Другим из упомянутых важнейших физико-химических свойств аминокислот является способность к электролитической диссоциации (ионизации). Благодаря наличию карбоксильной группы происходит диссоциация по типу кислоты с образованием аниона и освобождением протона в среду. Аминогруппа диссоциирует по типу основания/- путем присоединения протона из водной среды с образованием катиона (положительный заряд на атоме азота). Вещества, способные диссоциировать и по типу кислоты, и по типу основания, обозначаются как амфотерные вещества. Продукты полной диссоциации таких молекул называются амфотерными ионами, или амфионами (рис.
3). Способность аминокислот к ионизации выражена настолько сильно, что они полностью диссоциированы и пребывают в форме амфионов не только в физиологических условиях (в живом организме), но даже в кристаллическом состоянии.
Таким образом, и по второму из важнейших физико-химических свойств - по склонности к ионизации - каждая аминокислота тоже проявляет двойственность, будучи способной диссоциировать и по типу кислоты, и по типу основания. Естественно, это распространяется и на белки.
Схема на рис. 1-3 показывает, что диссоциация аминокислот, содержащих одну карбоксильную и одну аминогруппу, не сопрово-
ждается изменением уровня водородных ионов в среде. Иными словами, при растворении таких аминокислот в воде pH раствора остается нейтральным, т.е. близким 7. Образующийся амфион обладает положительным и отрицательным зарядами, которые взаимно уравновешиваются, так что в целом молекула аминокислоты электронейтральна.
Рис. 1-6. Ионизация лизина.
Рис. 1-4. Ионизация аспарагиновой кислоты.
Однако некоторые аминокислоты имеют ионизирующиеся группы не только в стандартном фрагменте молекулы, но и в составе радикала И. Так, аспарагиновая кислота содержит в нем карбоксильную группу, а лизин - аминогруппу. Эти группы тоже легко диссоциируют. В результате при растворении, например, аспарагиновой кислоты в воде происходит подкис- ление среды (отсюда и название этого вещества), а сама аминокислота находится в растворе в форме аниона, в котором из двух отрицательных зарядов только один уравновешен положительным зарядом на атоме азота (рис. 1-4).
Рис. 1-5. Подавление ионизации карбоксильных групп аспартатз постепенным добавлением сильной кислоты (А - анионная, Б - элекгронейтральная, В - катионная формы аминокислоты).
Добавление сильной кислоты к раствору аспартата подавляет диссоциацию карбоксильных групп (равновесие реакции, приведенной на рис. 1-4, сдвигается влево). Постепенным подкислением можно добиться того, что диссоциация карбоксильных групп будет подавлена ровно наполовину. При этом амфион аспарагиновой кислоты станет электронейтраль- ным (рис. 1-5, Б), т.к. один оставшийся отрицательный заряд компенсируется положительным зарядом на атоме азота. В данном случае это произойдет при значении pH среды, равном 2,77. Если же продолжать добавление сильной кислоты, то в конце концов можно подавить диссоциацию и второй карбоксильной группы, и тогда молекула аспарагиновой кислоты предстанет в форме катиона (рис. 1-5, В).
В противоположность аспарагиновой кислоте, лизин при растворении в аоде подщелачивает среду, забирая из нее два протона (для ионизации аминогрупп) взамен одного, освобождаемого при диссоциации карбоксильной группы. Соответственно, сама аминокислота пребывает в катионной форме (рис. 1-6).
Рис. 1-7. Подавление ионизации аминогрупп лизина постепенным добавлением щелочи (А - катионная, Б - электронейтральная, В - анионная формы аминокислоты).
Диссоциацию аминогрупп лизина можно подавлять добавлением щелочи, которое ведет к повышению концентрации гидроксильных ионов НО- в среде. Они «отнимают» протоны от ионизированных аминогрупп, превращаясь в воду. При определенной концентрации гидроксильных групп установится такое равновесное состояние, когда половина аминогрупп будет пребывать в депротонированном состоянии, так что молекулы аминокислоты станут электро- нейтральными (рис. 1-7, Б). В растворах лизина этот момент наступает при pH среды, равном 9,82. Если продолжать добавление щелочи, то можно достичь практически полного подавления диссоциации аминогрупп; молекулы лизина превратятся при этом в свою анионную форму (рис. 1-7, В).
Итак, каждая аминокислота всегда несет на себе хотя бы один электрический заряд, равный по величине заряду электрона или протона. Обычно же имеются и отрицательные, и положительные заряды в одной молекуле. Иногда они уравновешивают друг друга, и тогда молекула находится в электронейтрапьном состоянии, т.е. ведет себя в электрическом поле как незаряженная частица. Наличие (и характер) заряда или его отсутствие зависят, с одной стороны, от соотношения кислотных и основных групп в молекуле и, с другой стороны, от pH среды.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ) - это то значение pH среды, при котором молекула ам- фотерного вещества находится в электропей- тральном состоянии (т.е., число группировок, диссоциированных по типу основания, в точности равно числу групп, диссоциированных по типу кислоты). По аналогии с pH, значения ИЭТ выражают отрицательным логарифмом соответствующей концентрации водородных ионов в среде и обозначают символом р1.
Из приведенных выше примеров видно, что для аминокислот, у которых в составе радикала I* имеется кислотная групппа (обычно - карбоксильная), ИЭТ находится в кислой среде. Если же в составе радикала есть группа, диссоциирующая по типу основания (например, группа -1ЧН2 в молекуле лизина), то ИЭТ находится в щелочной среде. Наконец, моно- аминомонокарбоновые кислоты (см. рис. 1-3) должны иметь р1 в нейтральной среде (фактически же ИЭТ таких аминокислот находится в слабокислой среде - при pH около 6,0 - из-за того, что способность а-аминогрупп диссоциировать по типу основания выражена заметно слабее, чем кислотные свойства у карбоксильных групп).
Таким образом, с помощью параметра среды (pH раствора в изоэлектрической точке) можно получить представление о соотношении кислотных и основных групп в молекуле амфо- терного вещества. Особенно важно это для белков, в молекуле которых имеется множество (нередко - десятки) тех и других группировок. Более того: изменяя pH среды, можно переводить любые амфионы в электронейтраль- ное состояние или придавать молекуле в целом отрицательный либо положительный заряд. Как видно из приведенных схем, при pH ниже изоэлектрической точки молекулы амфотерных веществ (в том числе аминокислот) переходят в катионную форму, а в среде, более щелочной, чем р1, — в анионную форму. И чем дальше pH среды отстоит от ИЭТ, тем большая доля молекул находится в виде заряженной частицы. Так, все молекулы лизина электронейтральны при pH = р1 = 9,82. Подкисление среды на
или 2 единицы pH (т.е. до значений 8,82 или 7,82) переводит в катионную форму соответственно 75 и 95% молекул этой аминокислоты. Напротив, подщелачивание среды на 1 или
единицы pH переводит соответственно 75 и 95% молекул лизина в форму аниона. Даже очень незначительный сдвиг pH вблизи р1 оказывает существенное влияние. Так, сдвиг относительно ИЭТ всего на 0,1 единицы pH переводит примерно 6% молекул аминокислоты в
форму катиона или аниона (в зависимости от направления сдвига, разумеется).
Электролитическая диссоциация аминокислот (и белков) относится к числу наиболее простых и наглядных проявлений одного из фундаментальных свойств живой материи - способности реагировать на изменения условий среды и отвечать на них вполне однозначным, предсказуемым образом. В частности, влияние pH среды на степень заряженности радикалов аминокислот, входящих в состав белка, отражается прежде всего на суммарном заряде всей белковой молекулы в целом. Это важно само по себе. Однако, несравненно весомее изменения степени диссоциации радикала той аминокислоты, которая играет главную роль в функционировании данного белка. Например, не случайно в состав каталитического центра многих ферментов входит гистидин, имидазольный радикал которого имеет константу ионизации (рК=6,0), гораздо более близкую к физиологическим значениям pH среды, чем у любой другой из кодируемых аминокислот. Поэтому даже небольшие изменения pH в микроокружении имидазольного радикала, наступающие, например, под влиянием приближающейся молекулы субстрата, заметно влияют на ионизацию этого радикала и тем самым позволяют ему участвовать в осуществлении ферментативного катализа.
КЛАССИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
В первых попытках систематизации аминокислот исходили из химического строения молекул (соотношение амино- и карбоксильных групп, наличие разветвленных или циклических структур и т.д.). Однако, современная биохимия отдает предпочтение классификации, основанной на физико-химических свойствах радикалов аминокислот. Тем самым ставится акцент на том, что для функционирования белковых молекул первостепенное значение имеют изложенные выше физико-химические свойства аминокислот, входящих в состав белка, а не спектр их химической реактивности.
По физико-химической классификации аминокислоты подразделяются на 4 группы, в зависимости от полярности или неполярности радикала и наличия в нем группироаки, диссоциирующей по типу кислоты или основания. Эта классификация приведена в таблице 1-1 вместе с формулами всех 20 аминокислот, их общепринятыми названиями и обозначениями, а также величинами р1 и данными о растворимости в воде.
Все типы связей, которые возникают между аминокислотами в ходе биогенеза белковой молекулы, можно разделить на две группы: ковалентные связи и нековалентные (слабые типы связей). К пераой из них относятся пептидная и дисульфидная связи. Ко второй - водородная связь, ионная связь и гидрофобное взаимодействие.
Окончание таблицы 1-1
- хорошо растворим при нейтрализации раствора до pH 7,0.
1.4. ТИПЫ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ АМИНОКИСЛОТАМИ В МОЛЕКУЛЕ БЕЛКА
ПЕПТИДНАЯ СВЯЗЬ
Рис. 1-6. Строение дипептида апанил-гпицина и продуктов присоединения к нему цистеина.
Пептидная (кислотоамидная) связь соединяет две аминокислоты — одинаковых или разных. Ее можно представить как результат выделения молекулы воды за счет карбоксильной группы одной аминокислоты и аминогруппы другой. В итоге углерод бывшей карбоксильной группы соединяется ковалентной связью с азотом бывшей аминогруппы другой аминокислоты. Образуемую молекулу обозначают как дипептид.
В качестве примера на рис. 1-8 представлено строение одного из дипептидов, которые могут быть получены при соединении аланина с глицином. Естественно, на одном конце дипептида остается свободной аминогруппа, на другом - карбоксильная группа. К любой из них можно аналогичным образом присоединить еще одну аминокислоту, и тогда появятся молекулы двух разных трипептидов (см. рис. 1-8).
Трипептид можно наращивать далее, получая последовательно тетрапептиды, пентапептиды, гексапептиды и вообще любые полипептиды. Следует, однако, подчеркнуть, что в живых системах наращивание идет в одном направлении — путем присоединения новой аминокислоты к карбоксильной группе предыдущей.
Как видно на рис. 1-8, названия пептидов составляются из названий аминокислот, начиная с той, у которой сохранена свободная а- аминогрупла. При этом в названиях всех аминокислот окончание изменяется на «-ил». Исключение составляет последняя по счету аминокислота, название которой не изменяется, так как ее карбоксильная группа остается свободной (не вовлеченной в образование пептидной связи).
Рис. 1-9. Строение гексапептида ввлил-лизил-лейцил-гистидил-аспарагил-тирозина [Затенением выделен остов («стержень») молекулы, абсолютно одинаковый у всех природных полипептидов. В представленном изображении все пептидные группы и а-углеродные атомы находятся в одной плоскости (в плоскости рисунка), а радикалы И попеременно либо выступают нед этой плоскостью (в данном примере - валин, лейцин и аспартат), либо расположены позади нее (лизин, гистидин и тирозин); водород при а-углеродных атомах направлен в сторону, противоположную направлению радикала I?]
Лишь в 50-е годы XX века были разработаны методы, которые позволяют устанавливать последовательность соединения аминокислот в любом полипептиде. Применение их к изучению самых разных белков, а также осуществленный тогда же прорыв в области биохимической генетики, — все это позволило окончательно и абсолютно однозначно установить, что любая белковая молекула всегда представляет собой прежде всего длинную поли- пептидную цепь, насчитывающую десятки, сотни, а иногда и тысячи аминокислотных остатков. Соответственно, молекулярная масса таких полипептидов может достигать десятков и даже сотен килодальтон.
Две определяющих закономерности лежат в основе структурных особенностей любого природного полипептида: неразветвленность полимерной цепи и ее гибкость.
Неразветвленность полипептидной цепи обусловлена тем, что в образовании пептидной связи аминокислоты участвуют только своим стандартным фрагментом, который, как уже отмечалось, одинаков у всех кодируемых аминокислот. Если же в составе радикала К имеется еще и «своя» карбоксильная или аминогруппа, то она никогда не участвует в построении природных полипептидных цепей. Эта закономерность гарантируется теми молекулярными механизмами, которые осуществляют биосинтез полипептидных цепей в клетке.
Для иллюстрации на рис. 1-9 приведено строение небольшой полипептидной цепи, насчитывающей всего 6 аминокислотных остатков. В их числе - остатки лизина и аспартата, в боковых радикалах которых содержатся соответственно аминогруппа и карбоксильная группа. Эти группы в принципе тоже способны формировать пептидные связи. Однако системы биосинтеза белка полностью исключают такую возможность. Значит, при написании формулы любого (поли)пептида аминокислотные остатки следует соединять только их стандартными фрагментами.
Итак, природные (поли)пептиды представляют собой линейную последовательность аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, прочно фиксирующими место (очередность) каждой аминокислоты в данной цепи. При этом на одном конце цепи имеется свободная а-аминогруппа, а на другом — свободная карбоксильная группа. Они обозначаются соответственно как ГЧ-конец и С-конец, а расположенные здесь аминокислоты - как ГЧ-концевая и С-концевая. Именно с ГЧ-концевой аминокислоты решили начинать отсчет последовательности (нумерацию) аминокислотных остатков в полипептидной цепи (много позже выяснилось, что биосинтез таких цепей дейст- аительно начинается с 1М-концевой аминокислоты и происходит путем наращивания С-конца).
Неразветвленность полипептидной цепи - не единственное следствие использования стандартного фрагмента аминокислот для ее построения. Не менее важно и то, что в результате возникает некий остов («стержень»), одинаковый у всех белковых молекул (на рис 1-9 он выделен затенением). Этот «стержень» представляет собой многократное повторение последовательности ...-Ы(Н)-С(Н)-С(0)-..., в которой группа -С(Н)~ является а-углеродным атомом соответствующего аминокислотного звена. Именно на этих группах «стержневой» части молекулы сидят как боковые веточки, радикалы 20 разных аминокислот, т.е., 20 вариантов боковой цепи.
Стандартность «стержня» открывает возможность использования единого механизма для синтеза любых полипептидов. Сопряжение его с системой отбора очередной аминокислоты для включения ее в состав полимера позволяет разнообразить чередование боковых цепей, т.е., обеспечивать специфику синтезируемого полипептида.
Таким образом, несмотря на структурную однотипность всех природных полипептидов, имеются неисчерпаемые возможности для построения самых разнообразных молекул. При этом разные полипептиды могут различаться, во-первых, общим числом боковых цепей, т.е., длиной полипептидной цепи (а, следовательно, и величиной молекулярной массы). Во-вторых, даже при одинаковой длине полипептидные цепи могут различаться соотношением разных боковых цепей (разных аминокислот). Наконец, даже при совпадении и величины молекулы, и соотношения разных аминокислот в ней, полипептиды могут различаться последовательностью чередования 20 разных аминокислотных остатков.
Легко сосчитать, что из двух разных аминокислот можно построить 4 различных дипептида. Аналогично, из трех аминокислот можно создать 27 разных трипептидов, из четырех — 256 тетрапептидов и т.д. Известен такой подсчет: при использовании всего лишь 12 аминокислот для построения полипептидов с молекулярной массой 34000 Да число теоретически возможных вариантов составит Ю300! Эту цифру трудно даже представить. Если взять только по одной молекуле каждого варианта, то совокупная масса их достигнет примерно Ю280 г, тогда как масса всей нашей планеты составляет «всего» 1027 г! Иными словами, даже этот масштаб слишком мал: чтобы построить по одной молекуле каждого из возможных вариантов, необходимое количество материала эквивалентно массе 10253 таких планет, как Земля!
Становится очевидным, что живая природа реализует лишь ничтожно малую долю из возможного разнообразия полипептидных цепей. Лишь некоторые, наиболее «удачные» последовательности отобраны и «отшлифованы» эволюцией в качестве пригодных для выполнения какой-нибудь конкретной функции (ферментативный катализ, мышечное сокращение, «захват» фотона и преобразование заключенной в нем энергии в иную форму и т.д.). Нередко природа использует удачно найденное сочетание конкретных аминокислот в качестве однотипного фрагмента при создании белковых молекул с совершенно различными биологическими функциями. Бывает и так, что некоторые конструкции повторяются (и неоднократно!) в пределах одной полипептидной цепи (их так и называют: «повторяющиеся последовательности» или, короче, «повторы»).
Гибкость полипептидной цепи проистекает из того, что простая («одинарная») ковалентная связь подобна оси, допускающей свободное вращение соединяемых ею фрагментов молекулы. Поскольку в «стержневой» части полипептида ковалентные связи направлены под углом друг к другу, вращение вокруг
одной из них изменяет направление дальнейшего хода «стержня», т.е., обеспечивает его изгиб. Накопление таких изгибов приводит к тому, что весь «стержень» может принимать причудливую форму, которая к тому же легко меняется. В этом и проявляется гибкость поли- пептидной цепи.
Есть, однако, определенные ограничения этой гибкости. Главное из них — сами пептидные связи. Они заметно короче простой ковалентной связи (например, такой, как связь ...-1Ч(Н)-С(Н)-.., в той же полипептидной цепи), но длиннее обычной двойной связи. Кроме того, и связь между кислородом и углеродом в пептидной группе не является чисто двойной: она заметно длиннее аналогичной связи в альдегидах или кетонах, т.е., несколько ближе к простой («одинарной») связи. Такой характер связи, промежуточный между простой и двойной, показывают пунктиром рядом с черточками, обозначающими простую связь (рис. 1-10, Б).
Частично двойной характер пептидной связи делает невозможным вращение вокруг нее как вокруг оси. Поэтому все 4 атома пептидной группы ...-С(0)-1Ч(Н)-... лежат в одной плоскости, т.е., обладают жесткой планарной (плоской) структурой. В той же плоскости лежат и оба а-углеродных атома, расположенные по обе стороны от пептидной связи. Однако их связи с пептидной группой (связи ...-1Ч(Н)-С(Н)-... и ...-С(Н)-С(0>...) относятся к числу простых («одинарных»), т.е., допускающих вращение вокруг себя как вокруг оси. Значит, в «стержне» полипептида две из каждых трех подряд связей допускают осевое вращение. При этом а-углеродный атом каждой аминокислоты, находясь на стыке соседних планарных структур, представляет собой как бы шарнир, вокруг которого примыкающие плоскости могут поворачиваться относительно друг друга.
Рис. 1-10. Две предельные мезомерные формы (А и В) пептидной связи и ве гибридная структура (Б); пептидная связь указана стрелкой.
Рис. 1-11. Структура тетрапептида: линейный вариант (А) и изгиб «стержня» (Б) вследствие осевого поворота по одной из связей ...С(Н)-С(0)...
Для иллюстрации на рис. 1-11 приведен тетрапептидный фрагмент, в котором жесткие планарные структуры пептидных групп выделены затенением. Здесь показано осевое вращение вокруг той связи, которая соединяет а-углеродный атом и карбонильный углерод во втором (с ГЧ-конца) аминокислотном звене. Можно видеть, что такой поворот ведет к изменению направления хода полипептидной цепи: из вытянутой в одну линию она стала несколько изогнутой в пространстве.
Поворот соседних планарных структур относительно друг друга обычно не беспределен: этому препятствует чрезмерное сближение аминокислотных радикалов К. Однако сравнительно небольшие повороты не только возможны, но и осуществляются в действительности. Если они разнонаправленны и чередуются без явной регулярности, то в целом ход полипептидной цепи в пространстве приобретает причудливый характер, создавая впечатление неупорядоченности, хаотичности («случайный клубок», «хаотичный клубок»). Если же в каждом звене поворот осуществляется в одну и ту же сторону, то становится возможной спиралеобразная форма довольно протяженных участков полипептидной цепи. В более коротких участках накопление небольших поворотов плоскости каждой пептидной группы относительно предшествующей планарной структуры может привести к такому перегибу цепи, в результате которого она меняет свое направление на противоположное. В частности, стандартная группа одного аминокислотного фрагмента может сблизиться с аналогичной группой четвертого от нее (по ходу цепи) аминокислотного остатка, как это изображено (в проекции на плоскость) на рис. 1-12. Между сближенными группами >С=0 и Н-1Ч< легко образуются водородные связи (см. раздел 1.4.3), которые, появившись, обеспечивают стабилизацию возникшего изгиба полипептидной цепи в обратном направлении. Такой способ изменения хода полипептидной цепи на 180°, обнаруженный при изучении строения белков, получил название «(3-поворот» (полипептидной цепи); по внешнему сходству его сравнивают со шпилькой для волос.
Таким образом, закономерность, обусловленная частично двойным характером пептидной связи, делает структуру полипептидной цепи полужесткой, позволяет «лепить» из нее разные «фигуры». Эта полужесткость обеспечивает возможность многообразия вариантов пространственной организации белковой молекулы. Более того, она обусловливает и достаточную стабильность сложившейся структуры, и, вместе с тем, ее некоторую подвижность в определенных рамках.
Рис. 1-12. «(3-Поворот» полипептидной цепи («шпилька») в проекции на плоскость.
Аланил-глицип-пролил-серин
Рис. 1-13. Нарушение регулярности «стержня» полипептидной цепи в зоне пролина («пролиновый излом»).
Рассмотренная регулярность структуры «стержня» полипептидной цепи существенно искажается в тех местах молекулы, где содержится остаток пролина. Это объясняется тем, что пролин, строго говоря, является не аминокислотой, а иминокислотой, ибо в его общей части содержится иминоазот. Иными словами, в молекуле пролина присущий аминокислотам радикал И своим «дальним» концом замкнут на атом азота, который в обычных аминокислотах входит в состав а-аминогруппы. Из-за этого невозможно осевое вращение вокруг связи ... >N-0(11)-... (указана стрелкой на рис.
13, Б). Следовательно, нарушается подвижность «стержня» полипептидной цепи в этом месте. Кроме того, жесткость циклического радикала пролина ведет к искажению обычной регулярности структуры «стержня», вызывая его изгиб с некоторым осевым поворотом (см. рис. 1-13). Особым образом изменяя направление полипептидной цепи, этот жестко фиксированный изгиб получил название «пролиновый излом».
ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ
Рис.1-14. Образование и разрыв дисульфидной связи (соответственно окислительный и восстановительный процессы).
Одна из 20 аминокислот — цистеин — имеет в составе радикала К сульфгидрильную группу (-8Н). Если две такие группы окажутся достаточно сближенными в пространстве, то они могут провзаимодействовать между собой с выделением двух атомов водорода и образованием дисульфидной связи ...-8-8-... (рис. 1-14).
Дисульфидная связь может возникнуть за счет двух остатков цистеина, расположенных в разных местах одной и той же полипептидной цепи, но сближенных за счет изгибов этой цепи. Такую дисульфидную связь называют внутрицепочечной. Но она может образоваться и за счет остатков цистеина, принадлежащих разным полипептидам. Тогда ее называют межцепочечной. Нередко дисульфидную связь обозначают термином «дисульфидный мостик», подчеркивая тот факт, что она соединяет разные полипептиды или разные участки одной полипептидной цепи, причем, не соседние, а достаточно удаленные по ходу этой цепи.
Дисульфидный мостик - это обычная ковалентная связь, т.е., достаточно прочное химическое соединение соответствующих фрагментов полипептидной цепи (или двух цепей). Однако биологически она менее устойчива, чем пептидная связь. Это объясняется высокой интенсивностью окислительно-восстановительных процессов в клетке. От редокс-потенциала микросреды сильно зависит как возникновение дисульфидной связи (окисление групп -вН), так и ее расщепление (восстановление мостиков -Б-в-).
