Механизм прямой кристаллизации характеризуется тем, что само зарождение кристаллов ГАП (инициация процесса) происходит на реактивных группах в специально подготовленных местах - центрах кристаллизации (нуклеации). В их создании участвуют белки, синтезируемые остеобластами. Начинается оно с внеклеточного дозревания коллагена (см. раздел 10.2.2). По мере формирования фибрилл становится возможным привлечение некоторых из неколлагеновых белков костной ткани (табл. 11-1). Они встраиваются в показанные на рис. 10-1 просветы («зазоры») между соседними молекулами тропоколлагена. На этом завершается подготовка центров нукпеации, хотя не исключено, что соотношение неколлагеновых белков в них меняется по мере зарождения, роста кристаллов и его остановки.
Ведущую роль в инициации образования кристаллов ГАП играет костный сиалопротеин II (BSP II). Этот некрупный гликопротеин специфичен для минерализуемых тканей и составляет до 15% от всех неколлагеновых белков кости. Его растянутая молекула (длиной ~40 нм) локализуется в просветах между торцами тропоколлагена и тесно ассоциирована с волокнистыми структурами (возможно, с участием ковалентных связей). Наличие множества фосфатных и сульфатных групп, обилие радикалов глутамата (и аспартата), а также сиа- ловых кислот (табл. 11-1), - все это придает молекуле сильно кислый характер (pi — 3,9). Следовательно, в физиологических условиях BSP II несет на себе значительный отрицательный заряд и уже поэтому способен связывать катионы. В целом молекула может присоединять более 80 ионов Са2+ (с константой связывания 0,5-1,0 мМ). Третичная структура белка обеспечивает такое пространственное расположение реактивных групп (фосфатные и сульфатные фрагменты, полиглутаматные кластеры), которое оптимально для связывания ионов Са2+ в ориентации, соответствующей их местам в кристаллической решетке ГАП. Поэтому костный сиалопротеин II даже в очень малых количествах (0,3 мкг/мл = 9 нМ) способен инициировать начальную кристаллизацию в условиях, когда концентрации свободных ионов Са2+ и фосфата не достигают насыщения, которое могло бы привести к спонтанному осаждению фосфорно-кальциевых солей (неопределенного состава). Иными словами, этот белок- нуклеатор выполняет своеобразную каталитическую функцию. Необходимую для этого конформацию он приобретает, скорее всего, в ходе внедрения в зазоры между молекулами тропоколлагена и взаимодействия с ними и, возможно, с другими белками матрикса. Достижение нужного конформационного состояния дает импульс формированию «зародышевых» кристаллов. Оставаясь соединенным с ними через свои полиглутаматные кластеры, костный сиалопротеин II еще и опосредует связывание кристаллов ГАП с коллагеновыми микрофибриллами.
Другой сиалопротеин кости — остеопонтин (BSP I) - очень похож на костный сиалопротеин II, отличаясь главным образом отсутствием сульфатных групп, гораздо меньшим числом олигосахаридных фрагментов и значительно более высокой степенью фосфорилирования. Тем не менее, он не обладает свойствами нук- леатора. Напротив, остеопонтин препятствует образованию осадка солей даже в условиях перенасыщенности среды ионами Са2+ и фосфата. Оказалось, однако, что этот фосфогликопроте- ин тоже необходим для осуществления процесса минерализации с самого его начала. По всей видимости, остеопонтин препятствует образованию солей «случайного» состава, обеспечивая формирование правильного типа кристаллов (т.е., строгое построение кристаллической решетки именно гидроксиапатита, - по закону «все или ничего»). Такую трактовку подтверждает тот факт, что максимум продукции ос- теопонтина несколько предшествуют появлению «зародышевых» кристаллов (создавая необходимый «фон»), тогда как продукция BSP II усиливается одновременно с минерализацией, для начала которой необходимы центры кристаллизации. Похоже, что остеопонтин (как и BSP II) тоже входит в состав центров кристаллизации. Во всяком случае, в кости его довольно много, и он прочно связан с кристаллами минеральной фазы.
Последовательность укладки ионов в кристаллическую решетку гидроксиапатита пока не установлена. Однако выявлены факторы, способствующие этому или контролирующие рост кристаллов.
К первым относится щелочная фосфатаза. Костная изоформа этого фермента выявляется уже в преостеобластах (которые еще не способны вырабатывать остеоид) и достигает очень высокого уровня в активных остеобластах. В матриксе она появляется очень рано, ио отсутствует в участках завершенной минерализации. При pH 7,4 и выше этот фермент гидролизует эфирную связь ортофосфата с различными молекулами - от глицерина, этаноламина и моносахаридов до нуклеозидов и радикалов серина, тирозина, треоиина в фосфопротеинах. Сродство к субстратам довольно высокое: К^ составляет от 1,4 мМ (р-глицерофосфат) до
6 мМ (АМФ, АДФ, фосфорные эфиры глюкозы). Молекулярная активность тоже очень значительна: 8-40 тысяч фосфоэфирных связей в минуту (в зависимости от субстрата). Освобождая неорганический фосфат из его эфиров, фос- фатаза вызывает повышение концентрации фосфат-ионов, способствуя тем самым образованию кристаллов на центрах нуклеации. Ионы карбоната угнетают фермент.
Примечательно, что оба костных сиало- протеина, включаемых в центры нуклеации, появляются в остеобластах позже, чем щелочная фосфатаза. Вырабатываются они вместе с другими компонентами остеоида и оказываются диффузно распределенными в нем, но отчетливо концентрируются впереди фронта минерализации, вплотную примыкая к нему.
К факторам контроля роста кристаллов относятся остальные неколлагеновые белки кости из числа приведенных в таблице 1-1. Все они - остеокапьцин, остеонектин и матриксный С1а- протеин - не обладают свойствами нукпеато- ров и поэтому не обнаруживаются в местах зарождения кристаллов. Первые два из этих белков не несут фосфатных групп и присутствуют только там, где минерализация уже завершена. При этом в молекуле остеокальцина, преобладающего количественно, содержится 2-3 остатка С1а. Эти у-карбоксилатные группы (см рис.2-28) прочно связываются с ионами Са2+ и, особенно, с гидроксиапатитом, обеспечивая тем самым участие белка в регулировании роста кристаллов. Второй белок - остеонектин - обладает более широким набором различных доменов. Поэтому он способен не только удерживать ионы Са2+, но и взаимодействовать с разнообразными лигандами (часть из них названа в табл. 11-1). Остеонектин обнаруживается во всех клетках периоста (даже в фибро- бластах), но во внеклеточном матриксе появляется лишь на довольно поздней стадии минерализации. В свободном состоянии остеокапьцин замедляет зарождение Кристалов, а остеонектин задерживает их рост. Вместе с тем, будучи связанными с другими белками, они могут способствовать формированию гидроксиапатита, но могут и тормозить этот процесс, в зависимости от конформационного состояния. В целом же в условиях in vivo и остеокальцин, и остеонектин ограничивают рост кристаллов ГАП, тем самым регулируя их размеры и предотвращая избыточную минерализацию костной ткани.
Приведенный в табл. 11-1 матриксный G/лнпротеин подобен остеокапьцину, но богаче остатками Gla и содержит фосфатные группы. Входя в состав и костной, и хряшевой ткани, этот белок обладает (в сравнении с остеокаль- цином) еще более выраженными свойствами отрицательного регулятора, проявляя себя как ингибитор костеобразования.
Важно подчеркнуть, что центры нуклеации пространственно разделены и взаимно независимы даже в пределах одиой фибриллы. Прирост минеральной фазы происходит путем приумножения числа кристаллов и лишь в малой степени - за счет увеличения их размеров. Это обусловлено разнообразием тех неколла- геновых белков, которые контролируют рост кристаллов, а не их зарождение. Тормозят рост кристаллов также цнтрат и сывороточный альбумин, которые, однако, не мешают появлению новых кристаллов, меньших по размерам. С другой стороны, поглощение ионов F" костью взрослого человека сопровождается увеличением кристаллов апатита, но преимущественно не в длину, а в ширину. Латеральный рост in vivo при концентрации F" в среде, равной примерно 2 мкМ, является результатом прямого взаимодействия этих ионов с кристаллами.
Формирование центров нуклеации занимает 5-10 дней. Остеобласт в это время продолжает наращивать вокруг себя свежий матрикс, периферия которого, «дозревая», подвергается минерализации. Дальнейшее увеличение слоя секретируемого (и созревающего) остеоида компенсируется продвижением фронта минерализации к остеобласту (и его отросткам). Поэтому толщина неминерализованного матрикса вокруг клетки остается сравнительно постоянной. По мере ослабления синтетической активности остеобласта (с превращением его в ос- теоцит) продвижение фронта минерализации постепенно замедляется и в конце концов останавливается, так и не достигнув поверхности клетки (она остается покрытой тонким слоем неминерализуемого матрикса). Весь процесс минерализации свежего остеоида занимает (у человека) не более 15 суток.