Обратимость осаждения достигается применением «мягких» воздействий. Обычно используют водоотнимающие средства, - вещества с выраженной гидрофильносгью, способные «притязать» на воду гидратной оболочки. Если это осуществлять в среде, не очень далекой от р1 осаждаемого белка, то удается устранить оба фактора стабилизации коллоидного состояния и получить осадок, в котором белок сохраняет свои нативные свойства. В качестве водоотнимающих средств можно применять, например, этанол или ацетон. Осаждающее действие они проявляют в концентрациях, достаточных для их растворения не только в свободной воде, но и в воде гидратных оболочек. Образующийся осадок белка следует быстро отделить от надосадочной жидкости. Это необходимо для предотвращения денатурирующего действия органических растворителей: оно развивается несколько медленнее, чем водоотнимающее, и обусловлено их внедрением в гидрофобные структуры белковых молекул.
Указанного недостатка органических растворителей лишены способы высаливания белка. Так называют осаждение его под действием высоких концентраций нейтральных солей щелочных или щелочноземельных металлов, - таких как ЫаС1, N02804 или подобный им (ЫИ4)2804. Они очень хорошо растворимы в воде, но при этом не влияют существенно на pH среды и, следовательно, на заряд белковых молекул. В коллоидной системе добавляемые соли растворяются прежде всего в свободной воде. Когда концентрация соли в ней становится достаточно высокой, между белком и солью начинается конкуренция за обладание водой гидратных оболочек. Исход этого состязания зависит, с одной стороны, от степени гидро- фильности осаждаемого белка и, с другой стороны, от степени гидрофильности и от концентрации используемой соли. Чем меньше сродство данной соли к воде, тем более высокая концентрация ее необходима для осаждения белка. Например, осаждение глобулинов сыворотки крови происходит при полунасыщении раствора сульфатом аммония, но лишь при полном насыщении хлоридом натрия. Альбумины, составляющие (по массе) более половины всех белков сыворотки, осаждаются лишь при полном насыщении раствора сульфатом аммония (и не осаждаются хлоридом натрия). Это свидетельствует об очень высокой гидрофильности альбуминов.
Убедиться в обратимости высаливания легко. Достаточно уменьшить концентрацию соли в растворе. Этого можно достичь, например, путем диализа или добавлением воды. Осадок белка при этом вновь перейдет в раствор. А главное - белок сохранит свои нативные свойства, в том числе присущую ему биологическую активность (ферментативную, гормональную и т.д.).
Важная особенность высаливания заключается в том, что по достижении критичной концентрации соли в осадок переходят «вдруг» сразу все молекулы соответствующего белка.
Если в растворе содержатся и другие белки (более гидрофильные), то они остаются в коллоидном состоянии. Для их осаждения необходимо повысить концентрацию соли в растворе. Можно осуществить это после отделения предыдущего осадка (например, центрифугированием). Отсюда становится очевидной возможность дробного осаждения белков. Имеется в виду осаждение и отделение сначала наименее гидрофильных белков, затем все более и более гидрофильных. Так можно разделить сложную смесь белков на ряд порций (фракций). Каждая из них представляет собой обычно группу индивидуальных белков, сходных по выраженности гидрофильных свойств. Для дальнейшего разделения белков любой из фракций можно использовать не гидрофильность, а какое-либо из других физико-химических свойств макромолекул.
Одно из ранних применений метода высаливания в медицине - очистка лечебных сывороток (антисывороток). Получают антисыворотку путем иммунизации животных определенным инфекционным агентом (например, дифтерийным токсином). Полученная сыворотка крови иммунизированного животного содержит антитела к этому агенту (антигену). Парентеральное введение ее человеку оказывает лечебный эффект при соответствующем заболевании (в приведенном примере - при дифтерии). Однако лечебная сыворотка помимо антител содержит большое количество других белков. В ответ на эти чужеродные белки у человека развиваются иммунные реакции, которые могут обесценить лечебный эффект антисыворотки. Поскольку все антитела содержатся во фракции глобулинов, то отделение их путем высаливания хотя бы от альбуминов дает возможность наиболее простого получения очищенной антисыворотки. Позднее было установлено, что глобулины - это тоже смесь разнородных белков, а антитела сосредоточены только в сравнительно небольшой фракции у- глобулинов. Были разработаны более сложные приемы очистки, которые позволяют получать именно эту фракцию, наиболее безопасную в плане побочных эффектов.
Высаливание пригодно не только для разделения белковых смесей. Его применяют и для осаждения индивидуальных белков, предварительно отделенных от всех других. Определенный режим высаливания очищенного белка позволяет осадить его из раствора в кристаллической форме, которая свидетельствует
о максимальной степени очистки. К тому же, именно кристаллы необходимы для проведения рентгеноструктурного анализа, открывшего возможность изучения пространственной организации белковой молекулы, включая оценку количественных параметров вторичной и более высоких структур.
Достижения техники позволили разработать еще один способ обратимого осаждения белков. Он заключается в вымораживании белковых растворов в условиях вакуума. При этом осуществляется замораживание раствора, а затем сухое испарение (возгонка) льда. По существу, это уже не осаждение белка, а его высушивание («лиофильная сушка»). Многие белки полностью сохраняют при этом свои нативные свойства. Растворением сухого порошка можно восстановить его исходное коллоидное состояние. В сухом виде препараты белка сохраняются гораздо дольше (особенно, на холоде и при соблюдении стерильности). Из-за хорошей растворимости в воде их часто называют лиофили- зированными препаратами. В таком виде выпускаются теперь различные белковые вещества, применяемые в медицине (гормоны белковой природы; многие ферментные препараты; фибриноген и другие белки плазмы крови).