Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех химических компонентов, формирующих клеточные структуры. Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. Однако эта закономерность наблюдается не всегда, так как в некоторых условиях клетки способны просто накапливать запасные или резервные вещества, т. е. масса может увеличиваться, но роста при этом не наблюдается. В подходящей же среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров популяции, например количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. Иными словами, культуры, растущие сбалансированно, сохраняют постоянный химический состав. В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста бактериальной популяции в каждый момент времени, если измерить прирост любого компонента клетки по отношению к его исходному количеству. Таким образом, в культуре, растущей сбалансированно, скорость прироста вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе имеющихся в это время бактерий. Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (^). Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной культуры в зависимости от условий выращивания она меняется.
Если рост клеток в культуре ограничен количеством внесенного в питательную среду компонента, то между его начальной концентрацией и полученной биомассой клеток существует постоянная линейная зависимость (при условии ограничения роста только по одному параметру). Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды, представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (или выходом биомассы) - У. Эту величину определяют п о ур авнению
У = Х-Хт ’
где Х - масса сухого вещества клеток (г, мл культуры), вступившей в стационарную фазу роста; Х0 - масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после инокуляции среды; (Х - Х0) - урожай бактериальной культуры (урожай зависит от количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий культивирования); (50 - 5) - количество потребленного субстрата (компонента среды).
В лабораторных и промышленных условиях используют два основных способа культивирования микроорганизмов: периодическое (статическое) и непрерывное (проточное).
Рост бактерий в периодической культуре происходит до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов питательной среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов метаболизма, то получается так называемая периодическая культура (популяция клеток в ограниченном жизненном пространстве).
Зависимость концентрации жизнеспособных клеток при периодическом культивировании от длительности инкубирования описывается характерной кривой, которая имеет Б-образную форму (рис. 30). На кривой можно различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную (или лаг-) фазу; экспоненциальную, или логарифмическую, фазу; стационарную фазу; фазу отмирания.
Рис. 31. Кривая роста бактериальной популяции:
1 - лаг-фаза; 2 - экспоненцальная фаза;
3 - стационарная фаза; 4 - фаза отмирания
Лаг-фаза, или фаза задержанного роста, охватывает промежуток времени между инокуляцией бактерий и достижением ими максимальной скорости деления. В клетках бактерий в этот период идут в основном процессы, связанные с приспособлением их к условиям культивирования (составу среды, температуре, рН и т. п.). Продолжительность фазы определяется следующими факторами.
Начальными условиями культивирования вносимого посевного материала. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, которые были в предшествующей культуре, то для приспособления к новым условиям в клетке должен быть синтезирован набор ферментов, потребность в которых ранее отсутствовала и поэтому они в ней не синтезировались. Этот процесс индуцируется внесением нового субстрата. Если проанализировать химический состав бактериальной клетки в течение лаг-фазы, то можно отметить, что во время нее происходит быстрое увеличение количества РНК (в 8-12 раз).
Возрастом посевного материала: чем старше культура, которую используют для инокуляции новой питательной среды, тем большее время занимает лаг-фаза, хотя при значительном количестве засеваемого активно делящегося посевного материала культура может развиваться без лаг- фазы.
Во время лаг-фазы деления клеток не происходит, отмечаются лишь процессы, подготавливающие клетку к размножению.
Лаг-фаза переходит в начальную фазу размножения, или фазу ускорения роста, когда клетки начинают делиться с постепенно увеличивающейся скоростью.
Фаза экспоненциального (логарифмического) роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и скоростью роста. Для различных видов бактерий эти величины могут варьировать в значительных пределах. Например, бактерии E. coli при 37 °С делятся примерно каждые 20 мин, а бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter - 5-10 ч. Культуры бактерии E. coli вступают в стационарную фазу при концентрации клеток 2-5 ' 109/мл.
Во время экспонециальной фазы все клетки в популяции имеют приблизительно одинаковый размер, содержат максимальное количество РНК, количество белка в них также максимально и постоянно. Во время экспоненциальной фазы клетки наиболее жизнеспособны и обладают высокой биохимической активностью.
Стационарная фаза наступает тогда, когда число жизнеспособных клеток достигает максимума и не увеличивается, так как скорость размножения бактерий равна скорости их отмирания. В связи с тем, что скорость роста определяется концентрацией субстрата, то еще до его полного использования начинает снижаться и скорость роста, поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за недостатка субстрата, но и вследствие высокой плотности бактериальной популяции, при низком парциальном давлении кислорода или по причине накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы обусловливают переход к стационарной фазе. Переход в стационарную фазу включает период несбалансированного роста, когда компоненты клеток синтезируются с различными скоростями, соответственно и содержание отдельных химических веществ в клетках на разных стадиях отличается.
Химический состав клеток зависит от фактора, лимитирующего рост. Клетки в стационарной фазе меньше по размеру, содержат меньше РНК, более устойчивы к различного рода воздействиям (физи-ческим и химическим), чем в экспоненциальной фазе роста культур. В этот период в клетках или в среде культивирования нередко накапливаются продукты вторичного метаболизма (антибиотики, пигменты, бактериоцины и др.). Продолжительность этой фазы может быть от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от вида микроорганизма.
В стационарную фазу роста поведение клеток в бактериальной популяции может регулировать явление, которое получило название апоп- тоз. Суть его сводится к тому, что при исчерпании питательного субстрата голодающая популяция бактерий разделяется на две субпопуляции, одна из которых погибает и подвергается автолизу, клетки же другой популяции, используя продукты автолиза как субстрат, продолжают размножаться. Установлен механизм генетического контроля апоптоза у бактерий E. coli. Он осуществляется особым опероном maz, представленным двумя генами: mazE и mazF. Продукт гена mazF - стабильный цито- токсический белок-киллер, а продукт гена mazE - нестабильный белок Ма2Б, разрушающий белок-киллер. Истощение фонда аминокислот в питательной среде приводит к блокированию экспрессии оперона maz, в результате синтез белка Ма2Б прекращается и белок-киллер вызывает гибель и автолиз части популяции. В среде пополняется фонд аминокислот, синтез белка Ма2Б у оставшихся живых клеток активируется, и они продолжают размножаться.
В фазе отмирания происходит экспоненциальное снижение числа живых клеток. Скорость отмирания бактерий существенно варьирует в зависимости от условий среды и физиологических особенностей организма. Например, энтеробактерии отмирают медленно в отличие от некоторых видов бактерий рода Bacillus, скорость гибели которых происходит быстро. Причины отмирания клеток могут быть разными. Это и накопление органических кислот (как у бактерий родов Escherichia, Lactobacillus), автолиз (лизис над действием собственных ферментов), накопление антибиотиков, бактериоцинов и др.
В условиях непрерывного (проточного) культивирования в сосуд, содержащий популяцию бактерий, подается свежая питательная среда и из него одновременно удаляется часть среды с клетками микроорганизмов. Это позволяет на длительное время задержать культуру в состоянии экспоненциального роста.
Проточное культивирование осуществляется в аппаратах (ферментерах) двух типов: хемостатах и турбидостатах. Хемостат состоит из сосуда-культиватора, в который с заданной постоянной скоростью поступает питательная среда. Для равномерного и полного смешения питательных веществ содержимое культиватора механически перемешивается и аэрируется стерильным воздухом. Избыточная биомасса клеток с питательной средой вытекает из культиватора через сливной сифон. В хемостате прирост биомассы прямо пропорционален скорости притока субстрата и удаления продуктов метаболизма. Примером хемостата в природе служит рубец жвачных животных.
Турбидостат представляет собой ферментер, в котором поддерживается заданная плотность клеток за счет определения оптической плотности среды культивирования. Когда количество биомассы увеличивается относительно некоторого выбранного уровня, что фиксируется фотоэлементом, соединенным с системой реле, включается подача свежей питательной среды.
Для глубинного культивирования бактерий с аэрацией в промышленных и лабораторных условиях применяют биореакторы, или ферментеры. Они представляют собой герметические котлы, в которые заливается жидкая питательная среда. Ферментеры снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальное значение рН и редокс-потенциал, дозированное поступление необходимых питательных веществ. Кроме того, они снабжены системами перемешивания, аэрирования, охлаждения, пеногашения.
Непрерывное культивирование широко используется в промышленной микробиологии, а также при проведении физиологических, биохимических и генетических исследований, так как в данных условиях наблюдается константная плотность популяции и концентрация всех компонентов питательной среды.
Для изучения процессов обмена веществ на протяжении цикла клеточного деления часто необходимо, чтобы все клетки в популяции делились одновременно (синхронно). Культуры, в которых все клетки находятся на одинаковой стадии клеточного цикла и делятся одновременно, называют синхронными. Синхронизировать рост и деление клеток в какой-либо популяции можно различными искусственными приемами, такими как изменение температуры, изменение интенсивности освещения (для фототрофных микроорганизмов), лимитирование количества питательных веществ или фильтрование суспензии клеток микроорганизмов через специальный фильтр, позволяющий отобрать клетки одного размера. Однако в синхронизированном состоянии культура не может находиться длительное время и после двух-трех генераций процесс деления клеток асинхронизируется.
Культивирование иммобилизованных клеток микроорганизмов находит широкое применение в биотехнологии, а именно в производстве ценных органических веществ, в деградации токсичных природных и неприродных соединений, а также промышленных отходов, для очистки сточных вод от загрязнений.
Методы иммобилизации клеток основаны на способности микроорганизмов к адсорбции на твердых поверхностях. Существуют два принципиально различных подхода к иммобилизации: без образования ковалентной связи между клеткой и носителем (физические) и с образованием ковалентной связи между ними (химические).
Химические методы иммобилизации предполагают образование ковалентной связи между какой-либо из функциональных групп на поверхности клетки микроорганизма и материалом носителя. Они методы применяются сравнительно редко, так как клетки в этом состоянии могут терять нужную активность.
Физические методы иммобилизации реализуются в результате адсорбции микроорганизмов на поверхности различных нерастворимых синтетических или природных пористых материалов, при включении клеток в поры поперечносшитого геля и т. п. Например, при смешивании суспензии клеток с раствором полимера (полиакриламид, агароза и т. п.) с последующей полимеризацией образуется пространственная структура геля с включенными в его ячейки клетками микроорганизмов. В результате микроорганизмы оказываются заключенными в ячейки, которые ограничивают их перемещение, но не препятствуют поступлению питательных веществ и осуществлению каталитических функций.
В настоящее время разрабатываются методы иммобилизации клеток путем их включения в белковые мембраны с использованием коллагена, казеина, миозина и других белков или полипептидов. Мембраны с иммобилизованными клетками сворачивают в рулон и помещают в колонку, через которую пропускают субстрат.
Иммобилизованные клетки сохраняют высокую ферментативную активность, что позволяет использовать их в непрерывно действующих технологических процессах. При этом облегчается выделение продуктов биосинтеза.
Для культивирования микроорганизмов используются различные по составу питательные среды, в которых должны содержаться все вещества, необходимые для роста. В связи с тем что конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.
Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются источники углерода и азота. Их количественное отношение определяет специфичность подавляющего большинства сред.
Для культивирования автотрофных микроорганизмов необходимо обеспечить клетки углекислым газом, так как его концентрация в воздухе не превышает 0,03 % и поступление в среду за счет диффузии недостаточно для интенсивного роста микроорганизмов. В среды для культивирования автотрофов вносят чаще всего карбонат кальция (СаСО3), можно также вносить гидрокарбонат натрия (КаЫС03) или другие карбонаты. В некоторых случаях через среду продувают воздух, искусственно обогащенный 1-5 % углекислого газа.
Потребности гетеротрофов в углероде не могут быть удовлетворены при использовании СО2. Для их развития среда должна содержать источник углерода в виде органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмы-гетеротрофы способны использовать различные соединения - органические кислоты, спирты, углеводы, углеводороды, ароматические соединения и др. Но в лабораторной практике в качестве источника углерода чаще всего применяют глюкозу, так как это наиболее легко утилизируемое микроорганизмами соединение углерода.
Вторым по значимости компонентом питательной среды является азот. Азот входит в состав органических веществ клетки главным образом в восстановленной форме - в виде амино (-№Н2-)- или имино (-ЫИ-)-групп. Потребности микроорганизмов в источнике азота могут быть удовлетворены различными азотсодержащими соединениями, в которых азот имеет разную степень восстановленности. Для очень многих микроорганизмов это могут быть и соли аммония, которые вносят в среду в виде хлоридов или сульфатов. Однако следует помнить, что аммонийные соли - физиологически кислые вещества, по мере использования иона аммония в среде накапливается анион соответствующей кислоты, что приводит к заметному возрастанию кислотности среды и может отрицательно повлиять на развитие микроорганизмов.
Потребности значительного числа микроорганизмов в азоте могут быть удовлетворены нитратами. Питательные среды для культивирования таких микроорганизмов содержат нитраты в виде солей калия или натрия. В отличие от солей аммония, нитраты физиологически щелочные соединения, так как при использовании аниона N03 в среде накапливаются катионы К+ или №+. Нитриты для многих микроорганизмов токсичны, поэтому в качестве источника азота практически не используются.
Наиболее требовательные к азоту микроорганизмы культивируют на питательных средах, содержащих белки или продукты их неполного гидролиза - пептоны. Пептоны представляют собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотистых оснований, солей и микроэлементов. Их получают в результате воздействия протеолитическими ферментами на белки животного (мышечный белок, казеин) или растительного (соевая мука) происхождения. Необходимо иметь в виду, что микроорганизмы могут использовать пептон не только как источник азота, но и как источник углерода и энергии.
Кроме источников углерода и азота, микроорганизмам для построения веществ клетки необходимы также соединения серы, фосфора, калия, магния, кальция и других макроэлементов. Все они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности в этих элементах удовлетворяются обычно за счет минеральных солей. Так, потребности подавляющего большинства микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре. Все необходимые металлы (калий, натрий, кальций, марганец) и другие элементы микроорганизмы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит, как правило, М?Б04, натрия - №С1, кальция - СаС03 или СаС12.
Помимо макроэлементов, многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факторов роста. Факторы роста могут быть двух типов: неорганические и органические. К неорганическим факторам
роста относятся микроэлементы - Со, 7п, Мо, Мп, Бе, Си и др. Они входят в состав активных групп многих ферментов. В качестве органических факторов роста можно выделить витамины, пуриновые, пиримидиновые основания, аминокислоты. Факторы роста добавляют в питательную среду в значительно меньших количествах, чем макроэлементы. Следует помнить, что микроорганизмы усваивают аминокислоты в Ь-, а не в Б-форме.
Потребности микроорганизмов сразу в нескольких аминокислотах часто удовлетворяют, добавляя к среде гидролизат белка. Для получения гидролизатов используют белки животного (мясо, рыбу, желатину, казеин) или растительного (семена сои, подсолнечника, кукурузы) происхождения, а также клетки микроорганизмов (дрожжи, водоросли, бактерии). Гидролиз проводят с использованием протеолитических ферментов, кипячением минеральных кислот или крепких щелочей.
Некоторые натуральные вещества, к числу которых относятся дрожжевой или кукурузный экстракт, содержат сразу несколько различных факторов роста (витамины, минеральные соли, аминокислоты).
Все питательные среды по составу делятся на натуральные и синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К средам такого типа относятся овощные или фруктовые соки, ткани животных, молоко, отвары мяса, вытяжки почвы, различные части растений, клетки микроорганизмов. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей.
Синтетические среды - это среды, в которые входят соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Они широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов.
Наряду с натуральными и синтетическими выделяют полусинтети- ческие среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и др. Однако в них всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой, почвенный, кукурузный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
По назначению среды подразделяют на элективные и дифференциально-диагностические. Элективные среды предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечивают преимущественное развитие определенной физиологической группы микроорганизмов. Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других и выявить некоторые их особенности. Эти среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации микроорганизмов. Примером таких сред являются среды Гис- са, которые используются для изучения сахаролитических свойств микроорганизмов, т. е. способности ферментировать те или иные углеводы и спирты.
В состав среды Гисса входит основной фон (пептон и К2НРО4), индикатор (бромтимоловый синий, бромкрезоловый пурпурный, Андреде и др.) и один из изучаемых углеводов или спиртов. Различают малый и большой пестрый ряд Гисса. В малый ряд Гисса входят следующие углеводы и спирты: глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза и маннит. В большой пестрый ряд Гисса входят, кроме тех, что образуют малый ряд, другие углеводы и спирты, например арабиноза, рамноза, сорбит, дульцит и т. д. Среды Гисса можно использовать в жидком или полужидком состоянии. В последнем случае к жидкой среде добавляют 0,5 % агара. Рост микроорганизмов на средах Гисса может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Выделение этих продуктов регистрируется по изменению рН среды. Например, если среда Гисса содержит индикатор бромтимоловый синий, то цвет ее будет изменяться в зависимости от рН следующим образом: рН = 7,0 - зеленый; рН > 7,0 - синий; рН < 7,0 - желтый.
По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие, плотные, или твердые, среды. Жидкие среды применяют для накопления биомассы или продуктов обмена, для исследования физиологии и биохимии микроорганизмов. Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби и др. Плотные среды используют для выделения чистых культур, определения количества жизнеспособных микроорганизмов, хранения культур в коллекциях, для накопления биомассы и др.
В целях уплотнения сред применяют агар, желатину или силикагель (кремнекислый гель). Для уплотнения чаще всего используют агар. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входят агароза и агаропектин. Агар получают из красных морских водорослей. Он удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при температуре 100 °С и затвердевает при 40 °С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при относительно высокой температуре. Желатина - это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуек. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 25 °С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30-37 °С). Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмы выделяют в среду. Эти свойства желатины ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Силикагель используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава.
Для жизнедеятельности микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как плотность среды, аэрация, температура, свет и влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных диапазонах значения каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов они часто неодинаковы.
Так как рН среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов, то в приготовленных средах всегда следует определять значение рН, которое может изменяться в процессе стерилизации. Поэтому после стерилизации рН следует повторно проверить и, если это требуется, установить нужное значение, стерильными растворами низкой концентрации кислоты или щелочи. В процессе культивирования микроорганизмов рН среды часто меняется и для того, чтобы не допустить чрезмерного изменения и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы или избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Лучше всего контролировать рН среды в ферментерах, применяемых для проточного культивирования.
Поскольку микроорганизмы по-разному относятся к молекулярному кислороду, это определяет и различия в способах их культивирования.
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом:
на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха;
в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования - выращивание на шейкерах (качалках), обеспечивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью 100-200 об/мин и более. Помимо перемешивания, аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды стерильного воздуха.
Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для этого используют различные приемы для создания анаэробных условий. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве.
К физическим методам создания анаэробных условий относится выращивание микроорганизмов в микроанаэростатах - вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный стеклянный эксикатор с притертой крышкой. Из анаэро- стата откачивают воздух, а затем заполняют его газовой смесью, состоящей на 80-90 % из азота и на 10-20 % углекислого газа, до давления порядка 500 мм рт. ст.
К химическим методам создания анаэробных условий относится использование химических веществ, поглощающих кислород. В качестве поглотителей кислорода в лабораторной практике применяется щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (№2Б204), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реагенты. Поглотители помещают на дно химического эксикатора, в который помещают анаэробные микроорганизмы, засеянные в пробирки, колбы или чашки Петри. Эксикатор закрывают притертой крышкой. При этом способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность используемых веществ и объем замкнутого пространства, в котором выращивается культура.
Биологический способ создания анаэробных условий заключается в следующем. Питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают облигатные аэробные бактерии, а на другую облигатные анаэробные бактерии. Чашку закрывают, зазор между донышком и крышкой заливают парафином или воском и помещают в термостат с оптимальной для роста микроорганизмов температурой. Вначале наблюдается рост аэробных микроорганизмов (до истощения свободного кислорода), после чего начинается размножение клеток анаэробов.
Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:
выращивание в высоком слое среды;
выращивание в толще плотной среды;
культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости;
заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового масла или парафина.
Метаболизм - это совокупность биохимических процессов, протекающих в клетке и обеспечивающих ее жизнедеятельность. Клеточный метаболизм складывается из двух противоположно направленных процессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и конструктивного метаболизма (анаболизма).
Энергетический метаболизм (катаболизм) - это совокупность реакций окисления различных восстановленных органических и неорганических соединений, сопровождающихся выделением энергии, аккумулируемой клеткой в форме фосфатных связей.
Конструктивный метаболизм (анаболизм) - это совокупность реакций биосинтеза, в результате которых за счет веществ, поступающих извне, и промежуточных продуктов (амфиболитов), образующихся при катаболизме, синтезируется вещество клеток. Этот процесс связан с потреблением свободной энергии, запасенной в молекулах АТФ или других богатых энергией соединениях.
Конструктивный и энергетический метаболизм состоит из ряда последовательных ферментативных реакций, протекание которых условно можно представить следующим образом. На начальном этапе воздействию подвергаются молекулы химических веществ, которые служат исходными субстратами для метаболизма обоих типов. Иногда эту часть метаболического пути называют периферическим метаболизмом, а ферменты, катализирующие первые этапы превращения субстрата, - периферическими. Последующие превращения (промежуточный метаболизм) включают ряд ферментативных реакций и приводят к синтезу промежуточных продуктов. Образующиеся на последних этапах конечные продукты конструктивных путей используются для построения вещества клеток, а энергетических - выделяются в окружающую среду.
Конструктивные и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. У большинства прокариот они тесно связаны между собой. В процессе анаболизма синтезируются многочисленные ферменты, участвующие в энергетическом метаболизме. С другой стороны, в реакциях
катаболизма образуется не только энергия для биосинтетических целей, но и многие промежуточные продукты, которые необходимы для синтеза веществ, входящих в состав клеточных структур.
Метаболизм прокариот, как энергетический, так и конструктивный, отличается чрезвычайным разнообразием. Это является результатом того, что бактерии в качестве источников энергии и углерода могут использовать самый широкий набор органических и неорганических соединений. Такая способность обусловлена различиями в наборе клеточных периферических ферментов, или экзоферментов, относящихся к классу гидролаз, которые выделяются наружу и разрушают макромолекулы исходных субстратов до веществ с низкой молекулярной массой. Образующиеся в результате действия таких ферментов вещества поступают в клетку бактерий и подвергаются действию ферментов промежуточного метаболизма. Эти ферменты называются эндоферментами, так как они локализуются внутри клетки. Эндоферменты, синтезируемые микроорганизмами, относятся ко всем известным классам ферментов - оксидоредуктазам, трансферазам, гидролазам, лиазам, изомеразам и др. Многие из эндоферментов локализованы на мембранах или на рибосомах, в таком состоянии они называются связанными ферментами. Другие ферменты находятся в свободном, растворенном состоянии в цитоплазме.
Набор ферментов в клетке может изменяться в зависимости от условий, в которых обитают бактерии, соответственно все ферменты подразделяют на две группы: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные ферменты синтезируются постоянно, независимо от наличия веществ-субстратов. В клетке они обнаруживаются в более или менее постоянных концентрациях. Примером конститутивного фермента является ДНК-полимераза. Индуцибельные ферменты синтезируются в ответ на появление в среде субстрата-индуктора. К ним относится большинство гидролаз. Способность к индукции синтеза таких ферментов обеспечивает быструю приспособляемость бактерий к конкретным условиям.
Таким образом, назначение метаболизма состоит в следующем:
генерация энергии в молекулах АТФ или других богатых энергией соединениях;
образование субъединиц, из которых синтезируются макромолекулы основных биополимеров клетки (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов);
активация образованных субъединиц за счет переноса фосфатной группы с АТФ, происходящая с затратой энергии. Тем не менее этот
процесс необходим, поскольку только активированные субъединицы способны вступать в реакции полимеризации;
синтез специфических макромолекул из активированных субъединиц, т. е. их полимеризация. Полимеризация активированных субъединиц может происходить двумя способами:
а) в реакциях матричного синтеза (так синтезируются белки и нуклеиновые кислоты);
б) за счет простой конденсации одинаковых активированных субъединиц (например, образование молекул крахмала из остатков глюкозы).
Ранее было отмечено, что по отношению к энергетическим источникам все микроорганизмы подразделяются на две группы: хемотрофные и фототрофные. Хемотрофные микроорганизмы используют для синтеза молекул АТФ энергию, освобождаемую в результате химических реакций, фототрофные - световую энергию в процессе протекания фотосинтеза.
Синтез молекул АТФ из АДФ и фосфатов может происходить двумя способами:
фосфорилированием в дыхательной или фотосинтетической элек- тронтранспортной цепи. Этот процесс у прокариот связан с мембранами или их производными, поэтому его называют мембранным фосфорили- рованием. Синтез АТФ в данном случае происходит при участии фермента АТФ-синтазы:
АДФ + Фн —? АТФ;
фосфорилированием на уровне субстрата. При этом фосфатная группа переносится на АДФ от вещества (субстрата), более богатого энергией, чем АТФ:
Б ~ Ф + АДФ —- Б + АТФ.
Такой способ синтеза АТФ получил название субстратного фосфо- рилирования. В клетке реакции субстратного фосфорилирования не связаны с мембранными структурами и катализируются растворимыми ферментами промежуточного метаболизма.
У хемотрофных бактерий генерация энергии в молекулах АТФ сводится к двум типам биохимических реакций: окисления и восстановления. Окисляться микроорганизмами могут самые разнообразные органические и неорганические вещества, являющиеся донорами электронов.
Поскольку электроны не могут самостоятельно существовать, они обязательно должны быть перенесены на молекулы, способные их воспринимать. Такие молекулы называются акцепторами электронов. Донором электронов не может быть предельно окисленное вещество, а их акцептором - предельно восстановленное. При биологическом окислении чаще всего происходит одновременный перенос двух электронов; при этом от субстрата отщепляются также два протона (Н+). Такое окисление субстрата, происходящее с отщеплением двух протонов и двух электронов, называется дегидрированием. Поэтому нередко термины «донор водорода» и «донор электронов» употребляются как синонимы.
Все окислительно-восстановительные реакции энергетического метаболизма у хемотрофных микроорганизмов можно разделить на три типа:
аэробное дыхание, или аэробное окисление;
анаэробное дыхание;
брожение.
Основной процесс энергетического метаболизма многих прокариот - аэробное дыхание, при котором донором водорода или электронов являются органические (реже неорганические) вещества, а конечным акцептором - молекулярный кислород. Основное количество энергии при аэробном дыхании образуется в электронтранспортной цепи, т. е. в результате мембранного фосфорилирования.
Анаэробное дыхание - цепь анаэробных окислительно-восстановительных реакций, которые сводятся к окислению органического или неорганического субстрата с использованием в качестве конечного акцептора электронов не молекулярного кислорода, а других неорганических веществ (нитрата - N03, нитрита - N02, сульфата - 80^, сульфита
80^, С02 и др.), а также органических веществ (фумарата и др.). Молекулы АТФ в процессе анаэробного дыхания образуются в основном в электронтранспортной цепи, т. е. в результате реакций мембранного фосфорилирования, но в меньшем количестве, чем при аэробном дыхании.
Брожение - совокупность анаэробных окислительно-восстановительных реакций, при которых органические соединения служат как донорами, так и акцепторами электронов. Как правило, доноры и акцепторы электронов образуются из одного и того же субстрата, подвергающегося брожению (например, из углевода). Сбраживанию могут подвергаться различные субстраты, но лучше других используются углеводы. АТФ при брожении синтезируется в результате реакций субстратного фосфорилирования.
Наиболее выгодным типом окислительно-восстановительных реакций у бактерий, в результате которых генерируется наибольший запас энергии в виде молекул АТФ, является аэробное дыхание. Наименее выгодным типом энергодающих реакций является брожение, сопровождающееся минимальным выходом АТФ.
Поскольку большинство микроорганизмов в качестве источника энергии использует углеводы, и в первую очередь глюкозу, рассмотрим основные пути ее расщепления или катаболизма.
У бактерий возможны три пути катаболизма глюкозы:
гликолиз, или фруктозодифосфатный путь, или путь Эмбдена - Мейергофа - Парнаса (по имени исследователей, внесших большой вклад в изучение этого процесса);
окислительный пентозофосфатный путь, или гексозомонофосфат- ный путь, или путь Варбурга - Диккенса - Хореккера;
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный путь (КДФГ-путь), или путь Энтнера - Дудорова.
Следует отметить, что все перечисленные пути катаболизма глюкозы у микроорганизмов могут протекать при разных типах энергетического метаболизма (аэробное дыхание, анаэробное дыхание, брожение).
Все пути катаболизма начинаются с того, что глюкоза, поступившая в клетку, сначала фосфорилируется при участии фермента гексокиназы и АТФ как донора фосфата. Образуется глюкозо-6-фосфат, который представляет метаболически активную форму глюкозы в клетке и служит исходным соединением для любого из трех путей катаболизма углеводов.
Пути расщепления глюкозы состоят из многих биохимических реакций, каждая из которых катализируется специфическим ферментом.
Наиболее распространенным путем катаболизма глюкозы у многих микроорганизмов является гликолиз (рис. 31). При этом глюкозо-6-фос- фат изомеризуется с помощью глюкозофосфатизомеразы и фосфорили- руется далее в фруктозо-1,6-дифосфат, который затем расщепляется на 3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) и фосфодиоксиацетон. Последний под действием фермента триозофосфатизомеразы превращается в 3-ФГА. Таким образом, из одной молекулы глюкозы образуются две молекулы 3-ФГА. На эти реакции превращения глюкозы в 3-ФГА затрачивается энергия двух молекул АТФ. Далее происходит окисление каждой молекулы 3-ФГА до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты (1,3-ФГК).
ФГК - высокоэнергетическое соединение, содержащее макроэр- гическую фосфатную связь, реагирует с АДФ (фермент фосфоглицерат- киназа), отдавая высокоэнергетическую фосфатную группу, в результате чего синтезируется молекула АТФ.
Далее 3-ФГК под действием фермента фосфоглицеромутазы превращается в 2-ФГК, из которой в результате отщепления воды образуется фосфоенолпировиноградная кислота (ФЕП). Это также высокоэнергетический фосфат, с которого богатая энергией фосфатная группа переносится пируваткиназой на АДФ, образуется молекула АТФ и пировино- градная кислота (ПВК). Это второе фосфорилирование на уровне субстрата:
СОоН СОоН
со Ф Пируваткиназа С— 0
С0 Ф + АДФ С“ о + АТФ
сн сн
ФЕП ПВК
Таким образом, при распаде одной молекулы глюкозы образуется четыре молекулы АТФ, в которых аккумулируется освободившаяся энергия. Поскольку в начале процесса на активирование глюкозы были затрачены две молекулы АТФ, чистый выход АТФ на одну молекулу глюкозы составляет две молекулы. Суммарное уравнение гликолиза можно записать следующим образом:
Пентозофосфатный путь расщепления углеводов характерен для некоторых представителей семейства ЕМегоЬа^епасеае, а также для ге- тероферментативных молочнокислых бактерий и некоторых маслянокислых бактерий. В этом цикле глюкозо-6-фосфат, образующийся путем активирования глюкозы молекулой АТФ, превращается через ряд промежуточных реакций в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая подвергается окислению и декарбоксилированию с образованием рибулозо-5- фосфата, СО2 и НАДФ • Н2 . Рибулозо-5-фосфат включается в сложный цикл, приводящий к образованию из трех его молекул двух молекул глю- козо-6-фосфата и одной молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида. Глюкозо-6-фосфат может снова включаться в цикл, а 3-ФГА может быть превращен в пировиноградную кислоту.
С энергетической точки зрения этот путь катаболизма углеводов в 2 раза менее эффективен, чем гликолитический, так как при окислении одной молекулы глюкозы образуется только одна молекула АТФ. Однако большое значение этого пути в том, что он обеспечивает клетки бактерий пентозами (рибулозо-5-фосфатом), которые являются предшественниками нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Кроме того, в этом цикле образуются две молекулы НАДФ • Н2, которые необходимы клетке для восстановительных реакций биосинтеза.
Путь Энтнера - Дудорова встречается у прокариот реже других. Он характерен в основном для псевдомонад и уксуснокислых бактерий. От пентозофосфатного пути он отличается тем, что 6-фосфоглюконовая кислота превращается в пировиноградную кислоту и 3-ФГА. Последний может превращаться в пировиноградную кислоту. Из одной молекулы глюкозы при функционировании этого пути синтезируется одна молекула АТФ, по одной молекуле НАДФ • Н2 и НАД • Н2. Следует подчеркнуть, что путь Энтнера - Дудорова является самым кратчайшим механизмом расщепления углеводов до пировиноградной кислоты.
Таким образом, рассмотрев пути катаболизма глюкозы, мы можем заключить, что важнейшим продуктом, образующимся в них, является пировиноградная кислота, которая подвергается дальнейшим превраще
ниям. Пируват занимает центральное положение в метаболизме клеток и может служить предшественником многих продуктов.
Пировиноградная кислота, образующаяся в одном из трех вышеперечисленных путей катаболизма глюкозы, окисляется с участием коэнзи- ма А до ацетил-КоА. В данном процессе работают ферменты пируватде- гидрогеназы:
Ацетил-КоА является исходным субстратом цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), или цикла Кребса.
В цикл Кребса включается одна молекула ацетил-КоА, которая в реакции с оксалоацетатом, катализируемой цитратсинтетазой, приводит к образованию лимонной кислоты и свободного коэнзима А. Лимонная кислота с помощью фермента аконитазы превращается в цис-акотиновую и изолимонную кислоты. Изолимонная кислота через щавелевоянтарную кислоту превращается в а-кетоглутаровую кислоту, которая подвергается дальнейшему декарбоксилированию.
В конечном итоге окисление ацетил-КоА в ЦТК приводит к образованию двух молекул СО2, одной молекулы АТФ и восьми атомов водорода, из которых шесть атомов связаны в молекулах пиридиннуклеоти- дов и два атома - в молекулах флавопротеинов (рис. 33).
Таким образом, цикл трикарбоновых кислот выполняет функцию конечного окисления органических веществ, обеспечивает образование восстановительных эквивалентов для окислительного фосфорилирования и биосинтетические процессы клетки различными предшественниками, такими как оксалоацетат, сукцинат, а-кетоглутарат и др.
У некоторых бактерий цикл трикарбоновых кислот «разорван». Наиболее часто отсутствует этап превращения а-кетоглутаровой кислоты в янтарную. В таком виде ЦТК не может функционировать в системе энергодающих реакций клетки. Основная функция «разорванного» ЦТК - биосинтетическая.
р/-р-КоА
Рис. 33. Цикл Кребса
Образовавшиеся на разных этапах окисления органических веществ НАД • Н2 и ФАД • Н2, поступают в дыхательную цепь, которая у бактерий находится в цитоплазматической мембране, а у эукариот - в мембране митохондрий. В дыхательной цепи НАД • Н2 и ФАД • Н2 вновь окисляются до НАД и ФАД, а отщепившийся от них водород передается не менее чем через пять переносчиков на заключительный участок цепи, где соединяется с молекулярным кислородом, образуя воду (рис. 34).
Транспорт водорода с участием компонентов дыхательной цепи сопровождается протеканием ряда окислительно-восстановительных реакций. В некоторых из них выделяется достаточно энергии для образования АТФ, и такой процесс носит название окислительного фосфорили- рования. В реакциях окислительного фосфорилирования принимает уча
стие специальный фермент АТФ-синтаза, который катализирует превращение АДФ в АТФ.
Дыхательные цепи микроорганизмов состоят из следующих важнейших, локализованных в мембране, переносчиков атомов водорода или электронов: флавопротеинов, железосерных белков, хинонов и цито- хромов.
Флавопротеины - коферменты, в состав которых входит витамин В2, а в качестве простетических групп в них выступают флавинмононуклеотид (ФМН) или флавинадениндинуклеотид (ФАД). Флавопротеины осуществляют перенос атомов водорода, т. е. являются дегидрогеназами. Дегидрогеназа, содержащая в качестве простетической группы ФМН, является НАДФ • Н2-дегидрогеназой. Это стартовый переносчик в дыхательной цепи, осуществляющей перенос водорода с НАДФ • Н2 на следующие компоненты дыхательной цепи. Дегидрогеназа, содержащая в качестве простетической группы ФАД, действует как сукцинатдегидро- геназа. Она катализирует окисление янтарной кислоты в фумаровую в ЦТК. Атомы водорода от ФАД • Н2 поступают сразу на хиноны, локализованные на последних этапах электронтранспортной цепи.
Железосерные белки (БеБ-белки) содержат железосероцентры, в которых атомы железа связаны, с одной стороны, с серой аминокислоты цистеина, а с другой - с неорганической сульфидной серой.
Железосероцентры входят в состав некоторых флавопротеинов (например, сукцинатдегидрогеназы и НАДФ • Н2-дегидрогеназы), или же служат в качестве единственных простетических групп белков. Дыхательные цепи содержат большое число БеБ-центров. Железосероцентры в зависимости от строения могут осуществлять одновременный перенос одного или двух электронов, что связано с изменением валентности атомов железа.
Хиноны - жирорастворимые соединения. У грамотрицательных бактерий они представлены убихиноном (кофермент Q) или менахиноном (рис. 36).
О
Н
Рис. 36. Хиноны грамотрицательных бактерий:
А - кофермент Q (убихинон); Б - менахинон
Хиноны липофильны, и поэтому локализуются в липидной фазе мембраны. Они переносят атомы водорода. По сравнению с другими компонентами дыхательной цепи, хиноны содержатся в 10-15-кратном избытке. Они служат «сборщиками» водорода, поставляемого различными ко- ферментами и простетическими группами в дыхательной цепи, и пере
дают его цитохромам. Таким образом, они функционируют в дыхательной цепи на участке между флавопротеинами и цитохромами.
Цитохромы принимают участие на заключительном этапе в цепи переноса электронов. К ним электроны поступают от хинонов. В качестве простетической группы цитохромы содержат гем. Цитохромы окрашены; они отличаются друг от друга спектрами поглощения и окислительно-восстановительными потенциалами. Различают цитохромы а, а3, b, c, о и ряд других. Наиболее широко распространен цитохром с. Он найден почти у всех организмов, обладающих дыхательной цепью. Конечные (терминальные) цитохромы дыхательной цепи - это цитохромы а + а3 или цитохромоксидаза. Они передают электроны на молекулярный кислород, т. е. катализируют восстановление молекулярного кислорода до воды. В реакционном центре цитохромоксидазы, помимо двух гемов, содержатся два атома меди.
Дыхательная цепь построена таким образом, что одни ее компоненты переносят только атомы водорода, а другие - только электроны. Причем переносчики атомов водорода и переносчики электронов последовательно чередуются в дыхательной цепи. Флавопротеины и хиноны осуществляют перенос атомов водорода, а FeS-белки и цитохромы - электронов.
В составе дыхательных цепей у микроорганизмов выявлены определенные различия. В качестве примера сравним дыхательные цепи в митохондриях дрожжей (рис. 37) и у бактерий E. coli (рис. 38).
Установлено, что в дыхательной цепи митохондрий дрожжей существуют три пункта фосфорилирования, которые соответствуют участкам выхода протонов во внешнюю среду. Первый участок локализован в начале дыхательной цепи и связан с функционированием НАДФ • Н2-дегид- рогеназы. Второй определяется способностью убихинона переносить водород. Последний локализован в конце дыхательной цепи и связан с активностью цитохромоксидазы. Если роль донора водорода выполняет ФАД • Н2, то возможны только два пункта фосфорилирования, так как при этом выпадает участок дыхательной цепи, где располагается НАДФ • Н2-дегидрогеназа.
непроницаемы для ионов, в том числе и для Н+, и ОН-, то создается трансмембранный электрохимический, или протонный градиент между наружной и внутренней их сторонами. Протоны могут обратно поступать через мембрану только в определенных местах. В некоторых из них располагаются специфические белки - АТФ-синтазы. АТФ-синтаза - многокомпонентный белковый комплекс, состоящий из гидрофильной головки (5 субъединиц, представленных в различных количественных соотношениях), обращенной в цитоплазму, ножки и основания (3 субъединицы), погруженного в мембрану. В процессе переноса протонов через мембрану АТФ-синтаза катализирует присоединение фосфата к АДФ с отщеплением воды, в результате образуется АТФ. Однако, в настоящее время пока в деталях не ясно, каким образом энергия трансмембранного электрохимического градиента используется в реакциях фосфорилирова- ния.
Установлено, что синтез молекулы АТФ связан с переносом двух протонов через комплекс АТФ-синтазы. Так как при окислении НАД • Н2 молекулярным кислородом выделяется шесть протонов, то, следовательно, максимальный выход АТФ в этом процессе составляют три молекулы. При окислении ФАД • Н2, возможны два пункта фосфорилирования.
Теперь подсчитаем, каков энергетический выход при окислении одной молекулы глюкозы при аэробном дыхании у дрожжей:
в процессе гликолиза образуются по две молекулы АТФ, НАД • Н2 и пирувата;
при окислительном декарбоксилировании двух молекул пирувата образуются две молекулы ацетил-КоА и две молекулы НАД • Н2;
окисление двух молекул ацетил-КоА в цикле Кребса приводит к образованию шести молекул НАД • Н2, двух молекул ФАД • Н2 и двух молекул АТФ.
В итоге образуются четыре молекулы АТФ, 10 молекул НАД • Н2, две молекулы ФАД • Н2. Установлено, что при окислении одной молекулы НАД • Н2 максимально образуются три молекулы АТФ, при окислении одной молекулы ФАД • Н2 - две молекулы АТФ. Следовательно, при окислении 10 молекул НАД • Н2 выход составляет 30 молекул АТФ, а двух молекул ФАД • Н2 - четыре молекулы АТФ.
Суммарный энергетический выход аэробного дыхания у эукариотических микроорганизмов, когда катаболизм глюкозы осуществляется гликолитическим путем, составляет 38 молекул АТФ:
Для аэробных прокариот характерна меньшая степень сопряжения электронного транспорта в дыхательной цепи с фосфорилированием. Рассмотрим на примере бактерий E. coli. Как видно из рис. 40, в дыхательной цепи этих бактерий имеются только два пункта, в которых происходит «выброс» протонов, а не три, как в случае митохондриальной цепи у дрожжей. Следовательно, при окислении одной молекулы НАД • Н2 образуются только две молекулы АТФ, а при окислении молекулы ФАД • Н2 - одна молекула АТФ.
Таким образом, при аэробном дыхании у бактерий E. coli, когда катаболизм глюкозы происходит гликолитическим путем, образуется 26 молекул АТФ:
две молекулы АТФ синтезируются в гликолизе;
две молекулы АТФ синтезируются в двух оборотах цикла Кребса;
10 молекул НАД • Н2 приводят к синтезу 20 молекул АТФ;
две молекулы ФАД • Н2 приводят к синтезу двух молекул АТФ.
У других прокариот, таких как Corynebacterium diphtheriae, в дыхательной цепи имеется только один пункт «выброса» протонов. У Mycobacterium phlei - три, как в дыхательной цепи митохондрий дрожжей. Из этого можно сделать вывод, что дыхательные цепи различных бактерий
существенно различаются и они в основном значительно менее энергетически эффективны.
Образовавшиеся на разных этапах окисления органических веществ НАД • Н2 и ФАД • Н2, поступают в дыхательную цепь, которая у бактерий находится в цитоплазматической мембране, а у эукариот - в мембране митохондрий. В дыхательной цепи НАД • Н2 и ФАД • Н2 вновь окисляются до НАД и ФАД, а отщепившийся от них водород передается не менее чем через пять переносчиков на заключительный участок цепи, где соединяется с молекулярным кислородом, образуя воду (рис. 34).
Хиноны - жирорастворимые соединения. У грамотрицательных бактерий они представлены убихиноном (кофермент Q) или менахиноном (рис. 36).
Таким образом, при аэробном дыхании у бактерий E. coli, когда катаболизм глюкозы происходит гликолитическим путем, образуется 26 молекул АТФ: