперименте показано, что
LАК-клетки более интенсивно поступают в опухолевую ткань после введения
цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение цитостатиков и LАК-клеток
способно улучшать противоопухолевый эффект, что показано на примере рака почки,
легкого [4], а в рамках нашего исследования — на примере рака яичника.
Бережная Н.М., Ковальчук Е.В.
ЛАК-феномен (фенотип клеток, механизм действия и условия его реализации) //
Иммунология. — 1995. — № 2. — С. 12-16.
Гершанович М.Л. Применение
интерлейкина-2 (пролейкина, алдеслейкина) в онкологической практике // Вопр.
онкологии. — 2003. — Т. 49, № 6. — С. 776-782.
Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В.
Влияние адоптивной иммунотерапии на эффективность хирургического лечения
больных раком легкого // Эксперим. онкол. — 2000. — Приложение. — С. 66.
Кадагидзе З.Г. Цитокины и их
использование в онкологии // Int. J. Immunorehab. — 1997. — № 6. — P. 47-56.
Козлов В.К., Молчанов О.Е.,
Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических
больных // Ронколейкин в онкологической практике. — СПб., 2003. — С. 6-18.
Крамарева Н.Л., Сельков С.А.,
Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли цитокинов в патогенезе эндометриоза
и выборе иммунокорригирующей терапии // Мед. иммунол. — 2002. — Т. 4, № 2. — С.
278-279.
Новиков В.И., Карандашов В.И.,
Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. — М., 1999.
— 135 с.
Тотолян А.А. Иммунологические
эффекты Ронколейкина in vitro и in vivo // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 45.
Фримель Х. Иммунологические
методы. — М., 1987. — 456 с.
Ярилин А.А. Принципы и пути
использования цитокинов в противоопухолевой терапии // Аллергия, астма, клин.
иммунол. — 1999. — № 10. — С. 3-16.
Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced
accumulation of transferred LAK cells into tumor sites after chemotherahy //
Hokkaido Igaku Zasshi. — 1995. — Vol. 70, № 3. — P. 507-517.
Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al.
Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic
molecules used by lymphokine-activated killer cells // J. Immunol. — 1996. —
Vol. 157, № 5. — P. 1919-1925.
Micheau O., Solary E., Hammann A. et al.
Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to Fas-mediated
cytotoxicity // J. Natl Cancer Inst. —
— Vol. 89, № 11. — P. 783-789.
Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al.
Differential expression of cytokine transcripts in human epithelial ovarian
carcinoma by solid tumour specimens, peritoneal exudate cells containing
tumour, tumour-infiltrating lymphocyte (TIL)-derived T cell lines and
established tumour cell lines // Clin. Exp. Immunol. — 1998. — Vol. 112, № 2. —
P. 172-180.
Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al.
Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated
killer cells and recombinant IL-
to patients with metastatic cancer // N. Engl.
J. Med. — 1985. — Vol. 313, № 23. — P. 1485-1492.
17.Savas B., Cole S.P., Tsuruo T., Pross H.F.
P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and lymphokine-activated killer
cell susceptibility in ovarian carcinoma // J. Clin. Immunol. — 1996. — Vol.
16, № 6. — P. 348-357.
Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Adoptive
immunotherapy of patients with metastatic renal cell cancer using
lymphokine-activated killer cells, interleukin-
and cyclophosphamide: long-term results // Int.
J. Urol. — 1998. — Vol. 5, № 1. — P. 16-21.
Влияние Ронколейкина на иммунобиологические
свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника
клеток Jurkat, культивированных без
Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют
говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейки- ном вызывает
усиление продукции ^-2 клетками- продуцентами, а то обстоятельство, что
альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку
количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового
действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными
клетками Jurkat, среди которых преобладает ^-2.