ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА
Влияние концентрации субстрата можно исследовать путем измерения скоростей реакции в серии пробирок, содержащих одинаковую порцию фермента, но возрастающие количества субстрата. Естественно, с увеличением концентрации субстрата скорость реакции становится все выше. Однако эта зависимость не является линейной. Соответствующий график (рис. 4-11) представляет собой часть равнобочной гиперболы и описывается уравнением Ми- хаэлиса-Ментен:
где:
[8] - концентрация субстрата в отдельном эксперименте;
V - скорость реакции при данной конкретной концентрации субстрата;
Ущах и Км - главные кинетические константы, характеризующие фермент в его реакции с данным субстратом.
График в координатах Михаэлиса-Ментен представляет собой типичную кривую насыщения (в данном случае - фермента субстратом): с увеличением значений абсциссы значения ординаты постепенно приближаются к некоторому пределу (насыщению).
Р. мкмоль/мин
Рис. 4-11. Влияние концентрации субстрата ([Б]) на скорость ферментативной раакции («>)
[черными кружочками показаны результаты измерений в эксперименте т zitro].
Утах - это то предельное значение, к которому стремится скорость реакции при бесконечно большом увеличении концентрации субстрата (см. рис. 4-11). Этот кинетический параметр характеризует максимально возможную работоспособность данного фермента и называется максимальной скоростью данной ферментативной реакции.
Как уже отмечалось, скорость ферментативной реакции лимитируется, как правило, константой скорости ее этапа II, т.е., величиной к+2- Следовательно, УтаХ характеризует собой эффективность именно этого этапа (чаще всего). Вместе с тем, Ущах - это не то же самое, что к+2 . Последняя отражает скорость реакции в расчете на стандартные условия (включая требование 1 М концентрации каждого из участников реакции). Величина же У№ - это максимально возможная скорость, оцениваемая в опытах с каким-то определенным количеством фермента Иными словами, она пропорциональна концентрации фермента:
Экспериментально найденная величина Ушах может быть пересчитана на единицу количества фермента, и тогда она представляет собой его максимальную активность. Она может быть рассчитана на единицу количества исследуемого объекта, - например, на 1 мл плазмы крови, на 1 г анализируемой ткани, на I клетку. Тогда Утах характеризует максимально возможную скорость данной ферментативной реакции в соответствующем объеме биологического объекта (1 мл, 1 г, одиночная клетка). Если при этом скорость представлена в мкмоль/мин, то получаем выраженное в юнитах содержание данного фермента в проанализированной биопробе, т.е., его концентрацию в ней.
Другая из главнейших кинетических характеристик любого фермента - это константа Михаэлиса (Км).
Численно Км равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимально возможной (см. рис. 4-11). Это легко проверить, подставив в уравнение [4-1] значение и = 0,5 Ущах Физический смысл Км заключается в том, что она представляет собой константу равновесия между реакцией образования фермент- субстратного комплекса Е • 8 и двумя реакциями, ведущими к его распаду (см. рис. 4-9)
Как отмечалось выше, к+2 обычно много меньше, чем к-н (или другие частные константы скорости). Следовательно, величина Км, как правило, очень близка отношению к_]/к+|. Это отношение является константой равновесия этапа I ферментативного катализа и называется субстратной константой (К^). Ее величина характеризует положение равновесия обратимой реакции, составляющей этот этап (см. рис. 4-9):
Чем больше величина к+( преобладает над значением к_1 , тем больше равновесие этапа I сдвинуто вправо, в сторону образования комплекса Е • Б. Значит, чем меньше величина субстратной константы, тем более значительная доля фермента пребывает в составе фермент- су бстратного комплекса, или, как часто говорят, - тем выше сродство между данными ферментом и субстратом. В свою очередь, чем большая часть фермента связана с субстратом, тем выше концентрация комплекса Е - Б и, следовательно, быстрее протекает самый трудный этап И, а, значит, и вся ферментативная реакция в целом.
Верно и обратное: если субстратная константа велика, то это свидетельствует, что комплексы Е • Б, образующиеся на этапе 1, гораздо легче распадаются на исходный субстрат и свободный фермент, чем вступают в химические преобразования, знаменующие этап II. Это и означает низкое сродство фермента к данному субстрату: молекулы фермента предпочитают «уклоняться» от работы в составе комплекса Е • S, и поэтому этап II и реакция в целом осуществляются сравнительно медленно.
В стационарном режиме протекания ферментативной реакции очень быстро устанавливается постоянная концентрация комплекса Е * S. Это обеспечивается высокой скоростью достижения равновесия на этапе I при гораздо более медлительном процессе химических преобразований на этапе II. Поэтому величины Км и Ks обычно практически совпадают или очень близки, что позволяет сделать следующие заключения.
Чем ниже величина Км, тем меньшие концентрации субстрата достаточны для эффективного протекания реакции, в том числе
для достижения максимально возможной скорости реакции (V,^).
И еще: чем меньшие концентрации субстрата «замечает» (и «перерабатывает») фермент, тем более высоким является его сродство к данному субстрату.
Таким образом, Км и - это наиболее важные кинетические коистанты. Они дают количественную оценку таким фундаментальным качествам фермента, как его сродство к данному субстрату и максимально возможная работоспособность (соответственно - эффективность этапов I и II ферментативного катализа).
Сопоставление значения Км с реальной концентрацией субстрата в клетке открывает уникальную возможность: по параметрам, измеренным in vitro, судить о том, в какой степени фермент реализует свою работоспособность в реальных условиях in vivo.
