загрузка...
 
Cytokine-dependent mechanisms of T-cell dysfunctions in surgical sepsis
Повернутись до змісту

Cytokine-dependent mechanisms of T-cell dysfunctions in surgical sepsis

E.R. Chernykh, E.V. Kurganova, V.V. Senukov, E.Ya. Shevela, E.I. Streltsova,

V.S. Kozhevnikov, A.A. Ostanin, V.A. Kozlov Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch of RAMS, Novosibirsk

Comparative analysis of Th1 and Th2 cytokine production (TNFa, IFNy, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF) and percentage of IFNy- and/or IL-4-positive CD4 and CD8 T cells in healthy donors and septic patients, including those who had > 50 % depressed vs normal anti-CD3-induced T-cell proliferation, has been performed. The patients with diminished T-cell proliferation were characterized by depressed IL-2, IFNy and IL-4 production and decreased percentage of both IFNy- and IL-4-positive CD4 T cells evidencing for global Th1/Th2 anergy. Elevated IL-10 production in these patients was suggested to be a result of regulatory T cell (Tr1) accumulation. On the other hand, the patients with normal T cell proliferation showed enhanced TNFa, GM-CSF, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 levels and concomitant shift to a Th2 cytokine profile. Since the imbalance between Th1 and Th2 cytokines was associated with the decrease of IFNy+CD8+T cells and increase of IL-4+CD8+T lymphocytes, these data strongly suggest the Ts1^Ts2 switch. (Cytokines and Inflammation. 2005. Vol. 4, № 2. P. 45-53.)

Key words: T-cell anergy, Th1/Th2, Ts1/Ts2, cytokines, sepsis.

РОССИЙСКАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ДЕРМАТОВЕНЕРОЛОГОВ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЕ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ЧТЕНИЯ

Глубокоуважаемые коллеги!

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Санкт- Петербургское научное общество дерматовенерологов имени В.М. Тарновского и общественная организация "Человек и его здоровье" приглашают Вас принять участие в работе научно-практической конференции с международным участием "Санкт-Петербургские дерматологические чтения", которая состоится в Санкт-Петербурге, в гостинице "Пулковская"

(пл. Победы, д. 1) 15-16 сентября 2005 года.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПРОГРАММА: 15 сентября Тема: "Атопический дерматит"

Тема дискуссии: "Иммуноактивная терапия атопического дерматита - средства и методы, объем и тактика применения"

16 сентября Тема: "ИППП и современная фармакотерапия"

Тема дискуссии: "Неспецифическая терапия ИППП - есть ли для нее место: за и против"

Ии ОО «Человек и его здоровье»

 

 

 

VI КОНГРЕСС РОССИЙСКОГО АРТРОСКОПИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА

Конгресс проводится совместно с Европейским обществом хирургии коленного сустава и артроскопии - ESSKA и Международным обществом артроскопии коленного сустава и ортопедической спортивной медицины - ISAK0S

НАУЧНАЯ ПРОГРАММА

организация артроскопической помощи • новые методики диагностики и лечения в артроскопии

лечебная тактика при острых повреждениях коленного и плечевого суставов • хирургическая тактика при повреждениях связок коленного сустава • хирургическая тактика при нестабильности плечевого сустава

осложнения после артроскопии • современные принципы диагностики и лечения повреждений хряща

хирургия менисков. Отдаленные результаты резекции менисков, шва менисков и перспективы трансплантации менисков • современные возможности артроскопии тазобедренного, локтевого и кистевого суставов • роль артроскопии в диагностике и лечении деформирующего артроза крупных суставов

роль артроскопии в ревматологии • артроскопия в детском возрасте • роль УЗИ и МРТ в диагностике повреждений и заболеваний суставов особенности восстановительного лечения после операций с использованием    артроскопии     •    артроскопия   и    спортивная травматология

 «Человек и его здоровье»


 

Подпись: ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАЬИ
© Златник Е.Ю., Голотина Л.Ю., 2005 УДК 618.11-006-085
Изучение возможности применения Ронколейкина для LAK-терапии рака яичника

Е.Ю. Златник, Л.Ю. Голотина

Научно-исследовательский онкологический институт, г. Ростов-на-Дону

Исследовали возможность применения в ЬАК-терапии больных раком яичника Ронколейкина — препарата рекомбинантного ^-2. В качестве источника лимфоцитов использовали лимфу грудного протока больных, получавших также аутолимфохимиотерапию. Изучение иммунобиологических свойств лимфоцитов лимфы после кратковременной инкубации (30 мин) и более длительного культивирования (24 и 48 ч) с Ронколейкином показало, что под действием этого препарата происходит усиление пролиферации Т-лимфоцитов, аутокринной стимуляции продукции ^-2, повышение эффекторных свойств NК-клеток, а также установлено прямое цитотокси- ческое действие Ронколейкина на культуру клеток линии К562 и сенсибилизирующий эффект - способность повышать ее чувствительность к лизису NК-клетками. ЬАК-терапия с Ронколейкином была применена в комплексном лечении больных раком яичника. Достигнутый эффект дает основание считать метод перспективным для лечения этого заболевания. (Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 2. С. 54-58.)

Ключевые слова: Ронколейкин, рак яичников, лимфа, LAK-терапия.

 

 

 

 

Цитокинотерапия онкологических заболеваний является одним из наиболее современных и перспективных направлений в онкоиммунологии. Несмотря на то, что идея адаптивной иммунотерапии ^АК-терапии) с применением ^-2 была высказана еще в 80-х годах ХХ века [16], ее потенциал далеко не исчерпан, и в настоящее время определяется, прежде всего, возможностью использования рекомбинантных цитокинов, их различных сочетаний, а также расширением спектра тех заболеваний, при которых такое лечение представляется целесообразным.

Ронколейкин как препарат рекомбинантного ^-2 нашел применение в лечении различных заболеваний, в том числе онкологических [2, 4, 5, 7]. Он используется как для внутривенного капельного введения, так и для культивирования с ним лимфоцитов, в ходе которого происходит генерация естественных цитотоксических клеток и LАК- клеток [1,16]; описаны также варианты, сочетающие оба подхода [2]. При этом стимулируются не только МК-клетки, но, видимо, и макрофаги, поскольку IL-2 при действии in vitro усиливает продукцию монокинов TNFa и IL-8, которые, в свою очередь, потенциируют эффекты IL-2 [9]. Введение аутологичных лимфоцитов после культивирования с IL-2 приводит не только к повышению их цитотоксической активности и расширению спектра клеток-мишеней, но и к снижению побочных реакций этого цито- кина, которые при использовании его высоких доз бывают весьма значительными [2, 11]. Следует отметить, что первоначально применение IL-2, в том числе в виде LAK-терапии, считалось эффективным не при всех опухолях, а преимущественно при меланоме, почечно-клеточном раке, некоторых лимфопролиферативных заболеваниях [7, 18], особенно при использовании в рамках монотерапии. Однако в последние годы появились сообщения об успешном применении данного препарата при раке легкого [4], эндомет- риозе [6] в качестве одного из компонентов комплексного лечения этих заболеваний.

Было проведено исследование влияния совместной инкубации Ронколейкина с клетками лимфы грудного протока больных раком яичника на иммунобиологическое состояние лимфоцитов, а также предпринято использование LAК-терапии в комплексном лечении этих больных.

Материалы и методы

Учитывая данные литературы о дозовой и временной зависимости эффекта, известной для многих цитокинов [11], при постановке опытов были применены различные концентрации препарата и сроки инкубации. Лимфу грудного протока больных местно-распространенным и генерализованным раком яичника (350-400 мл) инкубировали в присутствии 2 х 106 МЕ Рон- колейкина. При этом в зависимости от цитоза приходилось

4-2,0 МЕ препарата на каждый лимфоцит. Проводили инкубацию лимфы с Ронколейкином в течение 30 мин при 37 °С, а также культивирование в полной культуральной среде, содержащей среду RPMI-1640 с 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Flow Lab.), 5 х 10-5 М 2-меркаптоэ- танола (Serva), 2 мМ L-глютамина, 10 мМ буфера HEPES (Flow Lab.), 50 мкг/мл гентамицина, в присутствии 5 % СО2 в течение 24 и 48 ч. До и после культивирования изучали иммунофенотип лимфоцитов в непрямом иммунофлюоресцентном тесте с моноклональными антителами (Сорбент) и функциональную активность лимфоцитов в реакции бласттрансфор- мации лимфоцитов (РБТЛ) с ФГА, КонА и ЛПС [10].

С целью изучения действия препарата на естественную цитотоксичность были проведены опыты по раздельной оценке его влияния на гибель клеток-мишеней К562 (клетки эрит- ромиелолейкоза человека) и на функцию клеток-эффекторов (NK-клеток). Для этого Ронколейкин в концентрации 5, 50 и 5000 МЕ/мл инкубировали в течение 30 мин при 37 °С:

с клетками-мишенями без клеток-эффекторов (контроль);

с клетками-мишенями, к которым затем добавляли интак- тные клетки-эффекторы (опыт № 1);

с клетками-эффекторами, к которым затем добавляли ин- тактные клетки-мишени (опыт № 2).

Во всех случаях клетки трехкратно отмывали и ставили цитотоксический тест (ЦТТ), включающий культивирование проб в течение 24 ч при 37 °С с последующим определением процента гибели клеток-мишеней и расчетом индекса цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

ИЦ = (О - К)/К,

где О (опыт) — % погибших клеток-мишеней в присутствии клеток-эффекторов, К (контроль) — % погибших клеток-мишеней в присутствии среды.

Определение продукции IL-2 проводили в опытах с культурами клеток-продуцентов этого цитокина (Т-лимфобластной линии Jurkat). Оценивали их пролиферацию при культивировании с добавлением Ронколейкина (опыт), среды RPMI-1640 (контроль) и альбумина (контроль). Кроме того, супернатанты опытных и контрольных 48-часовых культур Jurkat добавляли к культивируемым спленоцитам мышей линии СВА и изучали их пролиферацию по результатам спонтанной 72-часовой РБТЛ.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода непрямых разностей и критерия Уил- коксона — Манна — Уитни.

ная инкубация (30 мин) с Ронколейкином вызывает выраженное повышение экспрессии маркера СD8+ (р < 0,05). Экспрессия других субпопуляционных и активационных маркеров не имела статистически достоверных отличий ни через 30 мин, ни через 24 ч после инкубации. Анализ результатов РБТЛ показал, что 30-минутная инкубация не отражается на функциональной активности лимфоцитов, тогда как 24- и 48-часовое культивирование приводит к статистически значимому усилению как спонтанной, так и митоген-индуцированной РБТЛ (см. табл. 1). Стимуляция достигает максимума на 1-е сутки в случае спонтанной и ЛПС-индуцированной (В-кле- точной) пролиферации и на 2-е — в случае индуцированной ФГА и КонА (Т-клеточной).

Наиболее интересными представляются результаты оценки изменения функциональной активности МК-клеток под действием Ронколейкина (см. табл. 2). Так, была выявлена цитотоксичность Ронколейкина по отношению к культуре клеток-мишеней К562 (см. табл. 2). Кроме того, обработка лимфы препаратом стимулирует цитотоксичность естественных киллеров. Например, если результаты ЦТТ в контроле составили по проценту гибели клеток-мишеней 32,1 ± 5,8 % и по ИЦ 2,26 ± 0,44, то постановка ЦТТ с лимфоцитами, обработанными Ронколейкином в различ-

ИММУНОТЕРАПИЯ — ПРЫЖОК В БУДУЩЕЕ

РОНКОЛЕЙКИН®

Рекомбинантный интерлейкин-2

Туберкулез

Пневмонии

Иммунодефициты, ВИЧ

Гепатит С

О. панкреатит

Перитониту

Урогенитальные инфекции

 

 

Результаты и обсуждение

 

Подпись: %
 
Рис. 1. Влияние культивирования с Ронколейкином и альбумином на продукцию 11_-2
Влияние Ронколейкина на иммунобиологические свойства лимфоцитов лимфы больных раком яичника

Примечание. * — статистически достоверные отличия от фона (р < 0,05); ** — статистически достоверные отличия от контроля (р<0,05).

 

 

 

 


превышает стимулирующую активность супернатантов Подпись: Ронколейкин
 
Рис. 2. Возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейкина после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных
клеток Jurkat, культивированных без Ронколейкина или с альбумином (см. рис. 1). Полученные результаты позволяют говорить о том, что культивирование лимфоцитов с Ронколейки- ном вызывает усиление продукции ^-2 клетками- продуцентами, а то обстоятельство, что альбумин, добавленный в культуру спленоцитов в эквивалентном по белку количестве, не стимулирует их пролиферацию, служит доказательством ростового действия не любого белка, а именно цитокинов, продуцируемых активированными клетками Jurkat, среди которых преобладает ^-2.

На рис. 2 представлена возможная схема реализации противоопухолевого действия Ронколейки- на после культивирования с ним аутологичных лимфоцитов больных.

Полученные экспериментальные данные послужили основанием для использования LАК-тера- пии с использованием аутологичной лимфы в клинике для лечения 8 больных раком яичника. Мы использовали в качестве источника лимфоцитов именно лимфу, поскольку она содержит большое количество клеток (до 107 в 1 мл), а дренирование грудного лимфатического протока позволяет получить ее в значительном объеме и дает возможность сочетать LАК-терапию с аутолим- фохимиотерапией (АЛХТ), т. е. с введением цито- статиков после инкубации с аутологичной лимфой [8]. Результаты клинического применения АЛХТ+LАК свидетельствуют о том, что у больных на 25-30 % повышалась исходно низкая функциональная активность Т- и В- лимфоцитов. Кроме того, отмечалось снижение числа клеток, экспрессирующих маркеры СD8 и СD16, что на фоне отмеченной регрессии опухоли можно объяснить миграцией цитотоксических клеток из периферической крови в очаг. Использование сочетания аутолимфохимиотерапии и LАК-тера- пии с использованием лимфы в предоперационном периоде у больных распространенным раком яичника позволило улучшить их состояние, уменьшить степень распространенности опухолевого процесса и количество метастазов, перевести больных из неоперабельного в операбельное состояние. Несмотря на то, что полученные данные еще малочисленны, они демонстрируют перспективу такого варианта использования Ронко- лейкина в лечении больных раком яичника.

Итак, приведенные результаты свидетельствуют о том, что экстракорпоральная обработка лимфы больных раком яичника с помощью Ронколей- кина приводит к повышению экспрессии СD8, увеличению спонтанной и митоген-индуцирован- ной РБТЛ, стимуляции функциональной активности МК-клеток, а также увеличению чувствительности клеток-мишеней к действию эффекторов естественной цитотоксичности и продукции ^-2. Нами не было получено дозозависимого эффекта, т. е. Ронколейкин после обработки им лимфоцитов в концентрациях 5, 50 и 5000 МЕ/мл вызывал одинаковую гибель клеток- мишеней, что позволяет проводить поиск оптимальных доз препарата в достаточно широких пределах, включая область низких доз, об эффективности которых для генерации LАК при лечении, например, рака легкого имеются сообщения в литературе [3].

Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что успешная LАК-терапия при раке яичника возможна, т. к. лимфоциты больных активируются в присутствии ^-2, повышая продукцию таких цитокинов, как ^-2 и №N7 [15], обладающих противоопухолевым эффектом, при этом лимфоциты трансформируются в LАК-клетки, способные лизировать даже линии опухолей яичника, эксп
рессирующие факторы лекарственной устойчивости, такие как pgР и mdr [17]. Важным аспектом предлагаемого метода лечения является сочетание АЛХТ с LАК-терапией с применением аутолимфы. Одной из сторон потенциирования их эффекта может быть стимуляция апоптоза опухолевых клеток. Известно, что многие цитостатики, помимо прямого действия на неопластические клетки, способны повышать экспрессию на них Fas-R [14], а важным механизмом, через которые LАК-клет- ки проявляют свою цитотоксичность, является индукция Fas-зависимого апоптоза клеток-мишеней [13]. Кроме того, в эксперименте показано, что LАК-клетки более интенсивно поступают в опухолевую ткань после введения цитостатиков [12]. Поэтому комбинированное применение цитостатиков и LАК-клеток способно улучшать противоопухолевый эффект, что показано на примере рака почки, легкого [4], а в рамках нашего исследования — на примере рака яичника.

 

 

 

ЛИТЕРАТУРА

 

Бережная Н.М., Ковальчук Е.В. ЛАК-феномен (фенотип клеток, механизм действия и условия его реализации) // Иммунология. — 1995. — № 2. — С. 12-16.

Гершанович М.Л. Применение интерлейкина-2 (пролейкина, алдеслейкина) в онкологической практике // Вопр. онкологии. — 2003. — Т. 49, № 6. — С. 776-782.

Гриневич Ю.А., Фильчаков Ф.В. Влияние адоптивной иммунотерапии на эффективность хирургического лечения больных раком легкого // Эксперим. онкол. — 2000. — Приложение. — С. 66.

Кадагидзе З.Г. Цитокины и их использование в онкологии // Int. J. Immunorehab. — 1997. — № 6. — P. 47-56.

Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.М. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении онкологических больных // Ронколейкин в онкологической практике. — СПб., 2003. — С. 6-18.

Крамарева Н.Л., Сельков С.А., Ярмолинская М.И., Павлов О.В. Изучение роли цитокинов в патогенезе эндометриоза и выборе иммунокорригирующей терапии // Мед. иммунол. — 2002. — Т. 4, № 2. — С. 278-279.

Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Иммунотерапия при злокачественных новообразованиях. — М., 1999. — 135 с.

Сидоренко Ю.С. Лимфохимиотерапия. — Ростов-на-Дону: Изд. РГМУ,

— 320 с.

Тотолян А.А. Иммунологические эффекты Ронколейкина in vitro и in vivo // Иммунология. — 1998. — № 6. — С. 45.

Фримель Х. Иммунологические методы. — М., 1987. — 456 с.

Ярилин А.А. Принципы и пути использования цитокинов в противоопухолевой терапии // Аллергия, астма, клин. иммунол. — 1999. — № 10. — С. 3-16.

Kuramitsu Y. Mechanisms of enhanced accumulation of transferred LAK cells into tumor sites after chemotherahy // Hokkaido Igaku Zasshi. — 1995. — Vol. 70, № 3. — P. 507-517.

Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y. et al. Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic molecules used by lymphokine-activated killer cells // J. Immunol. — 1996. — Vol. 157, № 5. — P. 1919-1925.

Micheau O., Solary E., Hammann A. et al. Sensitization of cancer cells treated with cytotoxic drugs to Fas-mediated cytotoxicity // J. Natl Cancer Inst. —

— Vol. 89, № 11. — P. 783-789.

Nash M.A., Lenzi R., Edwards C.L. et al. Differential expression of cytokine transcripts in human epithelial ovarian carcinoma by solid tumour specimens, peritoneal exudate cells containing tumour, tumour-infiltrating lymphocyte (TIL)-derived T cell lines and established tumour cell lines // Clin. Exp. Immunol. — 1998. — Vol. 112, № 2. — P. 172-180.

Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant IL-

to patients with metastatic cancer // N. Engl. J. Med. — 1985. — Vol. 313, № 23. — P. 1485-1492.

17.Savas B., Cole S.P., Tsuruo T., Pross H.F. P-glycoprotein-mediated multidrug resistance and lymphokine-activated killer cell susceptibility in ovarian carcinoma // J. Clin. Immunol. — 1996. — Vol. 16, № 6. — P. 348-357.

Tomita Y., Katagiri A., Saito K. et al. Adoptive immunotherapy of patients with metastatic renal cell cancer using lymphokine-activated killer cells, interleukin-

and cyclophosphamide: long-term results // Int. J. Urol. — 1998. — Vol. 5, № 1. — P. 16-21.

 

 

 

 



загрузка...